熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）

1、什么是熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescenceresonance energy transfer，F(xiàn)RET）技術(shù)？熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）作為一種高效的光學(xué)分子尺，在生物大分子相互作用、免疫分析、核酸檢測(cè)等方面有廣泛的應(yīng)用。在分子生物學(xué)領(lǐng)域，該技術(shù)可用于研究活細(xì)胞生理?xiàng)l件下研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間相互作用。蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間相互作用在整個(gè)細(xì)胞生命過(guò)程中占有重要地位，由于細(xì)胞內(nèi)各種組分極其復(fù)雜，因此一些傳統(tǒng)研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間相互作用的方法如酵母雙雜交、免疫沉淀等可能會(huì)丟失某些重要的信息，無(wú)法正確地反映在當(dāng)時(shí)活細(xì)胞生理

2、條件下蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間相互作用的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程。FRET 技術(shù)是近來(lái)發(fā)展的一項(xiàng)新技術(shù)，為在活細(xì)胞生理?xiàng)l件下對(duì)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間相互作用進(jìn)行實(shí)時(shí)的動(dòng)態(tài)研究提供了便利。一、FRET 技術(shù)基本原理熒光共振能量轉(zhuǎn)移是指兩個(gè)熒光發(fā)色基團(tuán)在足夠靠近時(shí)，當(dāng)供體分子吸收一定頻率的光子后被激發(fā)到更高的電子能態(tài)，在該電子回到基態(tài)前，通過(guò)偶極子相互作用，實(shí)現(xiàn)了能量向鄰近的受體分子轉(zhuǎn)移（即發(fā)生能量共振轉(zhuǎn)移）。FRET 是一種非輻射能量躍遷，通過(guò)分子間的電偶極相互作用，將供體激發(fā)態(tài)能量轉(zhuǎn)移到受體激發(fā)態(tài)的過(guò)程，使供體熒光強(qiáng)度降低，而受體可以發(fā)射更強(qiáng)于本身的特征熒光（敏化熒光），也可以不發(fā)熒光（熒光猝滅），同時(shí)也伴隨著熒光壽命

3、的相應(yīng)縮短或延長(zhǎng)。能量轉(zhuǎn)移的效率和供體的發(fā)射光譜與受體的吸收光譜的重疊程度、供體與受體的躍遷偶極的相對(duì)取向、供體與受體之間的距離等因素有關(guān)。作為供體的發(fā)射光譜與受體的激發(fā)光譜要重疊。人們已經(jīng)利用生物體自身的熒光或者將有機(jī)熒光染料標(biāo)記到所研究的對(duì)象上，成功地應(yīng)用于核酸檢測(cè)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能分析、免疫分析及細(xì)胞器結(jié)構(gòu)功能檢測(cè)等諸多方面。（傳統(tǒng)有機(jī)熒光染料吸收光譜窄，發(fā)射光譜常常伴有拖尾，這樣會(huì)影響供體發(fā)射光譜與受體吸收光譜的重疊程度，而且供、受體發(fā)射光譜產(chǎn)生相互干擾。最新的一些報(bào)道將發(fā)光量子點(diǎn)用于共振能量轉(zhuǎn)移研究,克服了有機(jī)熒光染料的不足之處。相對(duì)于傳統(tǒng)有機(jī)熒光染料分子，量子點(diǎn)的發(fā)射光譜很窄而且不

4、拖尾，減少了供體與受體發(fā)射光譜的重疊，避免了相互間的干擾；由于量子點(diǎn)具有較寬的光譜激發(fā)范圍，當(dāng)它作為能量供體時(shí)，可以更自由地選擇激發(fā)波長(zhǎng)，可以最大限度地避免對(duì)能量受體的直接激發(fā)；通過(guò)改變量子點(diǎn)的組成或尺寸，可以使其發(fā)射可見(jiàn)光區(qū)任一波長(zhǎng)的光，也就是說(shuō)它可以為吸收光譜在可見(jiàn)區(qū)的任一生色團(tuán)作能量供體，并且保證了供體發(fā)射波長(zhǎng)與受體吸收波長(zhǎng)的良好重疊，增加了共振能量轉(zhuǎn)移效率。）以 GFP 的兩個(gè)突變體CFPcyan fluorescent proteinYFP（yellow fluorescent protein）為例簡(jiǎn)要說(shuō)明其原理：CFP 的發(fā)射光譜與 YFP的吸收光譜有相當(dāng)?shù)闹丿B，當(dāng)它們足夠接近時(shí)，

5、用CFP 的吸收波長(zhǎng)激發(fā)，CFP 的發(fā)色基團(tuán)將會(huì)把能量高效率地共振轉(zhuǎn)移至 YFP的發(fā)色基團(tuán)上，所以 CFP 的發(fā)射熒光將減弱或消失，主要發(fā)射將是YFP的熒光。兩個(gè)發(fā)色基團(tuán)之間的能量轉(zhuǎn)換效率與它們之間的空間距離的 6 如要研究?jī)煞N蛋白質(zhì) a 和b 間的相互作用，可以根據(jù)FRET 原理構(gòu)建融合蛋白，這種融合蛋白由三部分組成：CFP（cyan fluorescent protein bYFP（yellow fluorescent protein用 CFP 吸收波長(zhǎng)433 nm 作為激發(fā)波長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)靈巧設(shè)計(jì)，使當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)a與 b 沒(méi)有發(fā)生相互作用時(shí)，CFP 與 YFP相距很遠(yuǎn)不能發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，因而

6、檢測(cè)到的是 CFP 的發(fā)射波長(zhǎng)為 476 nm 的熒光；但當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì) a與 b 發(fā)生相互作用時(shí)，由于蛋白質(zhì)b 受蛋白質(zhì)a 作用而發(fā) CFP 與 YFP充分靠近發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，此時(shí)檢測(cè)到的就是 YFP的發(fā)射波長(zhǎng)為 527 nm 的熒光。將編碼這種融合蛋白的基因通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)使其在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，這樣就可以在活細(xì)胞生理?xiàng)l件下研究蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)間的相互作用。二、FRET技術(shù)的應(yīng)用隨著生命科學(xué)研究的不斷深入，對(duì)各種生命現(xiàn)象發(fā)生的機(jī)制，特別是對(duì)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間相互作用的研究變得尤為重要。而要想在這些方面的研究取得重大突破，技術(shù)進(jìn)步又是必不可少的。一些傳統(tǒng)的研究方法不斷發(fā)展，為蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間相互作用

7、的研究提供了極為有利的條件，但同時(shí)這些研究手段也存在不少缺陷：如酵母雙雜交、磷酸化抗體、免疫熒光、放射性標(biāo)記等方法應(yīng)用的前提都是要破碎細(xì)胞或?qū)?xì)胞造成損傷，無(wú)法做到在活細(xì)胞生理?xiàng)l件下實(shí)時(shí)的對(duì)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間相互作用進(jìn)行動(dòng)態(tài)研究。FRET 技術(shù)的應(yīng)用結(jié)合基因工程等技術(shù)正好彌補(bǔ)了這一缺陷，下面是 FRET 技術(shù)在相關(guān)生命科學(xué)領(lǐng)域中的具體應(yīng)用。1、檢測(cè)酶活性變化（1）活細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)蛋白激酶活性蛋白質(zhì)磷酸化是細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中的重要標(biāo)志，研究其中的酶活性是研究信號(hào)通路的一個(gè)重要方面。以前酶活性測(cè)定主要是利用放射性以及免疫化學(xué)發(fā)光等方法，但前提都是要破碎細(xì)胞，用細(xì)胞提取物測(cè)定酶活性，還無(wú)法做到活細(xì)胞

8、內(nèi)定時(shí)、定量、定位的觀測(cè)酶活 FRET 方法就可以很好的解決這個(gè)問(wèn)題：如 zhang 等人利用 FRET 原理設(shè)計(jì)了一種新的探針（一種融合蛋白）：新探針包含一個(gè)對(duì)已知蛋白激酶特異性的底物結(jié)構(gòu)域，一個(gè)與磷酸化底物結(jié)構(gòu)域相結(jié)合的磷酸化識(shí)別結(jié)構(gòu)域。這個(gè)探針蛋白的兩端是 GFP 的衍生物 CFP與 ，利用 FRET 原理工作。當(dāng)?shù)孜锝Y(jié)構(gòu)域被磷酸化后，分子內(nèi)部就會(huì)發(fā)生磷酸化識(shí)別結(jié)構(gòu)域與其結(jié)合而引起的內(nèi)部折疊，兩個(gè)熒光蛋白相互靠近就會(huì)發(fā)生能量遷移。如果磷酸酶進(jìn)行作用將其去磷酸化，分子就會(huì)發(fā)生可逆性的變化。該研究小組3-4用幾組嵌合體來(lái)研究四種已知蛋白激酶的活性：PKA（protein kinase A）、

9、SrcAbl 、 EGFR（epidermalgrowth factor receptor FRET 來(lái)檢測(cè)激酶活性變化。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行生長(zhǎng)因子處理后，幾種酪氨酸激酶都在幾分鐘內(nèi)被激活，檢測(cè)到 25%-35%的活性變化。用 forskolin激活 PKA能增強(qiáng) FRET 25%-50%的變化，激酶在整個(gè)細(xì)胞質(zhì)范圍內(nèi)被激活。如果將報(bào)導(dǎo)探針加上核定位信號(hào)使之定位于核中，則 FRET 變化被極大的延遲了，這也說(shuō)明了 PKA作用的區(qū)域性。由此可見(jiàn)，利用 FRET 方法可以很好的觀察活細(xì)胞內(nèi)酶活性變化，并且能做到定時(shí)、定量、定位，是一種非常有效的研究手段。（2）關(guān)于細(xì)胞凋亡的研究細(xì)胞凋亡過(guò)程大致可以分為三個(gè)

10、不同的階段：起始期細(xì)胞通過(guò)不同途徑接受多種與凋亡有關(guān)的信號(hào)；整合期多種信號(hào)在此整合，細(xì)胞做出生存或死亡的決定；執(zhí)行期一旦cysteinylaspartate-specific proteaseCaspase）在細(xì)胞凋亡的執(zhí)行期發(fā)揮關(guān)鍵作用，近年來(lái)對(duì)其研究成 FRET 技術(shù)的出現(xiàn)對(duì)此的研究提供了更為有利的條件：ReikoOnuki等人利用 FRET 技術(shù)研究了 Caspase8與 Bid蛋白之間的相互作用，Caspase8 活化后作用 Bid蛋白，使其裂解成兩個(gè)片段，然后羧基片段轉(zhuǎn)移到線粒體使其釋放細(xì)胞色素 C 誘發(fā)細(xì)胞凋亡。研究者將 Bid蛋白兩端分別與 CFP 與 YFP融合，精心設(shè)計(jì)使其在

11、沒(méi)有被裂解前剛好可以發(fā)生 FRET，當(dāng) Bid蛋白被裂解后 FRET 效應(yīng)自然消失。所以是一種很好的檢測(cè)Caspase8 酶活性方法，而且當(dāng) Bid蛋白與 CFP 與 YFP融合之后仍能行使正常的功能，當(dāng)融合物在細(xì)胞內(nèi)被裂解后，連接 CFP 的片段轉(zhuǎn)移到線粒體，通過(guò) CFP熒光可以很清楚的觀測(cè)到其在細(xì)胞內(nèi)的定位。另外 Markus Rehm6與 Kiwamu Takemoto7等人利用FRET 技術(shù)設(shè)計(jì)了可以反映 Caspase3 酶活性變化的融合報(bào)告蛋白,通過(guò)此報(bào)告蛋白證實(shí)了在細(xì)胞凋亡過(guò)程中 Caspase3 酶活性變化是一個(gè)非常迅速的過(guò)程。2、關(guān)于膜蛋白的研究（1）受體激活效應(yīng)在細(xì)胞膜上的

12、橫向擴(kuò)散膜蛋白的研究一直都是信號(hào)通路研究中的重點(diǎn)和難點(diǎn)。當(dāng)細(xì)胞膜局部受外界刺激后，相應(yīng)受體被激活然后向細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)信號(hào)，可是在這之前是否會(huì)有細(xì)胞膜上的橫向效應(yīng)呢？近來(lái) Peter 等人8在Science 上報(bào)道：細(xì)胞膜局部受刺激后，膜受體活化效應(yīng)可迅速擴(kuò)展到整個(gè)細(xì)胞膜。他們將膜受體 （epidermal growth factor receptor）與 GFP融合，抗活化后的 EGFR抗體用 Cy3 染料標(biāo)記，刺激因子EGF（epidermal growth factor）用Cy5 染料標(biāo)記，這樣可以很明顯的看到 EGF 在細(xì)胞膜上的局部分布。當(dāng) EGF 作用細(xì)胞后，EGFR活化并與其抗體結(jié)合，

13、于是 GFP與 Cy3 染料充分接近發(fā)生FRET，利用此方法可以很明顯的觀測(cè)到細(xì)胞膜局部受刺激后，受體活化效應(yīng)迅速擴(kuò)散到整個(gè)細(xì)胞膜。（2）膜蛋白的定位修飾我們知道膜蛋白是定位在細(xì)胞膜上不同的亞區(qū)域中，例如脂質(zhì)筏（lipid rafts）和小窩（caveolae），小窩包含著豐富膽固醇、鞘磷脂和信號(hào)蛋白。那么這些蛋白怎樣到達(dá)它們的目的地呢？Zacharias 等在 Science 上報(bào)道，?；阋允惯@些蛋白定位在脂質(zhì)筏。他們的研究是通過(guò) FRET（fluorescence resonance energy transfer）技術(shù)，用GFP 的突變體CFPcyanfluorescent prot

14、ein）和 （yellow fluorescent protein）來(lái)進(jìn)行。因?yàn)檫@些蛋白并沒(méi)有細(xì)胞內(nèi)定位序列，所以研究者將各種?；揎椀拿舾行蛄屑釉谶@些蛋白上，研究它們?cè)诩?xì)胞膜上的分布。因?yàn)榉植嫉奈⒔Y(jié)構(gòu)域非常小，所以當(dāng) CFP 和 YFP共分布在同一個(gè)微結(jié)構(gòu)域時(shí)，就可以用 FRET 來(lái)觀測(cè)到。研究者最初是用激酶 Lyn 的?；蛄屑釉谶@些熒光蛋白上，使 myristoyl和 palmitoyl側(cè)鏈鏈接在 CFP 和 YFP的氨基端。結(jié)果發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生的 FRET 信號(hào)非常強(qiáng)，用能去除膽固醇而使小窩和脂質(zhì)筏消失的 （5-methyl-cyclodextrin）處理也不能使熒光消失，所以這說(shuō)明熒光蛋

15、白已經(jīng)非常牢固的結(jié)合在了一起。然后研究者用荷電的基團(tuán)代替熒光蛋白上疏水的基團(tuán)時(shí)，發(fā)現(xiàn)聚體形成被抑制了。3、細(xì)胞膜受體之間相互作用外界刺激因素向細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳遞一般認(rèn)為通過(guò)其在胞膜上的受體，當(dāng)配體與受體結(jié) Fas 及其同源物TNFR(均為胞膜上的三聚體受體)的研究發(fā)現(xiàn)：它們都可以在無(wú)配體存在的情況下自發(fā)組裝，并介導(dǎo)信號(hào)傳遞，引發(fā)細(xì)胞凋亡。其中在鑒定 Fas 發(fā)生三聚體化的實(shí)驗(yàn)中使用了FRET 技術(shù)：將Fas 分別與CFP與 YFP融合，利用此項(xiàng)技術(shù)可以很方便的觀測(cè)到 Fas 單體是否發(fā)生聚合。Yogesh Patel等人研究?jī)煞N遞質(zhì)多巴胺與抑生長(zhǎng)素。發(fā)現(xiàn) SSTR5（the type 5 som

16、atostatinreceptor）與D2R（type 2 dopamine receptor）共同分布在大鼠腦中的一些神經(jīng)元中，他們將兩者共表達(dá)，發(fā)現(xiàn)加入多巴胺能的激活劑能增強(qiáng) SSTR5 與 somatostatin 胺拮抗劑能抑制 SSTR5 D2R 能恢復(fù) SSTR5 突變體與腺苷環(huán)化酶的偶聯(lián)。這不由是人們想到：兩種受體之間是否存在某種聯(lián)系呢？終于，應(yīng)用 FRET 技術(shù)（SSTR5用紅色染料標(biāo)記，D2R 用綠色染料標(biāo)記）發(fā)現(xiàn)了兩者之間的直接相互作用。而且當(dāng)兩受體的配體都存在時(shí)才出現(xiàn) FRET，說(shuō)明兩受體被激活時(shí)才發(fā)生相互作用。4、細(xì)胞內(nèi)分子之間相互作用Rho 家族的小G 蛋白通過(guò)調(diào)節(jié)肌

17、動(dòng)蛋白的多聚化調(diào)控著重要的生理功能，象其他信號(hào)分子一樣，這些GTPase 的效應(yīng)在時(shí)間和空間上都非常集中，那么如何檢測(cè)它們活性的時(shí)空動(dòng)力學(xué)呢? Klaus Hahn等在 Science 上報(bào)道了一種新的技術(shù) FLAIR（fluorescence activationindicator for Rho proteins）可很好的解決這個(gè)問(wèn)題：他們將PAK1的能結(jié)合并激活 Rac-GTP的 domain PDB與熒光染料 Alexa GFP與 Rac當(dāng) Rac與 PDB相互作用時(shí)，GFP 和 Alexa就會(huì)足夠接近以致發(fā)生 FRET。這種方法能夠?qū)崟r(shí)的檢測(cè)到在一個(gè)活的細(xì)胞中 Rac 的定位改變與Rac 激活之間的關(guān)系。Matsuda 等人在 Nature上報(bào)道關(guān)于細(xì)胞內(nèi) Ras和 Rap1 FRET 們將 Ras 和 Raf的 R