DBXM159-2020 華支睪吸蟲卵檢測(cè)方法 PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR法

1、Q/LB.XXXXX-XXXX前言本文件按照GB/T 1.12020標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則的規(guī)定起草。本部分由長(zhǎng)春海關(guān)提出并歸口。 本部分起草單位： 長(zhǎng)春海關(guān)。 本部分主要起草人： 馬文晨、孟慶峰、王準(zhǔn)、王瑋琳、劉金華、孟日增、王偉利。華支睪吸蟲卵檢測(cè)方法范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了人糞便中華支睪吸蟲卵檢測(cè)方法的原理、試驗(yàn)條件、試劑與材料、儀器設(shè)備、樣品、試驗(yàn)步驟和試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理及試驗(yàn)報(bào)告。 本標(biāo)準(zhǔn)適用于人糞便中華支睪吸蟲卵核酸檢測(cè)。 規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的

2、引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T 6682 分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法 術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。實(shí)時(shí)熒光PCR real-time PCR在 PCR 擴(kuò)增時(shí)加入帶有熒光基團(tuán)的特異性探針(Taqman 探針) 或熒光染料, 使 PCR 產(chǎn)物的積累與熒光信號(hào)的積累完全同步, 實(shí)現(xiàn) PCR 產(chǎn)物的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。Ct 值 cyclethresholdvalue每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)?？s略語(yǔ)bp: 堿基對(duì)(base pair)CTAB: 十六烷基三甲基溴化銨(cetyltrithylammonium bromide)DNA: 脫氧核

3、糖核酸(deoxyribonucleic acid)dNTP: 脫氧核苷酸三磷酸(deoxyribonucleosidetriphosphate)EDTA: 乙二胺四乙酸(ethylene diaminetetraacetic acid)FAM:6-羧基熒光素(6-carboxyfluorescein)OD: 光密度值(optical density)PCR: 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chainreaction)Taq 酶: 從水生熱棲菌中分離出的具有熱穩(wěn)定性的 DNA 聚合酶(thermus aquaticu)TE:Tris-HCl、EDTA 緩沖液Tris: 三(羥甲基) 氨

4、基甲烷tris (hydroxymethyl) aminomethane試劑和材料除另有規(guī)定外, 試劑為分析純或生化試劑。 試驗(yàn)用水應(yīng)符合 GB/T 6682 中一級(jí)水的規(guī)定。 所有試劑均用無(wú) DNA 酶污染的容器分裝。液氮0.5 mol/L EDTA 緩沖液(pH 8.0)。CTAB 提取緩沖液 (2.0% ): 20 g/L CTAB, 0.1 mol/L Tris-HCl (pH 8.0 ), 1.4 mol/L NaCl,0.02 mol/L EDTA(pH 8.0)。CTAB 沉淀液(0.5% ):5 g/L CTAB,40 mmol/L NaCl。蛋白酶 K 溶液(20 mg/mL

5、)。NaCl 溶液(1.2 mol/L)。三氯甲烷。三氯甲烷 / 異戊醇(24 ：1，V/V)。異丙醇。70% 乙醇。TE 緩沖液:10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0),1 mmol/L EDTA 緩沖液(pH 8.0)。10PCR緩沖液：100 mmol/L KCl，160 mmol/L (NH4)2SO4, 20mmol/L MgSO4，200 mmol/L Tris-HCl (pH8.8)，1% Triton X-100，1 mg/ml BSA。如果具有等效的商品化試劑盒, 則可使用這些等效產(chǎn)品。熒光 PCR 反應(yīng)混合液:10 L 反應(yīng)體系包括:1 U 2 U(unit,

6、 酶學(xué)單位) 的 Taq 酶、1PCR緩沖液、2.5 mmol/L 4.0 mmol/L 的 Mg2+ 、0.2 mmol/L 的 d (A, C, G) TPs、0.2 mmol/L 0.4 mmol/L dUTP、400 nmol/L ROX 染料 ( 某些熒光 PCR 儀不需要 ROX 校正 )。如果具有等效的商品化試劑盒, 則可使用這些等效產(chǎn)品。普通PCR引物華支睪吸蟲的 PCR 檢測(cè)所用的引物序列見(jiàn)表1 。普通PCR引物序列名稱序列目的基因名稱5端引物5-TTGTCTGGGTAGGGTGGTTTG-3細(xì)胞色素c氧化酶亞基1 ( cox1 )基因3端引物5-ACTATCCCAGTAAC

7、CCCGCC-3實(shí)時(shí)熒光 PCR引物與探針: 華支睪吸蟲的實(shí)時(shí)熒光 PCR 檢測(cè)所用的引物和探針序列見(jiàn)表2 實(shí)時(shí)熒光 PCR引物序列名稱序列目的基因名稱5端引物5-TATAGTTTGTCTGGGTAGGGTGGTT-3細(xì)胞色素c氧化酶亞基1 ( cox1 )基因3端引物5-AACAGCAGTCCCCAAATCCA-3探針5-FAM-AGCTCATCATATGTTTACTG-MGB-3儀器和設(shè)備實(shí)時(shí)熒光 PCR 儀。離心機(jī)：離心力不小于 12 000 g。離心管（1.5 mL，2.0 mL）。核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計(jì)。微量移液器：2.5 L、20 L、100 L、200 L、1 000 L

8、。研缽或冷凍粉碎裝置。恒溫水浴鍋或干式恒溫器。天平：感量 0.01 g。檢驗(yàn)步驟用液氮充分研磨至糜狀;或采用合適的冷凍粉碎均質(zhì)裝置對(duì)樣品進(jìn)行充分地研磨至糜狀。稱取研磨后的樣品 200 mg 于 2.0 mL 離心管中，加入 1.5 mL 2.0% CTAB 提取緩沖液和 10 L 蛋白酶 K 溶液，65 30 min, 期間每隔10min振蕩混勻；12 000 g 離心 10 min，轉(zhuǎn)移上清于潔凈的離心管中。加 750 L 三氯甲烷 / 異戊醇，混勻，12 000 g 離心 5 min，轉(zhuǎn)移上清液于潔凈的離心管中加 2 倍體積 CTAB 沉淀液，室溫靜止 60 min，12 000 g 離心

9、 15 min，棄上清。加入350 L NaCl溶液將沉淀重懸浮。再加入 350 L 三氯甲烷，旋渦振蕩進(jìn)行混勻，12 000 g 離心 10 min。轉(zhuǎn)移上清后加入 0.6 倍體積的異丙醇用來(lái)沉淀核酸，室溫放置 20 min，12 000 g 離心 10 min，棄上清。加入 500 L 70% 乙醇洗滌一次，晾干。加入 100 L TE，溶解沉淀。立即使用或 20保存?zhèn)溆谩Ｒ部梢杂玫刃У?DNA 提取方法提取 DNA 模版?？墒褂玫刃У纳唐坊?DNA 提取試劑盒，按操作說(shuō)明書進(jìn)行操作。DNA 的濃度和純度測(cè)定樣品 DNA 使用核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計(jì)測(cè)定260 nm 和280 nm

10、處的吸光值 A260 和A280。 DNA 的濃度按式(1) 進(jìn)行計(jì)算:c=AN50( AUTONUM )式中：c DNA 濃度, 單位為納克每微升(ng/L);A 260 nm 處的吸光值;N 核酸稀釋倍數(shù)。當(dāng) DNA 濃度高于10 ng/L，A260/A280 比值在1.4 2.5 之間時(shí)，DNA 模板適宜于 PCR 擴(kuò)增。PCR 檢測(cè)普通PCR檢測(cè)PCR反應(yīng)按表3配置25 L反應(yīng)體系：PCR反應(yīng)體系成分用量（L）10PCR buffer（Mg 2+）12.5上游引物（25 pmol/L ）1.0下游引物（25 pmol/L ）1.0 Ex Taq DNA （5 U/L ）1.0 DNA模

11、板5.0ddH2O水5.5擴(kuò)增程序及反應(yīng)條件將PCR反應(yīng)管置于PCR擴(kuò)增儀，反應(yīng)參數(shù)設(shè)置：第一階段，94 預(yù)變性2 min。第二階段，94 變性30 s、60 退火30 s、72 延伸30s，共30個(gè)循環(huán)。第三階段，72 延伸5 min，最后4保存。PCR產(chǎn)物的電泳檢測(cè)用TAE電泳緩沖液配制成1%瓊脂糖平板（溴化乙錠終濃度0.5 g/mL）。將平板放入水平電泳槽中，加入1TAE電泳緩沖液剛剛高出凝膠表面，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物6 L與6 L上樣緩沖液混合，分別加入樣品孔中，取5 L DNA Marker 100 bp加入到標(biāo)準(zhǔn)分子量對(duì)照孔內(nèi)。5 V/cm恒壓電泳30 min45 min。結(jié)果判定用凝

12、膠成像系統(tǒng)進(jìn)行分析。陽(yáng)性樣品擴(kuò)增一條大小為231 bp的特異性條帶，陰性對(duì)照和空白對(duì)照應(yīng)無(wú)該特異性條帶；在陰性和陽(yáng)性對(duì)照成立情況下，如被檢樣品無(wú)條帶，則結(jié)果為陰性，如被檢樣品有條帶，大小為231 bp，即判定為華支睪吸蟲卵核酸陽(yáng)性。必要時(shí)取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定，進(jìn)一步確認(rèn)待測(cè)樣品的結(jié)果。如果出現(xiàn)與設(shè)計(jì)長(zhǎng)度不同的條帶，為非特異性反應(yīng)，需重復(fù)試驗(yàn)，兩次試驗(yàn)都為非特異性反應(yīng)時(shí)，可判為陰性。實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)熒光PCR反應(yīng)體系按表4配置25 L反應(yīng)體系：熒光PCR反應(yīng)體系成分用量（L）2 熒光定量 PCR 預(yù)混液12.5 上游引物（10 mol/L）1.0下游引物（10 mol/L）1.0 探針（10 mol/L）1.0DNA模板5.0ddH2O水4.5熒光PCR反應(yīng)參數(shù)在檢測(cè)區(qū)進(jìn)行。將9.2.1中加樣后的PCR管放入熒光PCR檢測(cè)儀內(nèi)，記錄樣本擺放順序。反應(yīng)參數(shù)設(shè)置：第一階段，95 30s。第二階段，95 5 s、60 30 s（在此收集熒光），40個(gè)循環(huán)。如試劑不同需要進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。結(jié)果判定9.3.1結(jié)果分析條件設(shè)定讀取檢測(cè)結(jié)果。閾值設(shè)定原則以閾值線剛好超過(guò)正常陰性對(duì)照品擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)，不同儀器可根據(jù)儀器噪音情況進(jìn)行調(diào)整。9.3.2質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)陰性對(duì)照和空白對(duì)照無(wú)Ct值并且無(wú)擴(kuò)增曲線。陽(yáng)性對(duì)照樣品有對(duì)數(shù)擴(kuò)增曲線，