細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù)

1、細(xì)菌培育檢測(cè)技術(shù)節(jié)概述 培育出來(lái)才能對(duì)它進(jìn)展?fàn)庌q和鑒定學(xué)問(wèn)點(diǎn)導(dǎo)航一.培育基的種類培育基culture medium是細(xì)菌生長(zhǎng)生殖所需要的各種養(yǎng)分物質(zhì)的人工制品。適宜的培育基能使細(xì)菌在體外快速生長(zhǎng)生殖，便于對(duì)細(xì)菌進(jìn)展分別和鑒別?？煞譃楦着嘤?、養(yǎng)分培育基、 選擇培育基、鑒別培育基、厭氧菌用培育基和特別培育基。一根底培育基只含有細(xì)菌生長(zhǎng)所需的最根本養(yǎng)分成分，應(yīng)用最廣泛，為制備多種培育基的根底，常見的有肉湯培育基、瓊脂培育基。二養(yǎng)分培育基在根底培育基中參加葡萄糖、血液、血清、腹水或酵母浸膏等有機(jī)物，可供養(yǎng)分要求較高的細(xì)菌生長(zhǎng)需要或增菌用。如結(jié)核分枝桿菌培育基中添加雞蛋、馬鈴薯、甘油等。三選擇培育基

2、的 別。選擇培育基多為固體平板，用于從標(biāo)本中分別某些特定的細(xì)菌。四鑒別培育基鑒別和鑒定細(xì)菌。五厭氧菌用培育基 降低培育基中氧化復(fù)原電勢(shì)，并應(yīng)與外界空氣隔絕，使培育根本身為無(wú)氧的環(huán)境。六特別培育基為某些需要在特別條件下才能生長(zhǎng)的細(xì)菌培育 基、改進(jìn) Kagan氏培育基等。二.培育基的制備pH、過(guò)濾、分裝、滅菌及檢定和保存。三.細(xì)菌檢驗(yàn)室的留意事項(xiàng)及無(wú)菌技術(shù)事項(xiàng)如下：細(xì)菌的培育應(yīng)在接種罩或無(wú)菌室內(nèi)進(jìn)展。有條件的試驗(yàn)室可在超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)展。用接種環(huán)分別和移種細(xì)菌時(shí)，用前用后均需滅菌處理。一般承受火焰滅菌法。從培育瓶或試管培育物中取標(biāo)本或移種時(shí)，在翻開瓶口、管口或關(guān)閉前，均要在火焰上 通過(guò)23次。切不行

3、將含菌材料污染臺(tái)面和其他物體。3來(lái)蘇5石炭酸處理污染臺(tái)面或地面，至少浸泡 30 分種。工作完畢后，用紫外光燈照耀 30 分鐘，或用 3來(lái)蘇擦拭臺(tái)面，并清洗雙手。四、接種環(huán)和接種針使用接種環(huán)和接種針由三局部組成，即環(huán)針局部、金屬柄局部和絕熱柄局部。接種環(huán)和接種針通常選用電熱鎳24mm，環(huán)和針的長(zhǎng)度為 4050mm。接種環(huán)針使用前后均應(yīng)進(jìn)展滅菌處理，將接種環(huán)針末端直立火焰中，燒紅鎳絲局部， 針金屬柄旋轉(zhuǎn)通過(guò)火焰 3 針完畢后馬上將染菌的鎳絲局部于復(fù)原焰內(nèi)焰中加熱，烤干環(huán)針端附著的細(xì)菌或標(biāo)本，以免 環(huán)針上剩余的細(xì)菌或標(biāo)本因突受高熱，爆烈四濺，而污染環(huán)境和導(dǎo)致傳染危急。然后再移于氧 化焰外焰中燒紅滅菌

4、，最終將金屬柄局部往復(fù)在火焰中通過(guò)3次。用完后的接種環(huán)針馬上擱置于架上，切勿順手棄置，以免灼焦臺(tái)面或其他物件。 五、接種操作區(qū)進(jìn)行，此外細(xì)菌學(xué)試驗(yàn)室所必需的設(shè)備還包括無(wú)菌工作臺(tái)、生物安全柜和生物安全試驗(yàn)室。一接種罩 接種罩的式樣很多，可用木框和玻璃制成，亦有用有機(jī)玻璃制成。接種罩在用前先以 3石炭酸或來(lái)蘇輕拭，內(nèi)需裝有紫外線殺菌燈，用前可先行照耀，以保證罩內(nèi)無(wú)塵埃和細(xì)菌。操作完畢后，應(yīng)馬上清理內(nèi)部，并作罩內(nèi)消毒處理。二無(wú)菌工作臺(tái) 又稱超凈工作臺(tái)rnh，目前多承受垂直層流的氣流形 過(guò)濾，從出風(fēng)面吹出的干凈氣流，以肯定的和均勻的斷面風(fēng)速通過(guò)工作區(qū)時(shí)，將塵埃顆粒和微生物 顆粒帶走，從而形成無(wú)塵無(wú)菌的

5、工作環(huán)境。使用時(shí)應(yīng)提前 50 分鐘翻開紫外線殺菌燈，30 分鐘后關(guān)閉并啟動(dòng)送風(fēng)機(jī)。凈化區(qū)內(nèi)嚴(yán)禁存放不必要的物件，以保持干凈氣流型不受干擾。三無(wú)菌室 無(wú)菌室又稱干凈室n m，是在試驗(yàn)室內(nèi)部安裝的用于無(wú)菌操作的小室。室內(nèi)應(yīng)有空氣過(guò)濾裝置、紫外線殺菌燈等。四生物安全柜 biological safety cabinet，BSC目前微生物試驗(yàn)中多承受生物安全柜，是為操作原代培育物、菌毒株以及診斷性標(biāo)本等具有感染性的試驗(yàn)材料時(shí)，用來(lái)保護(hù)操 作 濺出物而設(shè)計(jì)的負(fù)壓過(guò)濾排風(fēng)柜。五生物安全試驗(yàn)室yy，簡(jiǎn)稱L試驗(yàn)室”，是指通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的實(shí) 驗(yàn)安 全設(shè)備和二級(jí)防護(hù)屏障設(shè)施構(gòu)成，試驗(yàn)室生物安全防護(hù)的安全設(shè)備和設(shè)施的不同

6、組合，構(gòu)成 了四級(jí)生物安全防護(hù)水平，一級(jí)為最低。六、接種法依據(jù)待檢標(biāo)本的性質(zhì)，培育目的及所用培育基的種類，承受不同的接種方法。常用的有平板劃線分別培育法、斜面接種法、液體接種法和穿刺接種法。一平板劃線分別培育法自形成菌落，以便依據(jù)菌落形態(tài)及特征，選擇單個(gè)菌落，經(jīng)過(guò)移種而獲得純種細(xì)菌純培育。分別細(xì)菌最常用的為平板劃線分別法。將接種環(huán)火焰滅菌，待冷卻后取標(biāo)本或混合菌液。用左手持起平板，使平皿蓋向上放于臺(tái)面上或翻開平皿蓋。左手斜持45角平板，右手持已取材的接種環(huán)，在酒精燈上方 56cm 處作連續(xù)劃線法分離細(xì)菌。劃線時(shí)，接種環(huán)與平板呈3040角，輕輕接觸平板，以腕力平行滑動(dòng)接種環(huán)。應(yīng)避開 將瓊脂劃破。

7、先在平板上 l5 處輕輕涂布，然后即可左右來(lái)回以作連續(xù)劃線接種，線與線間留有適當(dāng)距離，做到線密而不重復(fù)，將整個(gè)平板外表布滿劃線。假設(shè)菌量較大可承受分區(qū)劃線法?？蓪⑵矫蠓譃榧僭O(shè)干個(gè)區(qū)5 個(gè)區(qū)l區(qū)輕輕涂布，再在 2，3區(qū)劃線。每劃完一個(gè)區(qū)域，均將接種環(huán)滅菌一次，冷后再化下一個(gè)區(qū)域。每一區(qū)域的劃線均接觸上一區(qū)域的接種線 2見圖1。圖20-1細(xì)菌分別接種法劃線完畢，蓋好皿蓋，做好標(biāo)記將平皿倒置，置 37培育 1824 小時(shí)后觀看結(jié)果。二斜面接種法菌的某些培育特性。取菌種管置左手食指、中指、無(wú)名指之間，拇指壓住管底部上側(cè)面?；鹧鏈缇臃N環(huán)。以右手小指與手掌拔取棉塞如同時(shí)持有兩管，可用小指與無(wú)名指拔取另一

8、棉塞，將管口l2次。將已滅菌的接種環(huán)伸入菌種管中，從斜面上取少許菌，快速伸入待接種的培育基管中， 在斜37孵箱中培育1824 小時(shí)即可觀看結(jié)果。三液體接種法應(yīng) 持好菌種管及培育基管。滅菌接種環(huán)，由菌種管取菌，伸入培育基管中，在接近液面的管壁上方輕輕研磨，并沾 取少許培育基液體調(diào)和，使接種物充分混合于培育基的液體中。液體培育一般以 1824 小時(shí)觀看生長(zhǎng)特征為好。四穿刺接種法試管內(nèi)半固體培育基承受此法接種，多用于保存菌種、觀看動(dòng)力及做厭氧培育等。亦可用于觀察細(xì)菌的某些生化反響。持好菌種管和培育基管。以滅菌接種針從菌種管取菌。接種針直刺入培育基的中心半固體或一般瓊脂高層直達(dá)管底部深入培育基 3/4 處或沿管壁刺入醋酸鉛高層，接種后接種針應(yīng)沿原路退出。經(jīng)培育后即可觀看結(jié)果。沿穿刺線生長(zhǎng)，線外的培育基清亮者表示細(xì)菌無(wú)動(dòng)力；穿刺線 模糊不清，或沿穿刺線向外集中生長(zhǎng)，或整個(gè)培育基混濁者表示細(xì)菌有動(dòng)力。 七、培育法和厭氧培育法。一一般培育法接種好的置 37孵箱中培育 1824 如結(jié)核分技桿菌需37 天甚至 l 個(gè)月才能生長(zhǎng)。二二氧化碳培育法某些細(xì)菌的培育，需要 510%二氧化碳環(huán)境中培育才能生長(zhǎng)良好?？沙惺芏趸挤跸?，它能 點(diǎn)燃蠟燭放在缸中，加蓋涂以凡士林密閉。因燃燒而產(chǎn)生