彝藥野壩子花總黃酮的提取及對(duì)活性氧自由基的清除作用

1、彝藥野壩子花總黃酮的提取及對(duì)活性氧自由基的去除作用【摘要】目的研究野壩子花中總黃酮的提取及其對(duì)活性氧自由基的去除作用。方法采用醇提酸沉法提取野壩子花中總黃酮，對(duì)所提取的黃酮類(lèi)物質(zhì)進(jìn)展驗(yàn)證，并用分光光度法測(cè)定黃酮含量，用總黃酮對(duì)活性氧自由基去除作用進(jìn)展實(shí)驗(yàn)。結(jié)果樣品中總黃酮含量為=0.2352g/l，對(duì)H和-2的去除率分別可達(dá)30.85%和44.52%。結(jié)論野壩子花中黃酮類(lèi)物質(zhì)對(duì)H和-2有較好的去除才能?！娟P(guān)鍵詞】野壩子花；總黃酮；羥自由基；超氧陰離子自由基黃酮類(lèi)化合物(flavnids)是一類(lèi)重要的廣泛存在于自然界的天然有機(jī)化合物，是目前備受關(guān)注的天然產(chǎn)物之一，在植物體中通常以游離或與糖形成苷

2、的形式存在。黃酮類(lèi)化合物作為一種功能成分，具有許多有益的生物學(xué)活性1,2，其中重要的生物學(xué)活性之一是減少自由基形成、消除自由基的抗氧化活性。野壩子Elshltziarugulsa是唇形科香薷屬植物，是云南楚雄彝族人民的常用植物藥之一，它是一種藥食同源的植物，廣泛分布于云南各地。野壩子是漢藥名，在各地叫法不一，又名野壩蒿、野巴子、野拔子、野香蘇、野蘇草、夸巴脂、小鐵蘇、掃把茶、草拔子、草芝麻蒿、皺葉香薷等，其彝藥名為阿能拋，始載于?中國(guó)彝藥學(xué)?，全草均可入藥，在?全國(guó)中藥匯編?中記載了其藥效?，F(xiàn)今，有學(xué)者對(duì)野壩子進(jìn)展了紅外光譜分析3、化學(xué)成分分析4等研究工作，而對(duì)其中黃酮類(lèi)化合物抗氧化性的研究尚

3、未見(jiàn)報(bào)道。本文對(duì)野壩子花中總黃酮進(jìn)展提娶鑒定，并研究其總黃酮對(duì)羥自由基H及超氧陰離子自由基-2的去除作用。1材料與儀器1.1材料野壩子花采自云南楚雄市西山公園，經(jīng)楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系徐成東博士鑒定為唇形科香薷屬植物野壩子花。1.2試劑蘆丁日本和光純藥工業(yè)株式會(huì)社；無(wú)水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、硫酸亞鐵、水楊酸、雙氧水、鹽酸、鋅粉均為國(guó)產(chǎn)分析純；水為實(shí)驗(yàn)室自制超純水。1.3儀器754型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)上海第三分析儀器廠制造，HH-S2型恒溫水浴鍋金壇市大地自動(dòng)化儀器，P214電子天平奧豪斯儀器制造，SHZ-IIIA型循環(huán)水式真空泵鞏義市英峪予化儀器廠等。2方法與結(jié)果2.1總黃酮

4、成分提取準(zhǔn)確稱(chēng)取一定質(zhì)量的野壩子花干粉，用50%的乙醇預(yù)浸18h，于80回流提取3h共2次，提取液濃縮后，加鹽酸調(diào)節(jié)pH值至34，使黃酮類(lèi)化合物沉淀，沉淀以50%的乙醇溶解并定容于250l容量瓶得樣品液。2.2總黃酮成分的鑒別5,6取樣品液1l于試管中，分別參加以下試劑，結(jié)果見(jiàn)表1。表1黃酮類(lèi)化合物的定性鑒定略由表1可以說(shuō)明，野壩子花的提取物是黃酮類(lèi)化合物。2.3總黃酮含量測(cè)定2.3.1測(cè)定方法根據(jù)以蘆丁為對(duì)照品測(cè)定野壩子花中黃酮類(lèi)化合物的含量，參加鋁離子試劑，在堿性條件下使黃酮類(lèi)化合物與鋁鹽形成絡(luò)合物，在可見(jiàn)光區(qū)能獲得穩(wěn)定的特征吸收峰。2.3.2測(cè)定波長(zhǎng)選擇準(zhǔn)確汲取1.00l的樣品液于25l

5、比色管中，加5%亞硝酸鈉溶液1.00l；10%硝酸鋁溶液1.00l；4%氫氧化鈉溶液10.00l，再加50%乙醇至刻度。以試劑空白作參比，在400700n之間測(cè)定絡(luò)合物吸光度,絡(luò)合物在510n處有最大吸收，故測(cè)定時(shí)選用此波長(zhǎng)。2.3.3標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制準(zhǔn)確汲取0.200g/l的蘆丁對(duì)照品溶液0.00，2.00，4.00，6.00，8.00，10.00l分別置于25l比色管中，各加5%亞硝酸鈉溶液1.00l，混勻，放置6in；加10%硝酸鋁溶液1.00l，混勻，放置6in；加4%氫氧化鈉溶液10.00l，再加50%乙醇至刻度，搖勻，放置10in。在510n波長(zhǎng)處以試劑空白為參比測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)

6、曲線(xiàn)，得回歸方程為A=0.01135-0.02648，r=0.9995。所得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)見(jiàn)圖1。2.3.4提取液總黃酮含量的測(cè)定精細(xì)量取樣品溶液1.00l，置于25l比色管中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制項(xiàng)中操作方法顯色后，測(cè)定出試液吸光度，根據(jù)回歸方程，計(jì)算出原樣品溶液總黃酮的含量為=0.2352g/l。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.2.4總黃酮提取物對(duì)羥自由基H去除作用7參照Fentn反響的方法建立反響體系模型。利用H22與Fe2+混合后產(chǎn)生存活時(shí)間短，具有很高反響活性的H這一性質(zhì)，在反響體系中參加水楊酸后，就能有效地捕捉H，并產(chǎn)生有色產(chǎn)物，該產(chǎn)物在510n處有強(qiáng)吸收。假設(shè)參加具有去除H功能的黃酮類(lèi)化合物時(shí)，黃酮

7、類(lèi)化合物便會(huì)與水楊酸競(jìng)爭(zhēng)H,從而使有色產(chǎn)物生成量減少。采用固定反響時(shí)間法，在510n處測(cè)量含被測(cè)物反響液的吸光度，并與空白液比擬，便能測(cè)定被測(cè)物對(duì)H的去除作用。反響體系為:在10l比色管中加9l/LFeS42.00l,9l/L水楊酸-乙醇溶液2.00l，不同濃度的野壩子花總黃酮提取液1.00l，最后加8.8l/LH222.00l啟動(dòng)反響，加蒸餾水定容至刻度，37反響0.5h，以蒸餾水為參比，以試劑空白作比擬，在510n處測(cè)定各濃度的吸光度，考慮到提取液本身的吸光度，在10l比色管中加9l/LFeS42.00l,9l/L水楊酸-乙醇溶液2.00l，不同濃度的野壩子花總黃酮提取液1.00l,蒸餾水

8、定容至刻度，37反響0.5h，作為樣品液的本底吸收。去除率計(jì)算公式為：H去除率(%)=A0-(Ax-Ax)/A100%式中:A為空白對(duì)照溶液吸光度;Ax為樣品液吸光度;Ax為不加H22樣品液的本底吸光度。2.5總黃酮提取物對(duì)超氧陰離子自由基-2去除作用采用鄰苯三酚自氧化法測(cè)定8。鄰苯三酚在堿性條件下能迅速自氧化，釋放出-2，隨著反響的進(jìn)展-2不斷積累，在反響開(kāi)場(chǎng)后5in之內(nèi)，反響液在325n波長(zhǎng)處的吸光度隨反響時(shí)間而線(xiàn)性增大。因此于325n處測(cè)量含被測(cè)物反響液的吸光度隨時(shí)間的變化率，與空白液比擬即可得出被測(cè)物對(duì)-2的去除率。在10l比色管中分別參加50lL-1Tris-Hl溶液pH8.24.5

9、，4.2l超純水，混勻后在25水浴中保溫20in，取出后立即參加于25水浴預(yù)熱的3l/L鄰苯三酚0.3l以10lL-1Hl代替鄰苯三酚作空白，迅速混勻后在325n下每隔30s測(cè)定吸光度，到5in時(shí)停頓，計(jì)算對(duì)照液吸光度隨時(shí)間的變化率F0。依上法，在參加鄰苯三酚前先參加1l野壩子花總黃酮提取液，再依次參加Tris-Hl緩沖液，超純水，混勻后在25水浴中保溫20in，取出后立即參加于25水浴預(yù)熱的3l/L鄰苯三酚0.3l，迅速混勻后在325n下每隔30s測(cè)定吸光度，到5in時(shí)停頓，計(jì)算樣品液吸光度隨時(shí)間的變化率Fx。去除率計(jì)算公式：去除率(%)=(F0-Fx)F0100%2.6測(cè)定結(jié)果野壩子花黃酮

10、提取物對(duì)超氧陰離子自由基-2去除率的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。表2黃酮類(lèi)化合物去除H和-2測(cè)定結(jié)果略3討論正常情況下，活性氧自由基在抗菌、消炎和抑制腫瘤等方面具有重要意義。在疾病和某些外源性藥物和毒物入侵后，機(jī)體抗氧化體系可能發(fā)生紊亂，導(dǎo)致自由基代謝平衡失調(diào)，進(jìn)而使生物膜和蛋白質(zhì)、核酸等大分子發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化損傷。許多天然產(chǎn)物具有去除活性氧自由基的作用，其中黃酮類(lèi)化合物是活性較強(qiáng)的一類(lèi)，已成為當(dāng)今眾多學(xué)者研究的熱點(diǎn)。黃酮類(lèi)化合物由于其特殊的構(gòu)造使它能選擇性地抑制體內(nèi)酶的活性而具有抗氧化性；可通過(guò)與金屬離子發(fā)生互相作用而具有抗氧化活性；還可通過(guò)酚羥基與自由基反響生成較穩(wěn)定的半醌式自由基，終止自由基鏈?zhǔn)椒错戇@

11、也是黃酮類(lèi)化合物去除自由基的最主要方式而具有抗氧化活性9。本實(shí)驗(yàn)研究說(shuō)明，彝藥野壩子花中黃酮類(lèi)化合物具有較強(qiáng)去除羥自由基H和超氧陰離子自由基-2的作用，對(duì)H的去除才能隨黃酮濃度的增加而增強(qiáng)，有量效關(guān)系；總黃酮濃度在07g/l范圍時(shí)，對(duì)-2去除率隨黃酮濃度的增大而增強(qiáng)。【參考文獻(xiàn)】1陳國(guó)有,齊鶴,徐東花,等.黃酮類(lèi)化合物的生物活性研究進(jìn)展J.黑龍江醫(yī)藥,2022，21(3)：81.2華輝,郭勇.黃酮類(lèi)化合物藥理研究進(jìn)展J.廣東藥學(xué),1999,9(4):9.3張麗梅,王怡林,董勤,等.彝藥野壩子FTIR光譜法分析J.楚雄師范學(xué)院學(xué)報(bào),2022,20(6):27.4趙勇，李慶春，趙焱,等.野拔子的化學(xué)成分研究J.中國(guó)中藥雜志，2022，29(12)：1144.5陳業(yè)高.植物化學(xué)成分.北京：化學(xué)工業(yè)出版社,2022:229.6宋曉凱，吳立軍.天然藥物化學(xué).北京：化學(xué)工業(yè)出版社,2022:78.7陳留勇,孟憲軍,賈薇,等.黃桃水