關節(jié)軟骨撞擊傷后軟骨細胞凋亡的實驗研究

1、關節(jié)軟骨撞擊傷后軟骨細胞凋亡的實驗研究【摘要】目的用TUNEL標記法和透射電鏡來觀察軟骨撞擊傷后軟骨細胞凋亡的演變情況。方法56只安康成年新西蘭大白兔，隨機分高、低能量兩組，每組28只，隨機選取一側后肢為實驗組，另一側為對照組；不同重量的擊錘撞擊股骨內(nèi)側髁軟骨面致不同的損傷。術后4d，1、2、4、8、16、32周搜集標本，每個時間組4只兔子，進展TUNEL標記法和透射電鏡來觀察軟骨細胞的凋亡。結果對照組標本中在軟骨的中間層和鈣化層，出現(xiàn)凋亡細胞。低能量組中，傷后4d，1、2周的標本中，軟骨的移形層和過渡層出現(xiàn)凋亡細胞，細胞凋亡率與對照組之間無統(tǒng)計學意義；4周后的標本中凋亡細胞明顯減少，細胞凋亡

2、率與對照組之間無統(tǒng)計學意義。高能量組中，傷后4d軟骨淺表層和移形層中出現(xiàn)凋亡細胞，而且傷后時間越長凋亡細胞所占比率越大，細胞凋亡率與對照組之間有統(tǒng)計學意義。結論軟骨高、低能量撞擊傷后早期軟骨細胞均出現(xiàn)凋亡，凋亡率高于對照組；但低能量傷后4周軟骨細胞凋亡率恢復到對照組程度；高能量傷后軟骨細胞凋亡率隨時間逐漸增高。【關鍵詞】軟骨損傷；軟骨細胞；凋亡；創(chuàng)傷性骨關節(jié)炎近來的研究說明，骨關節(jié)炎和體外軟骨損傷模型中，可觀察到軟骨細胞的凋亡。隨著骨關節(jié)炎嚴重程度加重，軟骨細胞的凋亡率也隨之增加，機械損傷也能誘導軟骨細胞的凋亡，后者可能是軟骨細胞對機械損傷的最早反響之一1,2。體內(nèi)關節(jié)軟骨受到撞擊傷后，軟骨細

3、胞的凋亡率如何演變?nèi)藗冞€缺乏足夠的認識。本實驗在Neberry、Vrahas模型的根底上，建立兔股骨內(nèi)側髁軟骨損傷不同的模型，用TUNEL標記法和透射電鏡觀察軟骨損傷后軟骨細胞凋亡的演變情況。1材料與方法1.1動物及分組56只安康成年新西蘭大白兔，雌雄不限，體重3.03.5kg，隨機分為輕、重2組，每組28只，隨機選取一側后肢為實驗組，另一側為對照組。再隨機分為術后4d，1、2、4、8、16、32周7個時間組，每組4只動物。1.2關節(jié)軟骨損傷模型的建立1.2.15水合氯醛1.25lkg腹腔注射麻醉，取仰臥位，脫毛，常規(guī)消毒鋪巾。1.2.2膝關節(jié)內(nèi)側縱形切口，長3，依次切開皮膚、皮下組織、深筋膜

4、、關節(jié)囊，將髕骨外翻，膝關節(jié)屈曲120，使股骨干與程度面垂直，骨盆固定帶固定骨盆，用大腿固定帶固定大腿防止撞擊時不穩(wěn)定。1.2.3用1.33、0.43kg的擊錘分別于46、20高處通過導桿自由墜落，產(chǎn)生的能量為6.3J(能造成膠原網(wǎng)架斷裂)和0.9J(不能造成膠原網(wǎng)架斷裂)2、3，再通過撞擊體致股骨內(nèi)側髁軟骨面的損傷。對照側不行撞擊，余步驟同試驗組。術畢慶大霉素生理鹽水沖洗關節(jié)腔，逐層縫合傷口。麻醉清醒后籠內(nèi)自由活動。術后肌注青霉素20萬單位，每日2次，連用3d。(4)于術后4d，1、2、4、8、16、32周搜集標本，進展TUNEL標記法和透射電鏡來觀察軟骨細胞的凋亡。1.3形態(tài)學觀察1.3.

5、1取材、固定各組于觀察期滿后，在一樣位置用鋒利雙面刀片軟骨下骨處切取0.50.40.2的軟骨，不取軟骨下骨，防止了因標本脫鈣過程中破壞細胞造成假陽性。標本切成2等份，1份立即置于10中性福爾馬林溶液中在室溫下固定24h后，石蠟包埋組織塊，作連續(xù)切片，片厚為51，制成病理切片備用。另1份備做透射電鏡之用。1.5統(tǒng)計學處理用SPSS12.0統(tǒng)計軟件包，按高、低能量組與相應對照組分別進展兩兩比擬，采用t檢驗，取95可信區(qū)間，觀察各實驗組與對照組的軟骨細胞凋亡率有無統(tǒng)計學差異。2結果術后所有實驗動物均存活至預定取材時間，切口愈合好，無1例感染。2.1TUNEL標記法軟骨細胞凋亡率的觀測軟骨細胞核呈橙黃

6、色的為凋亡細胞，藍色的為正常細胞。對照組標本中在軟骨的中間層和鈣化層，出現(xiàn)凋亡細胞。低能量組中，傷后4d，1、2周的標本中，軟骨的移形層和過渡層出現(xiàn)凋亡細胞，細胞凋亡率與對照組之間無統(tǒng)計學意義;4周后的標本中凋亡細胞明顯減少，細胞凋亡率與對照組之間無統(tǒng)計學意義(P0.01)(圖1、2)。高能量組中，傷后4d軟骨淺表層和移形層中出現(xiàn)凋亡細胞，且傷后時間越長凋亡細胞所占比率越大，細胞凋亡率與對照組之間有統(tǒng)計學意義(圖3、4)。2.2透射電鏡高、低能量撞擊組軟骨細胞凋亡的特征性表現(xiàn)為：細胞偏離胞周基質，胞漿內(nèi)空泡形成，細胞器減少，殘存粗面內(nèi)質網(wǎng)擴張，核膜不規(guī)那么，核固縮或細胞碎裂，染色質濃縮、邊聚(

7、圖5)。對照組的胞周基質明晰濃密，細胞位于陷窩內(nèi)，軟骨細胞胞膜及核膜完好，胞漿內(nèi)細胞器明晰可見，胞周基質明晰濃密，內(nèi)質網(wǎng)、線粒體和高爾基體等細胞器豐富(圖6)。3討論在正常關節(jié)軟骨中，1軟骨細胞可見凋亡征象，凋亡主要發(fā)生于軟骨肥大層，隨著年齡的增加，軟骨細胞凋亡率也逐步增加。骨關節(jié)炎中可見50的軟骨細胞凋亡，可發(fā)生于軟骨全層。軟骨細胞的異常死亡勢必影響軟骨分解及合成代謝的動態(tài)平衡，可見，軟骨細胞異常凋亡參與了骨關節(jié)炎的病理過程。機械損傷可以引起軟骨細胞的死亡，但是死亡形式是通過凋亡或是壞死還有待進一步證實。Te等3用環(huán)鉆造成軟骨損傷后，光學顯微鏡、透射電鏡和TUNEL法觀察軟骨細胞的死亡形式，

8、在傷口的邊緣出現(xiàn)軟骨細胞凋亡，表現(xiàn)為細胞核濃縮和固縮，胞漿萎縮，細胞偏離胞周基質，這與本研究中觀察到的軟骨細胞凋亡情況相一致。Lening等4在體外用230Pa壓力撞擊牛的軟骨，采用TUNEL法觀察軟骨細胞的凋亡，發(fā)如今中度撞擊會導致軟骨細胞凋亡的明顯增加，軟骨在撞擊傷后，出現(xiàn)其它變化時，凋亡是最早出現(xiàn)的反響形式之一。DLia等5在體外將機械力加載到培養(yǎng)牛的關節(jié)軟骨細胞上，發(fā)現(xiàn)軟骨細胞凋亡率隨加載力的增加而增加。進一步通過電鏡和原位末端DNA片段標記技術證實，培養(yǎng)牛的軟骨細胞受到創(chuàng)傷后，鄰近損傷處的軟骨細胞凋亡率也明顯增加。本研究分別用6.3、0.9J不同能量撞擊兔股骨內(nèi)側髁造成軟骨不同的損傷

9、，傷后4d，1、2、4、8、16、32周取標本，TUNEL法和透射電鏡法來觀測軟骨細胞的凋亡，有其特異性和敏感性。結果說明，關節(jié)軟骨被撞擊后軟骨細胞均出現(xiàn)凋亡，凋亡的軟骨細胞以淺表層和中間層較多，高能量傷后軟骨細胞的凋亡率明顯較低能量組高，傷后時間越長，細胞凋亡現(xiàn)象越重。而低能量傷后4d也出現(xiàn)凋亡，4周后細胞凋亡現(xiàn)象不再明顯。由此作者認為，高能量傷不但造成細胞損傷，而且軟骨有裂隙，膠原纖維網(wǎng)架斷裂，完好的軟骨細胞不能修復此類損傷，結果造成軟骨細胞受到長期反復的慢性損傷，導致凋亡進一步加重，這樣使膠原纖維網(wǎng)架遭到進一步損傷，形成惡性循環(huán)，以致凋亡程度隨傷后時間延長而加重。低能量傷開場出現(xiàn)的凋亡說

10、明在撞擊時直接使軟骨細胞受到損傷，但由于膠原纖維沒有斷裂，使軟骨細胞免遭進一步損傷，才出現(xiàn)其損傷后4周軟骨細胞凋亡率與對照組的差異無統(tǒng)計學意義。通過本研究說明，軟骨的損傷中，軟骨細胞的凋亡可能是促使軟骨退變的重要因素之一，但膠原纖維網(wǎng)架是否完好也許對軟骨的持續(xù)損傷更重要?！緟⒖嘉墨I】1stursJG,DangA,KiHT.parisnfhndryteapptsisinvivandinvitrfllingatuestehndralinjuryJ.JrthpRes,2022,22:678-683.2王東明.膝關節(jié)軟骨鈍性損傷的研究進展J.中國矯形外科雜志，2022,13(16):1263-1265.3TeSR,KanAPL,HannA,etal.Thereatinfartiularartilagetexperientalunding.TherlefapptsisJ.ArthritisRheu，2000，43:215-225.4LeningA,JanesIE,LevenstnE,etal.Injuriusehanialpressinfbvineartiu