常用分析儀器使用與維護(hù) 第五章高效液相色譜儀

1、 第五章 高效液相色譜儀第一節(jié) 高效液相色譜儀的結(jié)構(gòu)一、高效液相色譜儀的分類按色譜過程的分離機(jī)制分：(1)吸附色譜法 固定相為吸附劑，靠組分在吸附劑上的吸附系數(shù)（吸附能力）的差別而達(dá)到分離 (2)分配色譜法 固定相為液態(tài)，利用樣品組分在固定相與流動(dòng)相中的溶解度不同所產(chǎn)生的分配系數(shù)差別而達(dá)到分離的 (3)空間排阻色譜法 采用凝膠作為固定相，依樣品組分的分子尺寸與凝膠孔徑間的關(guān)系即滲透系數(shù)的差別而分離 (4)離子交換色譜法 采用離子交換樹脂作為固定相，依樣品離子與固定相表面離子交換基團(tuán)的交換能力（交換系數(shù)）的差別而分離 (5)親和色譜法 利用蛋白質(zhì)或生物大分子與固定相表面上配基的專屬性親和力進(jìn)行分

2、離 (6)化學(xué)鍵合相色譜法 將固定相的官能團(tuán)鍵合在載體表面，所形成的固定相稱為化學(xué)鍵合相 二、高效液相色譜儀的結(jié)構(gòu)輸液系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測(cè)系統(tǒng)和色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)組成:高效液相色譜儀的組成 (一) 輸液系統(tǒng)1.貯液罐存放洗脫液 2.高壓輸液泵將液體送入液路系統(tǒng) 恒流泵恒壓泵按其工作原理 3.流量控制裝置消除柱壓過高對(duì)分離造成的影響 4.梯度洗脫裝置 （二）進(jìn)樣系統(tǒng)1.注射進(jìn)樣器 2.高壓進(jìn)樣閥 六通高壓進(jìn)樣閥工作示意圖 遼寧石化職業(yè)技術(shù)學(xué)院（三）分離系統(tǒng)色譜柱 裝柱方法:濕法裝柱和干法裝柱（四）檢測(cè)系統(tǒng)1紫外吸收檢測(cè)器2.熒光檢測(cè)器熒光檢測(cè)器 紫外吸收檢測(cè)器 遼寧石化職業(yè)技術(shù)學(xué)院3示差

3、折光率檢測(cè)器 反射型示差折光率檢測(cè)器 4.電化學(xué)檢測(cè)器 薄層安培檢測(cè)器 （五）色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄儀、積分儀或色譜工作站 遼寧石化職業(yè)技術(shù)學(xué)院第二節(jié) 高效液相色譜儀的使用一、高效液相色譜儀的檢定1輸液泵的檢定 2. 色譜柱的檢定 3檢測(cè)器的檢定連接 啟動(dòng)儀器 設(shè)定流量 記錄 選擇最靈敏擋 4儀器測(cè)量精度的檢定 5儀器測(cè)量準(zhǔn)確度的檢定 遼寧石化職業(yè)技術(shù)學(xué)院二、高效液相色譜儀的主要操作提示1.貯液器的操作純?nèi)軇┝鲃?dòng)相不過濾，其它使用前必須用0.45m的濾膜過濾 2.輸液泵的操作每次使用之前應(yīng)放空排除氣泡 更換流動(dòng)相時(shí)一定要注意流動(dòng)相之間的互溶性問題 如用緩沖溶液作流動(dòng)相或已一段時(shí)間不使用泵，結(jié)束后

4、先用超純水或去離子水洗， 后用純甲醇或乙腈沖洗。不要使用多日存放的蒸餾水及磷酸鹽緩沖溶液 清洗溶劑過濾頭 儀器使用一段時(shí)間后，卸下過濾器的壓帽，取出密封環(huán)和燒結(jié)不銹鋼過濾片一同清洗 使用緩沖溶液時(shí)，應(yīng)該經(jīng)常清洗柱塞桿后部的密封圈 如果泵長(zhǎng)時(shí)間不用，必須用去離子水清洗泵頭及單向閥 應(yīng)定期更換密封圈 實(shí)驗(yàn)室應(yīng)常備密封圈、各式接頭、保險(xiǎn)絲等 3.進(jìn)樣器的操作遼寧石化職業(yè)技術(shù)學(xué)院樣品瓶應(yīng)清洗干凈 使用平頭進(jìn)樣針進(jìn)樣 自動(dòng)進(jìn)樣器的針頭應(yīng)有鈍化斜面 每次工作結(jié)束后應(yīng)沖洗整個(gè)系統(tǒng) 4.色譜柱的操作在進(jìn)樣閥后加流路過濾器 在流路過濾器和分析柱之間加上“保護(hù)柱” 流動(dòng)相流速不可一次改變過大 色譜柱應(yīng)在要求的pH

5、范圍和柱溫范圍下使用 樣品量不應(yīng)過載，進(jìn)樣前樣品應(yīng)凈化 應(yīng)使用不損壞柱的流動(dòng)相 每次工作結(jié)束后，應(yīng)用強(qiáng)溶劑（乙腈或甲醇）沖洗色譜柱 柱子應(yīng)定期進(jìn)行清洗 色譜柱使用一段時(shí)間后，必須進(jìn)行再生處理 對(duì)于阻塞或受傷嚴(yán)重的柱子，必要時(shí)可卸下不銹鋼濾板，超聲洗去濾板阻塞物 5.檢測(cè)器的清洗遼寧石化職業(yè)技術(shù)學(xué)院硝酸溶液（14）超聲清洗純水和甲醇溶液清洗組裝6.色譜柱的裝填干法裝柱 濕法裝柱 濕法下行勻漿裝柱示意圖 7.色譜柱的平衡純乙睛或甲醇作流動(dòng)相 低流速0. 2mL/min將色譜柱平衡過夜 色譜柱的填料充分平衡至最佳狀態(tài) 流速增加到0. 8mL/min沖洗30min8.色譜柱的再生遼寧石化職業(yè)技術(shù)學(xué)院正

6、相填料 反相填料 陰離子交換填料 陽(yáng)離子交換填料 弱保留蛋白質(zhì)凝膠過濾填料 強(qiáng)保留蛋白質(zhì)凝膠過濾填料 三、高效液相色譜儀的一般操作程序1.操作前的準(zhǔn)備配制足量的流動(dòng)相配制供試品溶液檢查使用記錄本和儀器狀態(tài)2.泵的操作遼寧石化職業(yè)技術(shù)學(xué)院流動(dòng)相沖洗過濾器 過濾器浸入流動(dòng)相 啟動(dòng)泵 開泵的排放閥 充泵排氣 流速逐步回零或停止沖洗關(guān)閉排放閥調(diào)流速3UVD和色譜數(shù)據(jù)處理機(jī)的操作開啟檢測(cè)器 選擇光源、選定檢測(cè)波長(zhǎng) 設(shè)置吸光度方式和檢測(cè)時(shí)間 開啟色譜處理機(jī) 初步設(shè)定 進(jìn)行檢測(cè)器回零 記錄基線 4進(jìn)樣操作(六通閥式)5色譜數(shù)據(jù)的收集和處理待最后一峰出完后，繼續(xù)走一段基線，確認(rèn)再無(wú)組分流出，方能結(jié)束記錄 6.

7、清洗和關(guān)機(jī) 關(guān)檢測(cè)器和數(shù)據(jù)處理機(jī) 清洗色譜系統(tǒng) 關(guān)閉電源 遼寧石化職業(yè)技術(shù)學(xué)院四、Waters515型高效液相色譜儀的使用1.Waters515型高效液相色譜儀的構(gòu)造特點(diǎn)Waters515型高效液相色譜儀 波長(zhǎng)范圍：190700nm 基線噪聲0.3510-5AU 測(cè)量范圍：0.00014.0AUFS2Waters515型高效液相色譜儀的使用方法配制好作為流動(dòng)相的溶劑 超聲波脫氣后裝入貯液瓶 插入輸液管開儀器電源 設(shè)置流量 設(shè)定壓力上限 開啟紫外檢測(cè)器電源 調(diào)背景信號(hào)為零，設(shè)置靈敏度范圍 開啟色譜工作站，設(shè)置各參數(shù) 進(jìn)樣閥手柄置于“Load” 樣品保持手柄開啟 吸取試樣溶液 手柄旋回關(guān)閉 手柄置

8、于“Inject(進(jìn)樣)” 記錄色譜圖 測(cè)定結(jié)束，關(guān)閉計(jì)算機(jī)、檢測(cè)器及高壓泵等 遼寧石化職業(yè)技術(shù)學(xué)院本節(jié)結(jié)束第三節(jié) 高效液相色譜儀的維護(hù)與保養(yǎng)一、儀器的安裝要求環(huán)境溫度 房間內(nèi)相對(duì)濕度 避免太陽(yáng)直射 避免恒流泵安裝在能產(chǎn)生強(qiáng)磁場(chǎng)的儀器附近 使用易燃或有毒溶劑時(shí)，要保證室內(nèi)有良好的通風(fēng) 避免在有腐蝕性氣體或大量灰塵的地方安裝儀器 儀器必須安裝在平整、無(wú)振動(dòng)的堅(jiān)固臺(tái)面 色譜儀必須有良好的接地 二、儀器的維護(hù)保養(yǎng)(1)泵的保養(yǎng)(2)進(jìn)樣器的保養(yǎng)(3)柱的保養(yǎng)(4) 檢測(cè)器的保養(yǎng)三、常見故障的排除遼寧石化職業(yè)技術(shù)學(xué)院1.貯液瓶和脫氣裝置污染后可用稀硝酸沖洗2.泵1、泵不工作 2、泵不能輸送溶劑 3、泵

9、頭泄漏 4、流速不穩(wěn) 5、噪聲 3.進(jìn)樣器手動(dòng)進(jìn)樣器 自動(dòng)進(jìn)樣器 4.色譜柱5.檢測(cè)器6.其他故障 遼寧石化職業(yè)技術(shù)學(xué)院常見故障原因解決辦法保留時(shí)間縮短流速增加樣品超載柱填料流失流動(dòng)相組成變化溫度增加檢查泵，重新設(shè)定流速降低樣品量流動(dòng)相pH值保持在38,檢查柱的方向防止流動(dòng)相蒸發(fā)或沉淀加柱溫控制器、保持實(shí)驗(yàn)室溫度恒定保留時(shí)間延長(zhǎng)流速下降填料流失流動(dòng)相組成變化溫度降低管路泄漏，更換泵密封圈，排除泵內(nèi)氣泡流動(dòng)相pH值保持在38,檢查柱的方向防止流動(dòng)相蒸發(fā)或沉淀加柱溫控制器，保持實(shí)驗(yàn)室溫度恒定基線噪聲氣泡（尖銳峰）污染（隨機(jī)噪聲）檢測(cè)器燈連續(xù)噪聲電干擾（偶然噪聲）檢測(cè)器中有氣泡流動(dòng)相脫氣清洗柱，凈化

10、樣品，用HPLC級(jí)試劑更換氘燈采用穩(wěn)壓電源，檢查干擾的來源流動(dòng)相脫氣常見故障原因解決辦法出現(xiàn)肩峰或色譜峰分叉樣品溶劑過強(qiáng)柱塌陷或形成短路通道柱內(nèi)燒結(jié)不銹鋼板（篩板）失效進(jìn)樣器損壞采用較弱的樣品溶劑，用流動(dòng)相溶解樣品填補(bǔ)柱填料或更換色譜柱更換燒結(jié)不銹鋼板（篩板），加在線過濾器，過濾樣品更換進(jìn)樣器轉(zhuǎn)子鬼峰進(jìn)樣閥殘余峰樣品中未知物柱未平衡水污染（反相）每次用后用強(qiáng)溶劑清洗閥，改進(jìn)閥和樣品的清洗處理樣品重新平衡柱，用流動(dòng)相作樣品溶劑（尤其是離子對(duì)色譜）通過變化平衡時(shí)間檢查水質(zhì)量，用二次水遼寧石化職業(yè)技術(shù)學(xué)院常見故障原因解決辦法峰拖尾柱超載峰干擾硅羥基作用柱內(nèi)燒結(jié)不銹鋼板（篩板）失效柱塌陷或形成短路通道死體積或柱外體積過大柱效下降降低樣品量，增加柱直徑，采用較高容量的固定相清潔樣品，調(diào)整流動(dòng)相加三乙胺，增加緩沖液濃度，降低流動(dòng)相pH值更換燒結(jié)不銹鋼板（篩板），加在線過濾器，過濾樣品更換色譜柱，采用較弱的腐蝕性條件接頭數(shù)降至最少，對(duì)所有接頭處作合適調(diào)整，盡可能采用細(xì)內(nèi)徑的連接管用較低腐蝕條件，更換柱，采用保護(hù)柱遼寧石化職業(yè)技術(shù)學(xué)院遼寧石化職業(yè)