基因工程技術(shù)簡(jiǎn)要介紹

1、基因工程技術(shù)簡(jiǎn)要介紹第1頁(yè)，共22頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)3分，星期二基因工程的操作流程第2頁(yè)，共22頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)3分，星期二 將外源基因（又稱目的基因，是一段 DNA 片斷）組合到載體 DNA 分子中去，再把它轉(zhuǎn)到受體細(xì)胞（亦稱寄主細(xì)胞）中去，使外源基因在寄主細(xì)胞中增值和表達(dá)，從而得到期望的由這個(gè)外源基因所編碼的蛋白質(zhì)。第3頁(yè)，共22頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)3分，星期二 所以，基因工程的操作包含以下步驟： 獲得目的基因 構(gòu)造重組 DNA 分子 轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染 表達(dá) 蛋白質(zhì)產(chǎn)物的分離純化第4頁(yè)，共22頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)3分，星期二 到哪里去

2、找目的基因？ 從組織細(xì)胞中可以分離得到人/小鼠的全套基因，稱為基因文庫(kù)。文庫(kù)中基因總數(shù) 就人來(lái)說(shuō)約有 3 萬(wàn)個(gè)基因。如何從中把需要的基因找出來(lái)？采取“釣”的辦法。這個(gè)辦法通常稱為印跡法。（1）獲得目的基因第5頁(yè)，共22頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)3分，星期二印 跡 法內(nèi)切酶切開DNA電泳印跡轉(zhuǎn)移放射性探針雜交膠片顯影第6頁(yè)，共22頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)3分，星期二印跡法的主要步驟：（1）基因文庫(kù) DNA 用限制性內(nèi)切 酶處理。（2）DNA 片斷混合物通過(guò)電泳分離。（3）電泳后，通過(guò)印跡技術(shù)轉(zhuǎn)到酯酰 纖維薄膜上，以便操作。（4）用已知小片斷DNA 作為探針， 互補(bǔ)結(jié)合需要找的基

3、因片斷。（5）探針DNA 片斷已用放射性元素 標(biāo)記，使膠片感光后可看出。第7頁(yè)，共22頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)3分，星期二 印跡法的關(guān)鍵是“分子雜交”，利用堿基配對(duì)的原則，用一段小的已知的 DNA 片斷去尋找（“釣”）大的未知的基因片斷。 探針 DNA 片斷從何而來(lái)？ 根據(jù)目的蛋白的氨基酸序列，只要其中 N端 15-20 個(gè)氨基酸序列，按三聯(lián)密碼轉(zhuǎn)為 40-60 核苷酸序列，人工合成，即為探針 DNA 片斷。第8頁(yè)，共22頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)3分，星期二（2）目的基因的擴(kuò)增 用上面的方法“釣”出的目的基因，數(shù)量極少，所以，接下來(lái)必須經(jīng)過(guò)擴(kuò)增，亦稱為基因克隆。獲得相當(dāng)數(shù)量

4、的目的基因后，才能繼續(xù)下一步操作。第9頁(yè)，共22頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)3分，星期二（3）PCR把尋找目的基因和擴(kuò)增目的基因兩步操作并成一步。 PCR法，又稱多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是近年來(lái)開發(fā)出來(lái)的基因工程新技術(shù)，它的最大優(yōu)點(diǎn)是把目的基因的尋找和擴(kuò)增，放在一個(gè)步驟里完成。第10頁(yè)，共22頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)3分，星期二P C R操作流程90 0 C50 0 C70 0 C返回第11頁(yè)，共22頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)3分，星期二PCR 反應(yīng)分三步完成：第一步 90 0C 高溫下，使混合物的DNA 片斷因變性而成單鏈。第二步 50 0C 溫度下，引物 DNA結(jié)合在適于配

5、對(duì)的DNA片斷上。第三步 70 0C 溫度下，由合成酶（ DNA 高溫聚合酶）催化，從引物開始合成目的基因 DNA。第12頁(yè)，共22頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)3分，星期二 PCR 的三個(gè)步驟為一次循環(huán)，約需510 分鐘。每經(jīng)一次循環(huán)，所找到的目的基因擴(kuò)充一倍。經(jīng)過(guò) 20 次循環(huán)，即可擴(kuò)增 106 倍，總共只需幾個(gè)小時(shí)。第13頁(yè)，共22頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)3分，星期二（4）構(gòu)造重組 DNA 分子首先要有載體。載體有好幾種，常用的有：質(zhì)粒環(huán)狀雙鏈小分子DNA，適于做小片斷基因的載體。噬菌體DNA線狀雙鏈DNA，適于做大片斷基因的載體。第14頁(yè)，共22頁(yè)，2022年，5月20日

6、，12點(diǎn)3分，星期二返回用質(zhì)粒構(gòu)建重組DNA分子第15頁(yè)，共22頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)3分，星期二返回用噬菌體DNA構(gòu)建重組DNA分子第16頁(yè)，共22頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)3分，星期二 其次要把目的基因“裝”到載體中去?！鞍惭b”的過(guò)程，需要好幾種工具酶，其中關(guān)鍵的酶叫限制性內(nèi)切酶。 此酶識(shí)別一定堿基序列，有的還可切出“粘性”末端，使得目的基因和載體的連接非常容易。圖一圖二第17頁(yè)，共22頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)3分，星期二下圖限制性內(nèi)切酶識(shí)別特定的堿基序列第18頁(yè)，共22頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)3分，星期二返回限制性內(nèi)切酶造成粘性末端有利于重組DNA 分子的構(gòu)建第19頁(yè)，共22頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)3分，星期二（5）轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染表達(dá)蛋白質(zhì)分離 把構(gòu)造好的重組 DNA 分子送進(jìn)寄主細(xì)胞，亦需要適當(dāng)?shù)募夹g(shù)方法。若受體細(xì)胞是細(xì)菌，通常稱轉(zhuǎn)化；若受體細(xì)胞是 動(dòng)/植 物細(xì)胞，通常稱轉(zhuǎn)染。第20頁(yè)，共22頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)3分，星期二 重組 DNA 分子進(jìn)入寄主細(xì)胞后，其中的目的基因能否表達(dá)，表達(dá)效率高低，還有很大差別。表達(dá)通常是指目的基因編碼的蛋白質(zhì)合成?；蚬こ?/p>