銀杏葉提取物對6OHDA誘導(dǎo)PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響

1、銀杏葉提取物對6-OHDA誘導(dǎo)PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響【摘要】目的討論銀杏葉提取物(Ginkgbilbaextrat,GBE)對6-羥基多巴胺(6-hydrxydpaine，6-HDA)誘導(dǎo)的P12細(xì)胞氧化應(yīng)激的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法經(jīng)不同劑量GBE預(yù)處理體外培養(yǎng)的P12細(xì)胞后，參加6-HDA誘導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)元損傷模型。用TT法檢測P12細(xì)胞活力;分光光度法測定細(xì)胞過氧化氫酶(AT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、總超氧化物歧化酶(T-SD)的活性和總抗氧化才能(T-A)的程度;硫代巴比妥法測定細(xì)胞丙二醛(DA)含量。結(jié)果100l/L的6-HDA處理P12細(xì)胞24h，細(xì)胞活力較正常對照

2、組明顯降低(P0.01)，AT、GSH-Px、T-SD的活性和T-A的程度明顯降低(P0.05)，DA含量明顯升高(P0.05);與模型組比擬，不同劑量GBE預(yù)處理組的P12細(xì)胞活力逐漸升高，AT、GSH-Px、T-SD的活性和T-A的程度明顯升高(P0.05)，DA含量明顯減少(P0.05)。結(jié)論GBE對6-HDA誘導(dǎo)的P12細(xì)胞氧化應(yīng)激具有抑制作用，進(jìn)步AT、GSH-Px、T-SD的活性和T-A的程度可能是其抗氧化作用的機(jī)制之一?！娟P(guān)鍵詞】銀杏葉提取物;6-羥基多巴胺;P12細(xì)胞;氧化應(yīng)激Abstrat:bjetiveTexplretheprtetiveeffetsandtheausale

3、hanisfGinkgbilbaextrat(GBE)nthexidativestressinduedby6-hydrxydpaine(6-HDA)inP12ells.ethdsDpainergineurnalinjurydelasinduedbyadditinf6-HDAintP12ellsulturedinvitrandpretreatedithdifferentdsesfGBE.ellviability,thelevelsffurantixidativeindexesinludingttalsuperxiddisutase(T-SD),atalase(AT),glutathineperx

4、idase(GSH-Px)andttalantixidantapaity(T-A)andthententfalndialdehyde(DA)ereassayedbyTT,visiblespetrtetryandtheethdfthibarbituriaidreatin,respetively.ResultsTheellviabilityfP12ellstreatedith100l/L6-HDAfr24hasler,thelevelsffurantixidativeindexeserelerandtheDAntentashigherasparedtthentrlgrup(P0.05).pared

5、iththedelgrup,GBEfdifferentdsesuldarkedlyrelievethetxiityf6-HDAnP12ells(P0.05),inreasetheellviabilityandthelevelsffurantixidativeindexes(P0.05)anddereasethententfDA(P0.05).nlusinGBEayreduethedaagefxidativestressinduedby6-HDAnP12ellsbyinreasingthelevelsfT-SD,AT,GSH-PxandT-A,hihightbeneftheausalehanis

6、sftheantixidativeeffetfGBE.Keyrds:Ginkgbilbaextrat;6-hydrxydpaine;P12ells;xidativestress帕金森病(Parkinsndisease,PD)是老年人常見的進(jìn)展性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要病理特征為黑質(zhì)致密區(qū)的多巴胺(DA)能神經(jīng)元缺失及胞質(zhì)內(nèi)包涵體Ley小體形成，導(dǎo)致黑質(zhì)紋狀體通路破壞及尾狀核、殼核中DA含量減少1。目前PD發(fā)病機(jī)制尚不非常清楚。當(dāng)前的觀點(diǎn)認(rèn)為氧化應(yīng)激是PD發(fā)病過程中DA能神經(jīng)元選擇性易損性的主要機(jī)制2。PD尸檢標(biāo)本研究發(fā)現(xiàn)患者黑質(zhì)線粒體呼吸酶鏈復(fù)合物活性降低以及線粒體形態(tài)異常，線粒體功能障礙

7、導(dǎo)致活性氧過量生成，氧自由基去除系統(tǒng)的缺陷在PD發(fā)病機(jī)制中具有重要的病因?qū)W意義，故采用抗氧化藥物治療PD已成為新療法中的重要研究方向3。銀杏葉提取物(Ginkgbilbaextrat,GBE)是具有多種藥理活性的中藥制劑，臨床已廣泛應(yīng)用于心腦血管疾病及老年癡呆癥的治療，但用GBE治療PD報道甚少。為討論GBE是否通過減輕細(xì)胞氧化應(yīng)激減少多巴胺能神經(jīng)元凋亡，本研究以具有神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞和神經(jīng)元特性的大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞株(ratphaehryta,P12細(xì)胞)為對象，利用特異性DA能神經(jīng)損毀劑6-羥基多巴胺(6-hydrxydpaine,6-HDA)制作細(xì)胞氧化應(yīng)激模型，檢測GBE對相關(guān)抗氧化

8、指標(biāo)的影響，討論GBE對氧化應(yīng)激損傷神經(jīng)元的保護(hù)作用及其機(jī)制。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)藥物GBE為德國威瑪舒培博士藥廠產(chǎn)品(17.5g/5l)，有效成分包括24%黃酮苷類和6%萜類。1.2試劑及細(xì)胞株P(guān)12細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫;6-HDA購自Siga公司，胰蛋白酶、L-谷氨酰胺、4-甲基偶氮唑藍(lán)(TT)購自美國Ares公司，DE培養(yǎng)基為美國GIB公司產(chǎn)品，新生牛血清、馬血清購自杭州四季青生物工程公司，過氧化氫酶(AT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、總超氧化物歧化酶(T-SD)活性、總抗氧化才能(T-A)程度以及丙二醛(DA)含量測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所，Biinhn

9、iniaid(BA)蛋白濃度測定試劑盒購自北京碧云天生物技術(shù)研究所。1.3細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理P12細(xì)胞凍于液氮中，實(shí)驗(yàn)時進(jìn)展復(fù)蘇并培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)為5%馬血清、10%新生牛血清，105U/L青霉素、100g/L鏈霉素及2l/LL-谷氨酰胺、pH值為7.07.2的DE培養(yǎng)液中(完全培養(yǎng)液)，于37、5%2條件下培養(yǎng)至細(xì)胞80%交融時消化、傳代，選取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)展實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分5組：正常對照組(N組),P12細(xì)胞正常培養(yǎng)于DE完全培養(yǎng)液中;模型組(6-H組),完全培養(yǎng)液中參加終濃度為100l/L的6-HDA(預(yù)實(shí)驗(yàn)以6-HDA25、50、100、150、200l/L孵育P12細(xì)胞6、12、24h

10、和48h后以TT測定細(xì)胞存活率，結(jié)果選定6-HDA100l/L作用24h作為實(shí)驗(yàn)的干預(yù)點(diǎn)，其細(xì)胞生存率為51.6%);GBE低、中、高劑量組(GL、G、GH組)，GBE(終濃度分別為10、20、40g/L，通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定)作用2h后，參加終濃度為100l/L6-HDA的完全培養(yǎng)液。從6-HDA參加起繼續(xù)培養(yǎng)24h，供檢測。每組6孔，重復(fù)3次。1.4TT法檢測P12細(xì)胞存活率細(xì)胞以2107個/L接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24h后進(jìn)展藥物處理，按1.3要求分5組。每組設(shè)6孔，同時設(shè)3孔無細(xì)胞空白對照。加藥后繼續(xù)培養(yǎng)24h，終止培養(yǎng)前4h每孔參加TT液20l，置37繼續(xù)培養(yǎng)4h。棄上清，每孔參加二甲基

11、亞礬(DS)150l，振蕩10in，終止反響并充分溶解甲臜顆粒，用全自動酶標(biāo)光度儀進(jìn)展比色,波長為570n，記錄各組的D值(D測=D實(shí)-D空均)。各實(shí)驗(yàn)組P12細(xì)胞活力以各實(shí)驗(yàn)組的D值與正常對照組的D值的比值表示。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。1.5AT、T-SD、GSH-Px的活性、T-A程度及DA含量測定將80%左右交融、狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)展消化，制成細(xì)胞懸液(2108/L)，各取2l參加6個培養(yǎng)瓶，正常培養(yǎng)至80%左右交融，換含1%新生牛血清的培養(yǎng)液細(xì)胞同步化12h后，按1.3分組要求加藥繼續(xù)培養(yǎng)24h。以預(yù)溫至37的PBS2l洗滌2次，吸干多余PBS。置冰袋上，各參加細(xì)胞裂解液300l，鋪滿細(xì)胞生長面，

12、裂解20in，搜集細(xì)胞于1.5lEP管，4000r/in離心10in，轉(zhuǎn)移上清于一新EP管，得細(xì)胞處理液。按BA蛋白測定試劑盒說明測定蛋白含量，嚴(yán)格按照各項(xiàng)檢測試劑盒說明操作測定T-SD、AT和GSH-Px的活性、T-A的程度及DA含量。1.6統(tǒng)計學(xué)處理計量資料用s表示，用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)展分析。多組間差異的顯著性分析用單因素方差分析，組間兩兩比擬采用SNK檢驗(yàn)。P0.05認(rèn)為差異有顯著性。2結(jié)果2.1P12細(xì)胞活力的變化與N組相比，6-H組P12細(xì)胞的活力下降(P0.01)，提示6-HDA對細(xì)胞有損傷作用。GBE低、中、高劑量給藥后，相對于6-H組，P12細(xì)胞的活力逐漸進(jìn)步(P0.

13、05)，提示GBE在一定范圍內(nèi)對P12細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。見圖1。2.2GBE對細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響與N組相比，6-H組P12細(xì)胞的T-A程度、T-SD活性、AT活性和GSH-Px活性均有明顯降低(P0.05)，而DA含量明顯升高(P0.05)，提示6-HDA使得P12細(xì)胞處于較強(qiáng)的氧化應(yīng)激狀態(tài)。與6-H組相比，G、GH組細(xì)胞的T-SD、GSH-Px、AT的活性和T-A程度均隨著GBE劑量的增加而逐漸升高(P0.05)。GL組細(xì)胞僅T-SD活性和T-A程度有明顯升高(P0.05)，但AT和GSH-Px的活性與6-H組相比差異無顯著性(P0.05)。而GL、G、GH組細(xì)胞的DA含量均隨著GBE劑

14、量的增加而逐漸降低(P0.05)，并呈劑量依賴性。這些結(jié)果說明，GBE能明顯改善6-HDA造成的P12細(xì)胞的氧化應(yīng)激狀態(tài)。見表1。表1GBE對P12細(xì)胞T-A程度，T-SD、AT和GSH-Px活性及DA含量的影響與N組比擬：P0.05;與6-H組比擬：fP0.05轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.3討論近年來許多根底和臨床研究說明，氧化應(yīng)激反響增強(qiáng)在PD黑質(zhì)神經(jīng)元凋亡中起著主要作用，氧自由基去除系統(tǒng)的缺陷在PD發(fā)病機(jī)制中具有重要的病因?qū)W意義4，故采用抗氧化治療正日益成為治療PD的重要手段。氧化應(yīng)激損傷涉及到氧化應(yīng)激和抗氧化系統(tǒng)的失衡，因此，可以通過攝入抗氧化劑限制氧化損傷5。6-HDA作為類似DA的嗜神經(jīng)

15、毒素，通過介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)外的氧化反響產(chǎn)生活性氧和醌類物質(zhì)，誘導(dǎo)單胺氧化酶產(chǎn)生過氧化氫及對線粒體呼吸鏈的直接抑制等引發(fā)氧化應(yīng)激反響，特異性損害中樞DA能神經(jīng)元，最終導(dǎo)致黑質(zhì)-紋狀體通路功能減退而產(chǎn)生PD病癥6。研究顯示，應(yīng)用高效液相色譜法及電子自旋捕捉法檢測發(fā)現(xiàn)PD患者腦黑質(zhì)中谷胱甘肽程度顯著降低，病變部位脂質(zhì)過氧化程度明顯增強(qiáng)7。在PD黑質(zhì)紋狀體投射系統(tǒng)受損發(fā)生氧化應(yīng)激的過程中，自由基對生物膜的破壞起了重要作用，使生物膜中的不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反響，產(chǎn)生DA，生物膜構(gòu)造及通透性改變，生物膜的活性喪失，線粒體、溶酶體等細(xì)胞器發(fā)生裂解，細(xì)胞死亡8。在正常的生理狀態(tài)下，人體代謝產(chǎn)生的自由基可以經(jīng)自

16、由基去除系統(tǒng)滅活。人體自由基去除的酶主要包括SD、AT、GSH-Px及抗氧化非酶小分子GSH9。P12細(xì)胞為大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞，它能表達(dá)酪氨酸羥化酶并且合成多巴胺，因此也被稱為DA能細(xì)胞10。GBE主要含黃酮甙類、萜類和酚類等，具有去除自由基和過氧化脂質(zhì)、對抗興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、拮抗血小板活化因子等多種藥理活性11，臨床已廣泛用于心腦血管疾病及老年癡呆癥的治療。但GBE對氧化應(yīng)激損傷神經(jīng)元是否有保護(hù)作用，報道甚少。本研究采用6-HDA誘導(dǎo)P12細(xì)胞為PD氧化應(yīng)激細(xì)胞模型，并通過不同劑量GBE處理，采用TT法檢測細(xì)胞活性，硫代巴比妥法測定DA含量，分光光度比色法測定T-SD、AT、GSH

17、-Px的活性及T-A(包括復(fù)原性GSH、維生素)程度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，6-HDA誘導(dǎo)P12細(xì)胞后DA含量升高，T-SD、AT、GSH-Px的活性及T-A程度均降低，提示P12細(xì)胞的氧化應(yīng)激反響被激活，處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，符合PD氧化應(yīng)激的發(fā)病機(jī)制，與文獻(xiàn)報道一致4。而不同劑量GBE處理后對以上抗氧化指標(biāo)的降低具有抑制作用，同時降低了DA含量，且具有一定的劑量依賴性。這些結(jié)果有力地證明GBE在離體實(shí)驗(yàn)中具有強(qiáng)大的抗氧化活性。因此，我們推測GBE可能通過進(jìn)步T-SD、AT、GSH-Px的活性及T-A程度，降低DA含量，減少氧化應(yīng)激對神經(jīng)細(xì)胞的損傷，從而發(fā)揮抗PD作用?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1ThasB,BealF.

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