甘松揮發(fā)油對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞膜鈉通道的影響

1、甘松揮發(fā)油對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞膜鈉通道的影響【摘要】目的研究甘松揮發(fā)油對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞膜鈉通道的影響，討論甘松揮發(fā)油在離子通道程度抗心律失常的作用機(jī)制。方法用急性酶解法別離大鼠心室肌細(xì)胞，采用全細(xì)胞膜片鉗記錄技術(shù)，觀察不同濃度的甘松揮發(fā)油對(duì)鈉通道的影響。結(jié)果濃度為1，3，5，10，20，100g/g甘松揮發(fā)油可濃度依賴性地抑制鈉電流；可使心肌細(xì)胞鈉電流-電壓曲線上移，但激活電位、峰電位及反轉(zhuǎn)電位無改變；使激活曲線向正電位方向變化，V1/2從(-43.650.98)V右移至(-40.251.01)V(n=6，P005)；使失活曲線向負(fù)電位方向變化,V1/2從(-100.920.68)V左移至(-11

2、1.200.86)V(n=6，P0.05)。結(jié)論甘松揮發(fā)油可通過濃度依賴性地抑制大鼠心肌細(xì)胞膜鈉通道電流，在不同膜電位程度對(duì)鈉通道電流具有均勻一致的抑制作用；使激活曲線右移，使失活曲線左移?！娟P(guān)鍵詞】甘松膜片鉗鈉通道心肌細(xì)胞Abstrat：bjetiveTbservetheeffetsfthevlatileilfNardstahyshinensisnsdiuhannelinislatedventriularyytes.ethdsSingleventriularyytefratasbtainedbyenzyatidissiatinethdThehle-ellpathlaprerdingtehni

3、queasusedtrerdthehangefsdiuurrentbydiferentdsagesfthevlatileilfNardstahyshinensisfr1t100pp.ResultsThevlatileilfNardstahyshinensisdereasedsdiuurrentinadse-dependentanner.Theurrent-vltageurveveduphileativeptential，peakptentialandreverseptentialhadnhangeTheativatinurvevedtrepsitiveptentialandtheinativa

4、tinurvevedtrenegativeptentialnlusinThevlatileilfNardstahyshinensisulddereasesdiuhannelurrentinadse-dependentanner,theativatinurveisshiftedtardsthedeplarizingdiretinandtheinativatinurveisshiftedtardsthehyperplarizingdiretin.Keyrds：Nardstahyshinensis；Path-laptehniques；Sdiuhannel；yardiu甘松為敗醬科甘松屬植物，具有抗心

5、律失常作用1，2，甘松揮發(fā)油是甘松有效濃縮成分3，其抗心律失常的機(jī)制已有初步研究4。本研究應(yīng)用膜片鉗全細(xì)胞記錄技術(shù)，觀察甘松揮發(fā)油對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞膜鈉通道電流(INa)的影響，從離子通道程度討論其作用機(jī)制。1材料與儀器1.1材料安康成年雌雄性大鼠，體質(zhì)量250300g，由南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物所提供。甘松揮發(fā)油由江西省樟樹市中醫(yī)藥研究所提供，用陰干后的甘松樣品1000g，按?中國藥典?部甲法進(jìn)展水蒸餾，經(jīng)6h后停頓加熱，靜置過夜，油水相別離后得淺綠色油狀液體5。I型膠原酶(llagenaseI)、HEPES(N-2-羥乙基哌嗪-N-2-乙磺酸)，s1(氯化銫)，谷氨酸，TEA-1(氯化四乙胺)，N

6、a2ATP，EGTA為Siga公司產(chǎn)品。其它試劑均為國產(chǎn)分析純。1.2儀器膜片鉗放大器(Axpath200B)及DigiData1200B型數(shù)/?；蚰?數(shù)轉(zhuǎn)換器均為美國Axn公司。2方法2.1灌流過濾以5U/g肝素鈉對(duì)別離大鼠進(jìn)展腹腔內(nèi)注射，1015in后以1%戊巴比妥鈉50g/kg腹腔內(nèi)注射麻醉，迅速開胸取出心臟，放入4無鈣液中，離體心臟修飾后經(jīng)主動(dòng)脈掛在Langendrf灌流儀逆行用無鈣臺(tái)氏液經(jīng)主動(dòng)脈逆行灌流5in，通以100%純氧。10in后以濃度分別為0.60.7g/LI型膠原酶，0.040.06g/L蛋白酶E，0.30.5g/L牛血清白蛋白BSA和50l/L低鈣酶液灌流心臟。30in

7、左右心臟松軟后，改180200l/L低鈣臺(tái)氏液灌流心臟5in，溫度維持在3637，灌流過程中始終予以氧氣飽和，氧流量0.30.5L/in。5in后，將心臟從灌流裝置上取下，剪除心房和乳頭肌,留下心室肌組織塊置于盛有KB液的燒杯中充分剪碎、輕輕吹打、100目尼龍網(wǎng)過濾，以去除可能影響離子流記錄的組織碎片。過濾后置于KB液中室溫下孵育12h，然后置于4冰箱中保存。2.2溶液配制無鈣臺(tái)氏液(l/L)：Nal136，Kl5.4，gl21.0，NaH2P40.33，HEPES10，gluse10，NaH調(diào)pH至74。KB液(lL)：K140，KH2P420，gS43.0，KH80，谷氨酸50，?；撬?0

8、，HEPES10，gluse10，EGTA0.5，KH調(diào)pH至7.4。INa細(xì)胞外液(l/L)：氯化膽堿140，Nal15，gl21.0，al20.5，HEPES5，gluse10，sl24.6，l21.0，sH調(diào)pH至7.4。INa電極內(nèi)液為(l/L)：sl2120，Nal210，gl21.0，Na2ATP5.0，EGTA10，HEPES10，sH調(diào)pH至7.3。2.3膜片鉗全細(xì)胞記錄方法選取紋理明晰、桿狀和大小適中的細(xì)胞在室溫下進(jìn)展實(shí)驗(yàn)，將適量細(xì)胞參加體積約15l平放于倒置顯微鏡上的細(xì)胞池中，貼壁10in后，用灌流法加藥，流速約1.5l/in。在電極拉制儀分兩部拉制電極，電阻12。電極內(nèi)灌

9、以電極液，置于推進(jìn)器上，通過三維操縱器驅(qū)動(dòng)電極，并輕壓在細(xì)胞外表，用負(fù)壓使電極與細(xì)胞外表形成高阻封接后，補(bǔ)償快電容并吸破細(xì)胞膜形成全細(xì)胞記錄形式。調(diào)節(jié)慢電容補(bǔ)償和串聯(lián)電阻補(bǔ)償8090以減少瞬時(shí)充放電電流和鉗位誤差。信號(hào)經(jīng)截止頻率為1kHz的四階貝塞爾低通濾波器，采樣率為10kHz。實(shí)驗(yàn)在室溫(2224)下進(jìn)展。實(shí)驗(yàn)過程由pLAP7.0軟件程序(AXN，美國)控制，通過ADDA轉(zhuǎn)換板(AXNDigiData1200，美國)，進(jìn)展刺激發(fā)放和信號(hào)采集，并存儲(chǔ)于計(jì)算機(jī)硬盤中，供測(cè)量及分析用。為消除細(xì)胞間誤差，電流值以電流密度(pApF)表示。2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用pLAP7.0軟件對(duì)單個(gè)全細(xì)胞記錄進(jìn)展數(shù)

10、據(jù)和圖形轉(zhuǎn)換，rigin7.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)展曲線擬合及繪制濃度-劑量曲線，離子通道電流密度-電壓曲線，電流密度(pApF)=電流強(qiáng)度電容；激活一失活關(guān)系曲線。所有數(shù)據(jù)以s表示，用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件做統(tǒng)計(jì)分析，采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)。3結(jié)果3.1鈉通道電流的記錄細(xì)胞內(nèi)液用s+代替K+阻斷鉀電流。細(xì)胞外液用l2阻斷鈣電流。細(xì)胞鉗制電位hldingptential,HP在-90V，施以鉗制時(shí)間laptie,T60s的指令電位andptential,P從-90V到+40V的序列除極方波，刺激頻率為10Hz，步長10V，誘發(fā)出具有電壓依耐性內(nèi)向鈉電流圖1A。甘松揮發(fā)油5g/g作用5in后可見內(nèi)向電流明

11、顯減少圖1B。用細(xì)胞外液灌流沖洗后局部細(xì)胞能局部恢復(fù)被抑制的鈉電流圖1。這可進(jìn)一步說明內(nèi)向鈉電流的減少是該藥物引起的。3.2甘松揮發(fā)油對(duì)鈉通道電流作用的量效曲線細(xì)胞鉗制電位hldingptential,HP控制在-90V,用含不同濃度的甘松揮發(fā)油細(xì)胞外液灌流，觀察1，3，5，10，20，100g/g對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞鈉電流的影響，其抑制率分別為7.24%，203.7%,555%,763.5%,893%，1000%每個(gè)濃度n=5，p0.05。用上述數(shù)據(jù)作圖，然后采用I=Iaxn/(n+E50n)方程進(jìn)展擬合，式中得到半數(shù)有效濃度E50值為4.950.61，斜率因子為2.120.54。見圖2。3.3

12、INa電流-電壓I-V曲線測(cè)定在電壓鉗形式下，從HP-90V逐步除極至+40V，階躍+10V，維持時(shí)間40s，刺激頻率0.5Hz，以各激活電位下電流密度對(duì)相應(yīng)電位作圖得I-V曲線圖，其中電流密度為各激活電位下電流與膜電容的比值，單位為皮安/皮法pA/pF。鉗制電位為-90V，以5g/g甘松揮發(fā)油灌流液進(jìn)展對(duì)照研究，可使電流-電壓曲線明顯上移。給藥前后峰值電流從-45.73.1pA/pF減少至-21.34.8pA/pF(n=6，P0.01)。但不改變激活電位、峰電位、反轉(zhuǎn)電位和曲線的形狀。沖洗后局部細(xì)胞可以完全恢復(fù)，但對(duì)鈉電流的激活電位、峰電位和翻轉(zhuǎn)電位無明顯影響。見圖3。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.

13、3.4甘松揮發(fā)油對(duì)鈉通道激活動(dòng)力學(xué)影響為觀察INa的激活動(dòng)力學(xué)特征，將I-V曲線的結(jié)果轉(zhuǎn)換成膜電導(dǎo)G，對(duì)條件刺激電壓作圖，然后采用Bltzann方程g/gax=1-1+exp(V-Vl/2)/k-1進(jìn)展擬合,式中得到INa激活曲線，求得V1/2半數(shù)激活電壓和S斜率因子。濃度為5g/g甘松揮發(fā)油使鈉通道激活曲線V1/2從(-43.650.98)V右移至(-40.251.01)V(n=6，P0.05)，S從(5.630.75)V減少至(5.030.80)V(n=6，P0.05)。見圖4。3.5甘松揮發(fā)油對(duì)鈉通道失活動(dòng)力學(xué)影響保持電位-90V，施于40s，階躍為+10V，-150+30V系列條件脈沖

14、刺激，在每一條件脈沖后緊跟一固定除極至-30V，25s的測(cè)試脈沖，然后回到-90V，記錄鈉通道失活電流。以電流相對(duì)值對(duì)條件脈沖電壓作圖，經(jīng)Bltzann方程進(jìn)展擬合：I/Iax=1+exp(V-Vl/2)/k-1，得INa失活曲線，然后求得Vl/2半數(shù)失活電壓和S斜率因子。濃度為5g/g甘松揮發(fā)油使INa失活曲線Vl/2從(-100.920.68)V左移至(-111.200.86)V(n=6，P005)，S從(10.330.62)V增加至(11.330.74)V(n=6，P005)見圖5。4討論INa是心肌細(xì)胞重要的跨膜離子通道電流，影響心肌細(xì)胞的興奮和傳導(dǎo)。鈉通道主要參與動(dòng)作電位的0相除極。

15、鈉通道的活性異常影響心肌的傳導(dǎo)性和興奮性，從而產(chǎn)生折返、異常自律性或觸發(fā)活動(dòng)，形成各種快速心律失常。INa異常會(huì)導(dǎo)致一系列的心律失常，尤其是心臟傳導(dǎo)功能異常，促進(jìn)了心律失常的發(fā)生6。一些抗心律失常藥物就是通過阻滯鈉離子通道后，抑制了心肌細(xì)胞的興奮性和傳導(dǎo)性，從而發(fā)揮抗心律失常作用。本試驗(yàn)采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)觀察甘松揮發(fā)油對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞INa的影響和鈉通道動(dòng)力學(xué)的改變。結(jié)果顯示，在甘松揮發(fā)油濃度為4.950.61g/g時(shí)可將INa抑制50%，且甘松揮發(fā)油濃度的增加對(duì)INa的抑制率也隨之增加。甘松揮發(fā)油使I-V曲線上移但并不改變I-V曲線的激活電位、峰電位及反轉(zhuǎn)電位，提示甘松揮發(fā)油在不同膜電位程

16、度對(duì)INa具有均勻一致的抑制作用，說明甘松揮發(fā)油能降低動(dòng)作電位幅度，減慢動(dòng)作電位0相上升速度，對(duì)抗快速型心律失常。這也在一定程度上較好的解釋了以甘松為主要成分的穩(wěn)心顆粒能平安有效的治療快速型心率失常7。本研究還發(fā)現(xiàn)，甘松揮發(fā)油使激活曲線右移，使失活曲線左移，提示甘松揮發(fā)油可減緩鈉通道的激活過程同時(shí)可促進(jìn)鈉通道失活的過程。甘松揮發(fā)油除抑制INa的作用之外，我們的研究還顯示具有抑制內(nèi)向整流鉀電流、L-型鈣電流的作用另文報(bào)道。甘松揮發(fā)油對(duì)這些離子通道的綜合作用，可能使心肌細(xì)胞的動(dòng)作電位時(shí)程APD和有效不應(yīng)期ERP適當(dāng)延長，使得心肌興奮性、不應(yīng)性及傳導(dǎo)性產(chǎn)生影響從而發(fā)揮抗心律失常的作用。由于甘松揮發(fā)油

17、是一種揮發(fā)性物質(zhì)，易于從吸入途徑給藥從而發(fā)揮作用。臨床上多年來一般用口服和靜脈給藥抗心律失常，但是心律失常往往為陣發(fā)性的，而口服藥物作用較慢，靜脈給藥又多在醫(yī)院進(jìn)展。國外統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，大局部心臟性猝死發(fā)生在醫(yī)院外8。而揮發(fā)性的藥物半衰期短，副作用小，攜帶方便，便于急救。所以甘松揮發(fā)油很有可能彌補(bǔ)這一塊藥物治療的缺乏之處，故對(duì)甘松揮發(fā)油抗心律失常的研究有很大的臨床價(jià)值。本研究的局限性在于：甘松揮發(fā)油對(duì)與其他心肌細(xì)胞膜離子通道的影響還有待進(jìn)一步研究；甘松揮發(fā)油為一復(fù)合物，明確其真正發(fā)揮作用的單體成分是必要的?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1楊醫(yī)亞.中醫(yī)學(xué),第2版.北京:衛(wèi)生出版社,1984：184.2唐其柱,黃崢嶸,史錫騰,等.甘松提取物對(duì)家兔心室肌細(xì)胞鈉鈣通道的影響J.中華心血管雜志,2022,32(E2):267.3KenTanaka,KatsukKatsu.parativestudynvlatilepnentsfNardstahysRhizeJ.JurnalfNaturalediines，2022，62:1340.4葛郁芝，吳志婷，葉政助，等.甘松揮發(fā)油對(duì)心肌細(xì)胞內(nèi)向電流的影響J.心肺血管