瑞香狼毒提取物和腫瘤壞死因子對(duì)肺癌基因蛋白表達(dá)的影響

1、瑞香狼毒提取物和腫瘤壞死因子對(duì)肺癌基因蛋白表達(dá)的影響【摘要】目的討論瑞香狼毒和腫瘤壞死因子(TNF)對(duì)肺癌細(xì)胞基因蛋白表達(dá)的影響。方法用瑞香狼毒水提取物和TNF分別及結(jié)合處理肺癌細(xì)胞株NI-H157和NI-H446，用免疫組織化學(xué)SP法分別檢測(cè)用藥前后肺癌細(xì)胞中多藥耐藥相關(guān)蛋白(D2)、肺耐藥蛋白(LRP)和熱休克蛋白27(HSP27)的表達(dá)狀況。通過(guò)形態(tài)學(xué)圖像分析，比擬瑞香狼毒和TNF用藥前后三種基因蛋白表達(dá)的差異。結(jié)果用藥前后兩種肺癌細(xì)胞株3種基因蛋白表達(dá)情況如下：瑞香狼毒組NI-H446細(xì)胞株用藥后LRP和D2陽(yáng)性細(xì)胞灰度值均高于用藥前(P0.05)；HSP27的表達(dá)用藥前后差異無(wú)顯著性

2、(P0.05)。NI-H157細(xì)胞株用藥后LRP和HSP27陽(yáng)性細(xì)胞灰度值均高于用藥前(P0.05)；D2的表達(dá)用藥前后差異無(wú)顯著性(P0.05)。TNF組NI-H446細(xì)胞株用藥后LRP陽(yáng)性細(xì)胞灰度值高于用藥前(P0.05)；HSP27和D2的表達(dá)用藥前后差異均無(wú)顯著性(P0.05)。NI-H157細(xì)胞株用藥后LRP，D2和HSP27陽(yáng)性細(xì)胞灰度值均高于用藥前(P0.05),其中LRP具有高度顯著性(P0.01)。結(jié)合用藥組NI-H446細(xì)胞株用藥后LRP和D2陽(yáng)性細(xì)胞灰度值均高于用藥前(P0.05),HSP27的表達(dá)用藥前后差異無(wú)顯著性(P0.05)。NI-H157細(xì)胞株用藥后LRP、D2

3、和HSP27陽(yáng)性細(xì)胞灰度值均高于用藥前(P0.05),且LRP和HSP27差異具有高度顯著性(P0.01)。結(jié)論瑞香狼毒提取物和腫瘤壞死因子對(duì)兩種肺癌細(xì)胞株的某些基因蛋白的表達(dá)具有抑制作用；兩種藥物結(jié)合應(yīng)用對(duì)基因蛋白的表達(dá)有明顯的抑制作用?！娟P(guān)鍵詞】瑞香狼毒腫瘤壞死因子肺癌細(xì)胞株基因蛋白TheEffetsfExtratsfrRuixianglangduandTuurNersisFatrfExpressinfGenePrtEininTLungarinaellAbstrat:bjetiveTresearhtheeffetfextratsfrRuixianglangduandtuurnersisfa

4、tr(TNF)nexpressinfgeneprtein.ethdsTlungarinaellstrainseretreatedithextratsfrRuixianglangduandTNF,theexpressinsfD2,LRPandHSP27inlunganerellstrainseredetetedithiunhistheistrySPassaybefreandafterbeingtreatedrespetively.Tparethedifferenefexpressinfthreekindsfgeneprteinithrphlgialiageassay.ResultsThediff

5、erenefexpressiveintensityfD2,LRPandHSP27beteenbefreandafterbeingtreatedithextratsfrRuixianglangduandTNFintlungarinaellstrainsasflls.InRuixianglangdugrup:inlungarinaellstrainNI-H446theexpressiveintensityfLRPandD2erehigherthanthatbefretreated(P0.05),exeptHSP27(P0.05).InNI-H157theexpressiveintensityfLR

6、PandHSP27erehigherthanthataftertreated(P0.05)，exeptD2(P0.05).InTNFgrup:theexpressiveintensityfLRPashigherthanthatbefretreatedithTNF(P0.05).ThedifferenefexpressiveintensityfHSP27,D2ereinapparentbefreandaftertreatedithTNF(P0.05).Inbinatingrup:therestrainingeffetfexpressinfgeneprtein(D2,LRPandHSP27)ere

7、nsuinginNI-H446andNI-H157strains(P0.01).nlusinTheextratsfRuixianglangduandTNFrestraintheexpressinfertainkindsfgeneprteinintlungarinaellstrains.Therestrainingeffetfexpressinfgeneprteinarensuinginbinatingrup.Keyrds:Ruixianglangdu;TuurnersisfatrTNF；Lungarinaellstrains;Geneprtein受人口老齡化、環(huán)境污染、吸煙、職業(yè)等因素的影響，

8、肺癌已成為我國(guó)癌癥死亡病因的首位，其發(fā)病率及病死率均呈顯著上升趨勢(shì)。由于肺癌患者早期診斷比擬困難，多數(shù)患者確診時(shí)已屬晚期，失去手術(shù)時(shí)機(jī)。因此化療仍是多數(shù)肺癌患者的主要治療方法。本文通過(guò)討論瑞香狼毒和TNF對(duì)肺癌相關(guān)基因蛋白表達(dá)的影響，探尋進(jìn)步肺癌患者化療效果的新方法和新途徑?，F(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)告如下。1材料與方法1.1中藥提取瑞香狼毒采自河北北部，提取前經(jīng)專家鑒定確認(rèn)。將瑞香狼毒自然晾干取其根部粉碎，裝入容器中參加適量蒸餾水浸泡30in，加熱提齲瑞香狼毒水提藥物終濃度為5g/l生藥。1.2細(xì)胞培養(yǎng)兩個(gè)肺癌細(xì)胞株，即人小細(xì)胞肺癌NI-H446和人非小細(xì)胞肺腺癌NI-H157，購(gòu)自中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)根底

9、醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心。1.3組化染色1.3.1免疫組化試劑肺癌耐藥蛋白(LRP)、多藥耐藥相關(guān)蛋白2(D2)、熱休克蛋白27(HSP27)均為鼠抗人單克隆抗體，購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)。1.3.2藥物實(shí)驗(yàn)兩種肺癌細(xì)胞株復(fù)蘇后在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，消化計(jì)數(shù)后移至六孔培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)24h預(yù)先在六孔培養(yǎng)板中置干凈蓋玻片。分3組給藥：即瑞香狼毒組、TNF組、(瑞香狼毒和TNF)結(jié)合用藥組。瑞香狼毒組每孔參加經(jīng)抽濾的瑞香狼毒水提物20l；TNF組每孔參加用培養(yǎng)基稀釋的濃度為2.5萬(wàn)U/l的TNF17l；結(jié)合用藥組為以上兩組藥物之和；24h后檢測(cè)三種耐藥基因蛋白的表達(dá)情況，并進(jìn)展圖像分析。1.3.3免疫

10、組化SP兩步法經(jīng)10%甲醛固定后水洗。3%H22室溫孵育10in。蒸餾水沖洗，PBS浸泡5in，0.05%胰蛋白酶37消化30in。PBS浸泡5in，10正常山羊血清封閉，室溫孵育10in。傾去血清，滴加D2、LRP、HSP27一抗工作液，4孵育過(guò)夜。PBS沖洗，5in3次。滴加試劑1(plyerhelper，37孵育20in；PBS沖洗，5in3次。滴加試劑2(plyperxidase-anti-use/rabbitIgG)，37孵育20in；PBS沖洗，5in3次。DAB顯色劑顯色。自來(lái)水洗，復(fù)染，封片，鏡檢。陽(yáng)性結(jié)果的斷定：經(jīng)DAB顯色后陽(yáng)性目的為棕黃色。1.4觀察分析1.4.1計(jì)算方法

11、各組中每種條件3張玻片,每張玻片計(jì)數(shù)10個(gè)視野,再統(tǒng)計(jì)每種條件陽(yáng)性細(xì)胞灰度值的均值s。1.4.2彩色形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)應(yīng)用北京航空航天大學(xué)圖像中心分析軟件。1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用藥前后組間樣本比擬采用t檢驗(yàn)。2結(jié)果結(jié)果見(jiàn)表13。表1瑞香狼毒組兩肺癌細(xì)胞株中3種基因蛋白表達(dá)(輝度)的比擬略表2TNF組兩肺癌細(xì)胞株中3種基因蛋白表達(dá)(輝度)的比擬略表3結(jié)合用藥組兩肺癌細(xì)胞株中3種基因蛋白表達(dá)(輝度)的比擬略3討論祖國(guó)醫(yī)學(xué)典籍中記載瑞香狼毒盛產(chǎn)于河北、山西、四川等地,其性味苦、平、辛、有毒,入肝、肺、脾三經(jīng),有逐水、祛痰、破積、殺蟲(chóng)之成效1。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)瑞香狼毒抗腫瘤方面的成效進(jìn)展了深化研究，獲

12、得了打破性的進(jìn)展。TNF是由激活的單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的一種可溶性多功能細(xì)胞因子,具有很強(qiáng)的抗腫瘤活性2。其抗腫瘤機(jī)制為:特異性地直接殺傷腫瘤細(xì)胞；誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡3；逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多耐藥,增加化療敏感性3；抗腫瘤血管生成4；增加免疫效應(yīng)細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用3。本研究結(jié)果顯示瑞香狼毒和TNF對(duì)兩種肺癌細(xì)胞株的3種基因蛋白的表達(dá)有明顯抑制作用，并且結(jié)合用藥組其抑制蛋白表達(dá)的作用明顯增強(qiáng)。提示瑞香狼毒和TNF阻斷/降低了耐藥基因產(chǎn)物的表達(dá)，即抑制了基因的活性。本研究選用的3種基因蛋白(D2、LRP和HSP27)是目前公認(rèn)的存在于對(duì)多種化療藥物耐受的惡性腫瘤中，與多種惡性腫瘤的耐藥有關(guān)58。國(guó)外有研究

13、顯示,LRP在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)明顯高于小細(xì)胞肺癌,這與本研究結(jié)果相吻合。D2，LRP和HSP27基因及其表達(dá)的蛋白質(zhì)在多藥耐藥中各自的作用機(jī)制及其互相關(guān)系非常復(fù)雜,目前尚不明確。本研究說(shuō)明,結(jié)合用藥組兩種肺癌細(xì)胞株中3種基因蛋白的表達(dá)明顯減弱，與用藥前相比有顯著差異(P0.05),提示在臨床上假如結(jié)合這兩種藥物治療肺癌可能會(huì)進(jìn)步化療效果。結(jié)果還顯示兩種肺癌細(xì)胞株對(duì)瑞香狼毒組和TNF組的反響表現(xiàn)出細(xì)微的差異，個(gè)別耐藥基因的表達(dá)用藥前后差異無(wú)顯著性(P0.05)，提示盡管在不同病理類型的肺癌細(xì)胞中瑞香狼毒提取物和TNF均表現(xiàn)出降低肺癌細(xì)胞基因蛋白表達(dá)的作用，但其作用機(jī)制可能存在著差異，為深化提

14、醒瑞香狼毒和TNF降低肺癌細(xì)胞基因蛋白表達(dá)的作用機(jī)制，還需從基因和蛋白程度進(jìn)一步研究證實(shí)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1羅慧英，王愛(ài)勤.不同極性溶媒瑞香狼毒提取物的抗腫瘤活性比擬J.中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2022，10(10):1140.2周清華，侯梅，李潞，等.新型重組人腫瘤壞死因子治療非小細(xì)胞肺癌的多中心期臨床隨機(jī)試驗(yàn)J.中國(guó)肺癌雜志，2022，6(1)：42.3LeeKY,hang,QiuD,eta.lPG490(triptlide)peratesithtu-ernersisfatralphatindueapptsisintuerellsJ.JBilhe,1999,274:13451.4Lasek,Gierasz,KuK,eta.lPtentiatinftheznti-tureffetfatiyinDbyturnersisfatralphainie:rrelatinbeteeninvitrandvivresultsJ.IntJaner,1996,66:374.5HarrisL.D2splievariantsandthEirtherapeutiipliatinsJ.urranerDrugTargets.2022,5(1):21.6RayburnE,ZhangR,HeJ,angH.D2andhuanalignanies:expressin,linialpathlgy,prgnst