血凝及血凝抑制實(shí)驗(yàn)

1、實(shí)驗(yàn)二 血凝及血凝抑制實(shí)驗(yàn) 第一頁，共二十四頁。實(shí)驗(yàn)?zāi)康难囼?yàn)：滴定病毒的血凝效價(jià)(病毒的凝集價(jià))，采用一定的病毒量，通常采用4個血凝單位。血凝抑制試驗(yàn)： 應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)病毒液測定血清中的相應(yīng)抗體或應(yīng)用特異性抗體鑒定新分離的血凝性病毒檢測實(shí)驗(yàn)用雞群有無病毒感染和監(jiān)測雞的免疫狀態(tài)。 掌握基本操作技術(shù),了解其實(shí)用價(jià)值 第二頁，共二十四頁。實(shí)驗(yàn)原理 第三頁，共二十四頁。血凝素（HA）柱狀流感病毒結(jié)構(gòu)模式圖第四頁，共二十四頁。刺突：亞型特異性抗原，易變異 血凝素（HA，從H1H15):呈柱狀 功能：吸附細(xì)胞：與細(xì)胞上受體結(jié)合,使病毒侵入細(xì)胞凝集多種動物的紅細(xì)胞（血凝試驗(yàn)）具抗原性：其抗體能中和病毒-中和抗

2、體 抑制血凝（血凝抑制試驗(yàn)）第五頁，共二十四頁。血凝試驗(yàn)原理血凝素（hemagglutinin HA）：由病毒基因編碼的糖蛋白刺突。與病毒吸附和傳入宿主細(xì)胞有關(guān)。HA能與人或其它動物多種紅細(xì)胞表面N乙酰神經(jīng)氨酸酶受體結(jié)合引起紅細(xì)胞凝集。為病毒的 紅細(xì)胞凝集反應(yīng)或血凝反應(yīng)。第六頁，共二十四頁。血凝原理血凝抑制原理第七頁，共二十四頁。血凝抑制試驗(yàn)原理病毒引起的血凝現(xiàn)象能被相應(yīng)的抗血凝素抗體所抑制，即抗體與病毒結(jié)合后，血凝素?zé)o法吸附于紅細(xì)胞表面的受體上，用免疫血清阻止紅細(xì)胞凝集的現(xiàn)象，稱為血凝抑制第八頁，共二十四頁。實(shí)驗(yàn)材料器材：U型或V型微量反應(yīng)板、微量移液器、槍頭試劑：1%雞紅細(xì)胞、NDIV血凝

3、素、NDIV抗血清、生理鹽水第九頁，共二十四頁。實(shí)驗(yàn)步驟1.取96孔V型反應(yīng)板1塊置于水平實(shí)驗(yàn)臺上，在第1排1-10孔內(nèi)加入25ul生理鹽水，第11孔不加。第12孔加25ul生理鹽水2.在第1孔內(nèi)加入血凝素25ul，混勻后吸出25ul加入第2孔內(nèi)，再混勻后吸出25ul加入第3孔內(nèi)，依次類推至第10孔時棄掉25ul。第12孔不加作陰性對照孔。第十頁，共二十四頁。第十一頁，共二十四頁。3.在1-12孔均加入25ul的生理鹽水。4.在每孔內(nèi)加入25ul1%的雞紅細(xì)胞懸液，震蕩，室溫靜止感作15-30min，每5min觀察一次結(jié)果。5.計(jì)算血凝效價(jià)，稀釋使成為四價(jià)備用第十二頁，共二十四頁。血凝試驗(yàn)結(jié)果

4、判定效價(jià)判定： 凝集特別顯著：“” 凝集現(xiàn)象次之：“” 凝集清楚可見：“” 稍顯凝集者：“”血凝效價(jià)：呈“”凝集時的最高稀釋度。此時的稀釋度即為1個血凝單位。第十三頁，共二十四頁。結(jié)果判定1.在各組對照均正確的情況下，按下列標(biāo)準(zhǔn)判定 血凝反應(yīng)強(qiáng)度示意圖“4” 紅細(xì)胞呈片狀凝集，均勻布滿孔底，邊緣有時不整齊或皺縮?！?” 紅細(xì)胞呈片狀凝集，但面積略小于“4+”。“2” 紅細(xì)胞呈片狀凝集，但有少許沉積孔底中部呈小圓點(diǎn)狀?！啊?紅細(xì)胞大部分沉于孔底中央，周圍有少量散在凝集顆粒?！啊?紅細(xì)胞均沉于孔底呈小圓點(diǎn)狀，邊緣整齊。2.對照孔正常的情況下，紅細(xì)胞凝集100%的稀釋度為判定血凝價(jià)的終點(diǎn)。凡能使雞紅

5、細(xì)胞完全凝集的病毒最高稀釋倍數(shù)為病毒的凝集價(jià)。第十四頁，共二十四頁。血凝抑制1.取96孔V型反應(yīng)板1塊置于水平實(shí)驗(yàn)臺上，在第1排1-10孔內(nèi)加入25ul生理鹽水，第11孔不加。第12孔加25ul生理鹽水。2.在第1孔內(nèi)加入被檢血清25ul，混勻后吸出25ul加入第2孔內(nèi)，再混勻后吸出25ul加入第3孔內(nèi)，依次類推至第10孔時棄掉25ul。第12孔不加作陰性對照孔。第十五頁，共二十四頁。第十六頁，共二十四頁。3.在1-12孔內(nèi)均加入“四價(jià)”血凝素25ul，震蕩后，室溫靜止作用5min。4.在1-12 孔內(nèi)均加入1%的雞紅細(xì)胞懸液25ul，震蕩，室溫感作15-30min，每5min觀察一次結(jié)果。5

6、.觀測結(jié)果，記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)第十七頁，共二十四頁。血凝抑制試驗(yàn)結(jié)果判定測定孔 RBC沉于孔底中心，呈紐扣狀。(+) 凝集 （-）病毒對照孔：凝集RBC對照孔：無自凝血凝抑制試驗(yàn)效價(jià)：呈完全血凝抑制使的最高血清稀釋度。 第十八頁，共二十四頁。第十九頁，共二十四頁。第二十頁，共二十四頁。思考題1、病毒凝集紅細(xì)胞是不是一種特異的抗原體反應(yīng)？為什么？ 2、血凝抑制實(shí)驗(yàn)是不是特異的抗原抗體反應(yīng)? 為什么？3、血凝試驗(yàn)中為什么要加補(bǔ)充液？4、為什么加病毒液和紅細(xì)胞懸液時要反向加？5、血凝試驗(yàn)和血凝抑制試驗(yàn)中空白對照的意義？第二十一頁，共二十四頁。孔號1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011(+)12（-)HA稀釋度248163264128256、棄生理鹽25252525252525252525x25血凝素2525252525252525252525血凝素x生理鹽水2525252525252525252525251%雞紅細(xì)胞252525252525252525252525結(jié)果預(yù)測+-+_孔號1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011(+)12（-)HI稀釋度248163264128256、棄生理鹽25252525252525252525X25待檢血清2525252525252525252525