免疫磁珠法分離和提純雪旺細胞的實驗研究

1、免疫磁珠法別離和提純雪旺細胞的實驗研究【摘要】目的討論利用免疫磁珠從SD大鼠坐骨神經(jīng)別離培養(yǎng)獲得大量、高純度雪旺細胞的方法。方法選用47dSD大鼠，無菌條件下取雙側(cè)坐骨神經(jīng)，解剖鏡下剝離去除神經(jīng)外膜，獲得神經(jīng)束，將神經(jīng)束剪碎至13大校采用雙酶2次消化法消化，胎牛血清中止消化后，離心并參加DF12培養(yǎng)液培養(yǎng)。7d后應(yīng)用免疫磁珠法對細胞進展純化培養(yǎng)，培養(yǎng)2d后進展傳代接種。培養(yǎng)過程中對細胞進展形態(tài)學(xué)觀察、計數(shù)及活力測定；TT法繪制細胞生長曲線，采用免疫細胞化學(xué)熒光染色對細胞進展鑒定并且計算所得細胞純度。結(jié)果別離培養(yǎng)所得細胞即為雪旺細胞；采用免疫磁珠法能對培養(yǎng)所得雪旺細胞進展純化。純化后雪旺細胞活力

2、為96%0.5，純度98%1.1%，培養(yǎng)2d后就可以傳代。結(jié)論免疫磁珠法可以用于雪旺細胞的純化培養(yǎng)，所得雪旺細胞純度高，活力強，能滿足組織工程人工神經(jīng)的需要?！娟P(guān)鍵詞】雪旺細胞；免疫磁珠；坐骨神經(jīng)Keyrds：Shannell;iunagnetiheads;siatinerve雪旺細胞Shannell，S是周圍神經(jīng)系統(tǒng)的主要膠質(zhì)細胞，包繞周圍神經(jīng)的軸突，形成髓鞘1?，F(xiàn)已證明周圍神經(jīng)的再生才能主要歸功于雪旺細胞，它能分泌少量神經(jīng)營養(yǎng)因子促進神經(jīng)軸突的發(fā)芽再生；其分泌的細胞外基質(zhì)可以形成類髓鞘的管狀構(gòu)造，為再生軸突的延伸和生長提供隧道2。雪旺細胞可以起到神經(jīng)軸突的“導(dǎo)管、“導(dǎo)向作用。所以目前認為雪

3、旺細胞在周圍神經(jīng)損傷修復(fù)及神經(jīng)組織工程中有良好的應(yīng)用前景；但如何快速獲取大量高純度、高活性雪旺細胞是移植的關(guān)鍵。雪旺細胞培養(yǎng)的組織來源多為周圍神經(jīng)和背根神經(jīng)節(jié)組織3，為獲得高純度的細胞，培養(yǎng)的關(guān)鍵在于去除沾染的成纖維細胞4、5，同時保持雪旺細胞較長時間的生存增殖才能。雪旺細胞培養(yǎng)的方法主要有：組織塊培養(yǎng)法、單酶消化法及雙酶消化法等。對于各種方法的優(yōu)劣，文獻報道不一。為此，本實驗希望嘗試通過免疫磁珠來培養(yǎng)及純化雪旺細胞，為神經(jīng)組織工程進一步研究打下基矗1材料與方法1.1實驗材料實驗動物47d的SD仔鼠35只,雄性。由第四軍醫(yī)大學(xué)動物研究所提供。培養(yǎng)液DF12培養(yǎng)液Gib、胎牛血清Gib。消化用酶

4、0.25的胰蛋白酶Siga和0.2的型膠原酶Gib。1.2細胞別離1.3細胞純化1.4細胞計數(shù)1.5TT法繪制雪旺細胞生長曲線計算倍增時間：取兩組傳代雪旺細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為1104/l，接種于96孔培養(yǎng)板，每塊板每組取8孔，200l/孔，共接種9個樣本。37，52培養(yǎng)3d。培養(yǎng)3d后，每日固定時間取板1塊，加5g/LTT試劑20l/孔，37，52孵育箱中4h；棄上清，加DS150l/孔，振蕩10in，酶聯(lián)免疫檢測儀測吸光度值(A值/D值)，激發(fā)波長：490n，計算當(dāng)日各組A值均數(shù)，以時間為橫軸，光吸收值為縱軸繪制生長曲線。倍增時間計算：DT=tlg2/lg(Nt/N。)(DT為A值增加1

5、倍的時間，Nt為t時問的相對A值，N。為培養(yǎng)第1d的相對A值)。1.6細胞鑒定1.7細胞純度將純化的雪旺細胞進展消化，取1滴細胞懸液滴于蓋玻片上，37溫箱中培養(yǎng)24h后取出，采用間接免疫熒光法或AB法進展鑒定。純度計算法：隨機選取10個高倍鏡1020下不同視野，間接熒光法以普通光下見到的細胞數(shù)為細胞總數(shù)，以熒光激發(fā)后鏡下發(fā)熒光的亮綠色的細胞為陽性細胞：AB法以藍色細胞核數(shù)為總細胞數(shù)，以胞漿顯色者為陽性細胞數(shù)。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.陽性細胞數(shù)總細胞數(shù)100陽性細胞百分數(shù)，亦即雪旺的純度。2結(jié)果2.1雪旺細胞的形態(tài)學(xué)鑒定采用胰蛋白酶和膠原蛋白酶混和消化后細胞存活率為96.4%2.1，細胞在接種12

6、d后可觀察到少量雪旺細胞貼壁，胞體以梭形為主，少數(shù)為三角形，局部細胞已伸出雙極突起，細胞核為圓形或卵圓形。35d后，出現(xiàn)聚合現(xiàn)象，呈旋渦狀或柵欄狀排列生長。隨著培養(yǎng)時間的延長，突起更加細長，細胞間排列更嚴密，形成網(wǎng)絡(luò)狀。雪旺細胞和成纖維細胞成雙層生長，雪旺細胞多數(shù)呈梭形，少數(shù)呈三角形或不規(guī)那么形，胞體較小，具有兩個細長的突起。成纖維細胞的胞體較大，扁平，呈不規(guī)那么形，無細長突起，覆蓋于瓶底，雪旺細胞在其上生長。7d后成纖維細胞的數(shù)量逐漸增多，因其生長速度快，很快即鋪滿瓶底，雪旺細胞那么隨后生長于其上。經(jīng)免疫磁珠提純的雪旺細胞多為胞體較孝具有兩個極狀突起的梭形細胞，少數(shù)為三角形或不規(guī)那么形。純化

7、培養(yǎng)2d后，雪旺細胞活力96%0.5，純度98%1.1，增殖良好。2.2雪旺細胞鑒定2.3雪旺細胞增殖才能測試用測得的TT吸光度值(A值D值)繪制細胞生長曲線。結(jié)果顯示培養(yǎng)27d的2代雪旺細胞處于對數(shù)生長期(圖3)。倍增時間為3d。圖2免疫熒光染色20圖3雪旺氏細胞生長曲線3討論雪旺細胞是外周神經(jīng)的神經(jīng)膠質(zhì)細胞，在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)生、發(fā)育，特別是神經(jīng)再生中起著重要作用。隨著神經(jīng)組織工程的開展，需要獲得大量高純度的雪旺細胞，目前主要的培養(yǎng)方法有組織塊培養(yǎng)法、單酶消化法、雙酶消化法、特異粘附法等69。但這些方法均有獲得細胞純度低、數(shù)量少、不易長期存活等問題。本試驗采用0.25胰蛋白酶加0.2型膠原酶二次消化法，消化1h后神經(jīng)束根本消化完全，活細胞率可達94.63.410。本方法使用較低濃度的胰蛋白酶進展消化，減少了對雪旺細胞的損傷，消化