基于新型微腔體微波反應(yīng)器的微波輔助衍生-氣相色譜質(zhì)譜法 快速測定水果中的有機(jī)酸

1、基于新型微腔體微波反應(yīng)器的微波輔助衍生-氣相色譜質(zhì)譜法 快速測定水果中的有機(jī)酸有機(jī)酸是存在于食品中的一類重要風(fēng)味物質(zhì)，是構(gòu)成食品酸味的主要成分，其種類和含量對食品酸度和風(fēng)味都有重要影響1-2。食品中有機(jī)酸的種類很多，主要來源于原材料和生產(chǎn)發(fā)酵過程中,同時由于保存或者風(fēng)味的需要，會添加山梨酸、苯甲酸、檸檬酸等功能性添加劑，這些功能性添加劑也是食品中有機(jī)酸的重要來源之一3-4。因此，檢測食品中有機(jī)酸的種類及含量，可對食品的風(fēng)味和品質(zhì)進(jìn)行監(jiān)控，有利于提升產(chǎn)品的質(zhì)量。目前國內(nèi)外關(guān)于有機(jī)酸定性定量的方法主要有離子色譜法5、毛細(xì)管電泳法6、液相色譜法7、氣相色譜法等8。離子色譜、毛細(xì)管電泳、液相色譜法主要

2、用于含量高的多元酸和多羥基酸的分析。其中只有衍生化前處理-GC-MS方法可以實(shí)現(xiàn)揮發(fā)性和非揮發(fā)性有機(jī)酸的同時檢測。然而，傳統(tǒng)的衍生化過程操作繁瑣且耗時，因此發(fā)展了縮短衍生反應(yīng)時間的方法如微波輔助衍生9、超聲輔助衍生化10和固相載體衍生11等。其中微波衍生法較傳統(tǒng)的加熱衍生方法能夠提高衍生反應(yīng)效率，明顯加快反應(yīng)速率12-15。AMENDOLA等16運(yùn)用微波輔助衍生結(jié)合氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測定了人尿中的利尿劑，結(jié)果利尿劑衍生從傳統(tǒng)加熱法的3 h大幅度縮短至10 min，并改善了方法的檢出限。LIEBEKE等17運(yùn)用微波輔助甲氧胺和N-甲基-N-三甲基硅基氟乙酰胺硅烷化衍生法結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法

3、對細(xì)菌代謝產(chǎn)物進(jìn)行了代謝組學(xué)研究，衍生反應(yīng)時間由加熱法的2 h減少到6 min，且不會丟失衍生代謝組樣品的定性或定量信息。但目前已報道的微波衍生反應(yīng)器18-19多為微波萃取合成反應(yīng)器或家用微波爐改裝的傳統(tǒng)諧振腔反應(yīng)系統(tǒng)，需使用較高的微波功率以保證諧振腔內(nèi)的微波能量密度，同時由于諧振腔中微波多次反射產(chǎn)生不可預(yù)測的多模態(tài)，很難對衍生反應(yīng)的升溫過程進(jìn)行平穩(wěn)、精準(zhǔn)的控制，常因升溫速度過高導(dǎo)致樣品過熱等問題，造成衍生副反應(yīng)、熱敏成分分解、溶液過熱蒸發(fā)將揮發(fā)性衍生產(chǎn)物帶出反應(yīng)器等問題，影響了分析結(jié)果的的準(zhǔn)確性和精密度。由于傳統(tǒng)諧振腔反應(yīng)系統(tǒng)通常采用開口燒瓶為反應(yīng)容器，瓶口需設(shè)置冷凝裝置，整個反應(yīng)器結(jié)構(gòu)復(fù)雜

4、、體積大、操作繁瑣，亦制約了其在分析中的應(yīng)用。聚焦式微波系統(tǒng)20-21，如CEM公司的環(huán)形聚集微波反應(yīng)系統(tǒng)，具有明顯的單模態(tài)微波輻射特征，改善了微波處理過程樣品的升溫穩(wěn)定性和溫度分布均勻性，克服了傳統(tǒng)諧振腔微波反應(yīng)器的不足，在合成、萃取及分析樣品前處理等領(lǐng)域的應(yīng)用受到廣泛關(guān)注22-23。本文針對食品風(fēng)味成分色譜柱前快速衍生處理的需要，對已有聚焦式微波反應(yīng)系統(tǒng)進(jìn)行了改進(jìn)，提出了一種新型微腔體微波反應(yīng)器，結(jié)合已有的低溫微波色譜柱前系統(tǒng)，建立了有機(jī)酸的微波輔助衍生-氣相色譜質(zhì)譜法(microwave-assisted derivatization-gas chromatography mass sp

5、ectrometry，MAD-GC-MS)分析方法，并用于水果中琥珀酸和檸檬酸2種有機(jī)酸的分析。本文的研究旨在改善傳統(tǒng)諧振腔微波反應(yīng)器在色譜柱前處理中存在的諸多問題，為微波技術(shù)在食品分析中的實(shí)際應(yīng)用提供新的技術(shù)手段。1 材料與方法1.1 材料與試劑檸檬、獼猴桃、番木瓜，當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場；琥珀酸、檸檬酸(純度大于99.5%)、正己烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇(均為色譜純)、濃硫酸(優(yōu)級純)，阿拉丁試劑(上海)有限公司；實(shí)驗用水為二次蒸餾水。琥珀酸和檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：均為1.0 mg/mL甲醇溶液，于4 避光保存；H2SO4-CH3OH混合衍生試劑：取80 mL冷凍后的甲醇于200 mL燒杯中，于冰水浴

6、中邊攪拌邊緩慢加入20%濃硫酸(體積分?jǐn)?shù))，充分混勻后4 保存。1.2 儀器與設(shè)備THERMOF I SHER ISQ氣相色譜-質(zhì)聯(lián)用儀，賽默飛世爾科技有限公司；GC-2022C氣相色譜儀，日本島津公司；KQ-250DA數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；TEST0 865紅外熱像儀，德國德圖公司；輕舟低溫微波色譜柱前系統(tǒng)及多模式PC控制軟件，功率200 W，同軸輸出，內(nèi)設(shè)光纖溫度控制模塊，直徑1 mm熒光光纖溫度傳感器，云南民族大學(xué)研制。1.3 實(shí)驗方法1.3.1 微腔體微波反應(yīng)器及系統(tǒng)本文研制的微腔體微波反應(yīng)器結(jié)構(gòu)如圖1-a所示，該反應(yīng)器由小型反應(yīng)管、微波輻射器和微型腔體三部分組成。

7、反應(yīng)管是一圓底鉗口高硼玻璃小管(10.0 mL)，配有內(nèi)設(shè)組合式密封墊的鋁壓蓋，組合式密封墊由聚四氟乙烯層、硅膠層和屏蔽微波的鋁箔層構(gòu)成。而微波輻射器為一小型微帶微波天線，微型腔體為金屬材質(zhì)，具有與反應(yīng)管相匹配內(nèi)徑的微波輻射器通過法蘭連接盤連接。使用時，取待處理溶液于反應(yīng)管中，在組合式密封墊中設(shè)一小孔，使用壓蓋鉗將組合式密封墊和鋁壓蓋壓緊于反應(yīng)管管口，密封后的反應(yīng)管置于微型腔體中，將光纖溫度傳感器穿過密封墊片小孔浸入反應(yīng)管內(nèi)的溶液中，使用同軸電纜將其同軸輸入接口與微波色譜柱前系統(tǒng)主機(jī)的同軸輸出接口連接(圖1-b)，光纖溫度傳感器與光纖溫度傳感接口連接，設(shè)置微波功率為30 W，控制溫度為85 ,

8、 處理時間為4 min，開啟微波系統(tǒng)，對反應(yīng)管中的樣品溶液進(jìn)行處理，反應(yīng)完成后取出反應(yīng)管，放置至冷卻。a-微波反應(yīng)器結(jié)構(gòu)圖；b-系統(tǒng)實(shí)物圖圖1 微腔體微波反應(yīng)器結(jié)構(gòu)圖和系統(tǒng)實(shí)物圖Fig.1 The structure drawing of microcavity microwave reactor and the physical map of system1.3.2 色譜分析條件氣相色譜分析條件：色譜柱SH-Rtx-1毛細(xì)管柱(30 m0.25 mm，ID 0.25 m)；進(jìn)樣口230 ；FID檢測器250 ；分流進(jìn)樣，分流比101；柱流速1.0 mL/min；溶劑延遲3 min；進(jìn)樣量1.

9、0 L；升溫程序：初始溫度80 ，保持2.0 min，以10 /min的速率升溫至170 ，保持2.0 min，再以15 /min的速率升溫至200 ；載氣(N2)流速0.8 mL/min，空氣流速400 mL/min，氫氣流速40 mL/min。GC-MS分析條件：TR-1MS色譜柱(30 m0.25 mm，ID 0.25 m)，分析條件同上。MS條件：EI電離源；電子能量70 eV；離子源溫度300 ；傳輸線溫度250 ；質(zhì)量掃描范圍35650 amu。1.3.3 樣品處理和測定分別移取1.00 mL待處理有機(jī)酸分析溶液至2只10 mL反應(yīng)管中，分別加入2.00 mL分?jǐn)?shù)為20%的H2SO

10、4-CH3OH衍生試劑，搖勻，設(shè)置微波功率為30 W，控制溫度為85 ，微波處理時間為4 min，待反應(yīng)完成后，取出反應(yīng)管放置至冷卻，5 000 r/min離心5 min，取上清液1.00 mL于5 mL離心管中，再加入1.00 mL蒸餾水和500 L三氯甲烷，超聲萃取5 min，5 000 r/min離心2 min，用帶有0.45 m微孔濾膜的進(jìn)樣槍取250 L三氯甲烷層液至進(jìn)樣瓶中，進(jìn)行氣相色譜或GC-MS分析。1.3.4 樣品處理和測定取新鮮檸檬、獼猴桃或番木瓜樣品洗凈，去皮除芯，切成小塊，稱取1.0 g于10 mL離心管，用手持式電動組織研磨器磨細(xì)，加入10 mL甲醇，超聲提取10 m

11、in，5 000 r/min離心5 min，取上清液1.0 mL，按照1.3.3衍生后進(jìn)行分析，記錄峰面積，采用外標(biāo)法計算有機(jī)酸的含量。2 結(jié)果與分析2.1 微腔體微波反應(yīng)器及性能研究與傳統(tǒng)諧振腔微波反應(yīng)器采用的設(shè)有冷凝裝置的開口燒管反應(yīng)容器不同，本研究所設(shè)計的微型化微腔體微波衍生反應(yīng)器(圖1-a)，反應(yīng)容器采用密封的小型反應(yīng)管，待處理樣品溶液量明顯減少(3 mL)。用紅外成像法研究了微波處理過程反應(yīng)管內(nèi)樣品溶液的溫度分布及變化，圖2-a為30 W小功率微波處理4 min后反應(yīng)管內(nèi)的紅外成像圖。由圖2可知,反應(yīng)管內(nèi)樣品溶液的溫度呈現(xiàn)明顯的均勻分布狀態(tài)，這可歸因于微腔體微波反應(yīng)器微波能從底部定向

12、饋入，靠近底部的溶液被迅速加熱形成向上的快速熱對流即“微波攪拌”作用所致。圖2-b是30 W小功率微波處理過程樣品溶液時中心部位的升溫曲線。由圖2-b可知，處理時間從1 min增加至5 min，升溫曲線呈現(xiàn)了良好的線性，樣品溫度從25 勻速上升至90 ，且多次測量結(jié)果具有較高的精密度。a-紅外熱成像圖；b-升溫曲線圖2 微波預(yù)處理后樣品的紅外熱成像圖及升溫曲線Fig.2 The infrared thermal image of sample after microwave pretreatment and the heating curve傳統(tǒng)的諧振腔微波反應(yīng)器由于微波的諧振作用，存在多個相

13、互疊加的多模態(tài)微波輻射，通常需要使用較大的微波功率以保證大體積諧振腔內(nèi)的功率密度，因此極性樣品在諧振腔內(nèi)升溫非常迅速，適于快速干燥、灰化、熱解或消解等需較高溫度的“強(qiáng)”處理過程，但對于需要“低溫”(低于液體沸點(diǎn))的衍生等“弱”處理過程，諧振腔中多模態(tài)微波具有不可預(yù)測性，升溫過程難于進(jìn)行精準(zhǔn)控制，極性液體樣品強(qiáng)吸收微波迅速升溫導(dǎo)致水分過熱蒸發(fā)，造成大量揮發(fā)性衍生產(chǎn)物被水蒸氣帶出反應(yīng)器，或熱敏目標(biāo)物質(zhì)的熱分解，難以保證分析結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。本文設(shè)計的微腔體微波反應(yīng)器，由于腔體體積明顯小于傳統(tǒng)諧振腔不會產(chǎn)生諧振作用，其導(dǎo)波作用可將微波從底部完全定向饋入樣品中，使用小功率微波就能保證樣品內(nèi)的微波密

14、度，具有單模態(tài)微波可控性好的的特征。由圖2的實(shí)驗結(jié)果可知，采用小功率微波對小量樣品進(jìn)行處理，在保證了微波過程快速高效的同時，實(shí)現(xiàn)了處理過程升溫的勻速平穩(wěn)、均勻可控，結(jié)合精準(zhǔn)的光纖溫度傳感控溫模塊，可有效將衍生反應(yīng)溫度控制在所需的溫度范圍內(nèi)，彌補(bǔ)了諧振腔微波反應(yīng)器在色譜柱前衍生處理應(yīng)用中的不足，對于改善微波衍生色譜方法的準(zhǔn)確性、可靠性具有重要意義。2.2 衍生物GC-MS鑒定及氣相色譜分析將質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的琥珀酸和檸檬酸2種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)混合液置于反應(yīng)管中，根據(jù)1.3.3微波甲酯化衍生操作步驟進(jìn)行微波衍生，采用全波長掃描模式對2種有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生物進(jìn)行GC-MS分析，衍生物的質(zhì)譜

15、圖如圖3所示，圖3-a和圖3-b分別對應(yīng)的琥珀酸和檸檬酸的甲酯化衍生產(chǎn)物琥珀酸二甲酯和檸檬酸三甲酯。進(jìn)一步用氣相色譜法對琥珀酸和檸檬酸2種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)混合液的微波衍生產(chǎn)物進(jìn)行分析，結(jié)果如圖4所示。由圖4-a可知，氣相色譜流出峰中，琥珀酸和檸檬酸衍生產(chǎn)物琥珀酸二甲酯和檸檬酸三甲酯的保留時間分別為5.29 min和11.25 min。在上述基礎(chǔ)上，根據(jù)1.3.4的操作，對檸檬、獼猴桃和番木瓜3種樣品進(jìn)行微波輔助衍生，衍生產(chǎn)物進(jìn)行氣相色譜分析，結(jié)果分別見圖4-b、圖4-c和圖4-d，結(jié)果表明，3種樣品均在保留時間5.29 min和11.25 min處分別出現(xiàn)了明顯的琥珀酸二甲酯和檸檬酸三甲酯峰，表明該

16、方法可適用于新鮮水果中琥珀酸和檸檬酸的測定。2.3 微波輔助衍生條件優(yōu)化2.3.1 硫酸體積分?jǐn)?shù)及衍生劑用量的選擇本文采用H2SO4-CH3OH混合衍生劑對檸檬酸和琥珀酸2種有機(jī)酸進(jìn)行微波衍生化處理，測定色譜峰面積。首先考察了混合衍生劑中硫酸體積分?jǐn)?shù)對有機(jī)酸衍生物色譜峰面積的影響，結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，隨著硫酸體積分?jǐn)?shù)的不斷增大，檸檬酸的色譜峰面積先增加后減小，當(dāng)體積分?jǐn)?shù)為20%時，色譜峰面積達(dá)到最高，但當(dāng)體積分?jǐn)?shù)大于20%時，色譜峰面積隨之降低；對于琥珀酸，硫酸體積分?jǐn)?shù)從5%增加至20%，色譜峰面積呈緩慢增長趨勢，超過20%則隨之下降。由圖5可以看出，硫酸體積分?jǐn)?shù)對檸檬酸色譜峰面積的影

17、響明顯高于琥珀酸，但硫酸體積分?jǐn)?shù)為20%時，2種有機(jī)酸色譜峰面積均達(dá)到最大，因此，可選擇20%的硫酸體積分?jǐn)?shù)進(jìn)行后續(xù)研究。圖6為衍生劑用量對色譜峰面積的影響，當(dāng)衍生劑用量低于1.0 mL時，2種有機(jī)酸衍生物的色譜峰面積均呈增加趨勢，且均在衍生劑用量為1.0 mL時達(dá)最大，衍生劑用量超過1.0 mL時2種有機(jī)酸衍生物的色譜峰面積均呈下降趨勢，本文選擇1.0 mL進(jìn)行后續(xù)的研究。a-琥珀酸衍生物；b-檸檬酸衍生物圖3 琥珀酸衍生物和檸檬酸衍生物的質(zhì)譜圖Fig.3 The mass spectrograms of succinic acid derivatives and citric acid d

18、erivativesa-混合標(biāo)液；b-檸檬；c-獼猴桃；d-番木瓜；1-琥珀酸二甲酯；2-檸檬酸二甲酯圖4 琥珀酸和檸檬酸混合標(biāo)液、檸檬、獼猴桃和番木瓜中有機(jī)酸衍生物的氣相色譜圖Fig.4 The gas chromatograms of organic acid derivatives in standard solutions, lemon sample, kiwi sample and papaya sample2.3.2 微波衍生功率和時間對衍生效果的影響圖7和圖8分別為微波功率和微波衍生時間對2種有機(jī)酸衍生物色譜峰面積的影響。圖7結(jié)果表明，隨著微波功率從10 W增加到30 W，2種有

19、機(jī)酸衍生物色譜峰面積隨著微波功率增加而增加，30 W時達(dá)到最大，其后開始下降。進(jìn)一步由圖8可知，在30 W微波功率條件下，隨著微波衍生時間延長至4 min時，2種有機(jī)酸衍生物色譜峰面積均趨于最大，據(jù)此本文選擇30 W微波功率和4 min衍生處理進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗。圖5 硫酸體積分?jǐn)?shù)對衍生物峰面積的影響Fig.5 The effect of volume fraction of H2SO4on peak areas of two derivatives圖6 衍生劑用量對衍生物峰面積的影響Fig.6 The effect of amount of derivation agent on peak are

20、as of two derivatives圖7 微波功率對衍生物峰面積的影響Fig.7 The effect of microwave powers on peak areas of two derivatives圖8 微波衍生時間對衍生物峰面積的影響Fig.8 The effect of microwave derivatization time on peak areas of two derivatives圖7中值得注意的是，微波功率對2種有機(jī)酸衍生的衍生效率有較大影響，當(dāng)微波功率分別超過30 W或40 W時，琥珀酸和檸檬酸衍生物色譜峰面積分別開始迅速下降，同時觀察到反應(yīng)管上部外壁出現(xiàn)水

21、珠凝結(jié)，這說明微波功率過大可導(dǎo)致樣品溶液升溫過快產(chǎn)生過熱蒸發(fā)，管內(nèi)壓力增加影響其密閉性，造成衍生物被水蒸汽帶出反應(yīng)管，導(dǎo)致衍生物損失所致。結(jié)合圖5和圖6的結(jié)果，當(dāng)硫酸體積分?jǐn)?shù)或衍生劑用量分別超過20%或1.0 mL時，色譜峰面積均現(xiàn)呈明顯減少趨勢，同時也可觀察到此時反應(yīng)管外壁出現(xiàn)水珠凝結(jié)，說明樣品溶液中硫酸增加到一定濃度，同樣可導(dǎo)致樣品溶液過熱蒸發(fā)造成衍生物逸出損失的問題。2.4 本法與其他方法對照取2種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，在衍生劑用量為1.0 mL、微波功率為30 W、反應(yīng)時間為4 min最佳衍生條件下，測定了2種有機(jī)酸衍生物的氣相色譜峰面積。與相同濃度有機(jī)酸的超聲輔助衍生、常規(guī)水浴加熱衍生

22、的測定結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果如表1所示。由表1可知本文的微波衍生法測定的2種有機(jī)酸衍生物的峰面積最大，明顯高于超聲輔助衍生和傳統(tǒng)加熱衍生。表明該方法不僅可以顯著加快有機(jī)酸的甲酯化衍生反應(yīng)速率，提高前處理的效率，且衍生效果明顯優(yōu)于常規(guī)衍生方法，可提高分析的靈敏度，有效改善方法的準(zhǔn)確性和精密度。本文設(shè)計的微腔體微波反應(yīng)器能夠顯著改善衍生反應(yīng)速率、提高衍生效率的結(jié)果與已有諧振腔微波反應(yīng)器微波衍生的研究相符12-15。表1 不同衍生方式的峰面積測定結(jié)果比較Table 1 The peak areas of three different derivatization methods2.5 方法性能指標(biāo)2.

23、5.1 線性關(guān)系采用本文的微波衍生方法，在優(yōu)化條件下測定兩種有機(jī)酸的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以目標(biāo)物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得到各目標(biāo)物線性關(guān)系，以R2 0.99為判斷指標(biāo)，確定各目標(biāo)物的線性范圍，具體參數(shù)見表2。由表2可知，在質(zhì)量濃度為0.105.0 mg/mL時，2種目標(biāo)物的R2均達(dá)到0.999以上，表明2種有機(jī)酸濃度與峰面積具有良好的線性關(guān)系，能夠滿足分析要求。表2 線性回歸方程及檢出限Table 2 The equation of linear regression and detection limits2.5.2 加標(biāo)回收和精密度實(shí)驗分別取檸檬、獼猴桃和番木瓜樣品，按照1.3.4方法處理后測定其含量，并如表3所示進(jìn)行加標(biāo)回收試驗。結(jié)果表明，檸檬，獼猴桃和番木瓜不同加標(biāo)量下，2種有機(jī)酸的回收率為98.34%102.52%，相對標(biāo)準(zhǔn)差(relative standard deviation，RSD)為1.63%3.25%(n=6)，