實驗六小鼠精巢細胞減數(shù)分裂標(biāo)本的制備

1、關(guān)于實驗六小鼠精巢細胞減數(shù)分裂標(biāo)本的制備第1頁，共21頁，2022年，5月20日，22點11分，星期三【背景知識】 減數(shù)分裂（Meiosis）是發(fā)生于生殖細胞的一種特殊的細胞分裂方式，DNA復(fù)制一次，而細胞連續(xù)分裂兩次，形成單倍體的精子和卵子。減數(shù)分裂遠比有絲分裂復(fù)雜，經(jīng)兩次細胞分裂，分別稱減數(shù)分裂、減數(shù)分裂，兩次分裂間又一個較短的間期，這個間期DNA不復(fù)制。 第2頁，共21頁，2022年，5月20日，22點11分，星期三示意圖第3頁，共21頁，2022年，5月20日，22點11分，星期三一、減數(shù)分裂I 1、前期I 減數(shù)分裂的特殊過程主要發(fā)生在前期I，通常人為劃分為5個時期：細線期（lepto

2、tene）、偶線期（zygotene）、粗線期（pachytene）、雙線期（diplotene）、終變期（diakinesis）。 終變期：二價體顯著變短，并向核周邊移動，在核內(nèi)均勻散開。2、中期I3、后期I4、末期I 第4頁，共21頁，2022年，5月20日，22點11分，星期三二、減數(shù)分裂II可分為前、中、后、末四個四期，與有絲分裂相似。 第5頁，共21頁，2022年，5月20日，22點11分，星期三 實 驗 目 的學(xué)習(xí)滴片法制備單細胞懸液染色體的一般方法。以小鼠精巢細胞染色體制片為標(biāo)本觀察減數(shù)分裂過程中不同時期的染色體。 第6頁，共21頁，2022年，5月20日，22點11分，星期三

3、【試驗原理】雄性動物精子發(fā)生于睪丸曲精細管的生精上皮細胞，由其中的精原細胞經(jīng)多次有絲分裂和生長，形成初級精母細胞，初級精母細胞經(jīng)減數(shù)分裂形成次級精母細胞，次級精母細胞有絲分裂成精細胞，再經(jīng)一系列變化成精子。因此，通過分離曲細精管、剪碎并加入液體吹打，可使官腔各種細胞游離出來，然后經(jīng)過低滲、固定、染色等過程就可制成包含減數(shù)分裂各期的標(biāo)本。第7頁，共21頁，2022年，5月20日，22點11分，星期三小鼠曲細精管管腔第8頁，共21頁，2022年，5月20日，22點11分，星期三曲細精管管腔 第9頁，共21頁，2022年，5月20日，22點11分，星期三【實驗材料及用品】 1、 材料：成年雄性小白鼠

4、2、 用品：注射器、平皿、尖頭鑷子、剪刀（普通剪刀、眼科小剪刀）、吸管、離心管、離心機、玻片等。第10頁，共21頁，2022年，5月20日，22點11分，星期三實驗試劑1、100g/ml秋水仙素。2、 2檸檬酸鈉溶液3、 0.075M的KCI4、31甲醇冰醋酸及11甲醇冰醋酸（應(yīng)現(xiàn)配）5、 PH6.8，0.01M的PBS緩沖液6、Gimesa原液7、 Gimesa工作液：1份Gimesa原液加9份PH6.8，0.01M的PBS緩沖液，混勻。工作液應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)稀釋。 第11頁，共21頁，2022年，5月20日，22點11分，星期三 【實驗操作】1、注射秋水仙素，增加中期分裂相。 試驗前45小時，小鼠

5、腹腔注射秋水仙素0.5ml（100g/ml）。2、取睪丸并清洗。 斷頸處死小鼠，剖開腹部，取出腎形睪丸，放入盛有45 ml 2檸檬酸鈉溶液的平皿中清洗并去掉外面脂肪等物，棄污液。 3、挑出曲細精管并剪碎。 另加檸檬酸鈉溶液1ml，用尖頭鑷尖或解剖針將曲細精管拉出，并用眼科剪盡量將其剪碎。第12頁，共21頁，2022年，5月20日，22點11分，星期三【實驗操作】4、游離并收集細胞。 將剪碎的曲細精管及溶液移入離心管中，用吸管反復(fù)吸打12min，使盡量多的細胞從管腔中游離出來； 靜置5 min（或300rpm離心2 min），使大的膜管狀雜質(zhì)下沉； 吸上清液于另一管中，1000 rpm離心5 m

6、in，沉淀即為不同發(fā)育階段的細胞。 5、低滲處理，使細胞脹大。 加入5ml 0.075M的KCI，輕輕（為什么？）吹打混勻，靜置10 min。第13頁，共21頁，2022年，5月20日，22點11分，星期三【實驗操作】 6、預(yù)固定。 向離心管中加入1ml 31甲醇冰醋酸，輕輕吹打混勻，靜置2 min，1000 rpm離心8min，棄上清。 7、固定。 向上述沉淀中加入5ml 31甲醇冰醋酸，吹打混勻，靜置1020 min，1000 rpm離心8min，棄上清。 8、再固定。加5 ml 11甲醇冰醋酸，吹打混勻，靜置5 min，1000 rpm離心8min，棄上清，加34滴11甲醇冰醋酸固定液懸

7、浮細胞。 第14頁，共21頁，2022年，5月20日，22點11分，星期三【實驗操作】9、滴片。 滴一滴細胞懸液于冰水中剛撈出的濕載玻片上，自然干燥。10、染色。 Gimesa染液染20-30 min，流水洗去多余染液，待干 第15頁，共21頁，2022年，5月20日，22點11分，星期三【注意事項】 1、收集盡量多的細胞 2、加入低滲液后一定要輕輕吹打，以免細胞核提前破裂，引起染色體外遺、無規(guī)則排列。 3、滴片時玻片一定要帶水4、注意染色。 第16頁，共21頁，2022年，5月20日，22點11分，星期三【結(jié)果觀察】 觀察各期細胞核及染色體。第17頁，共21頁，2022年，5月20日，22點11分，星期三作業(yè)：繪制所看到的中期和中期的染色體圖，說明其中染色單體組成情況。 第18頁，共21頁，2022年，5月20日，22點11分，星期三骨髓細胞的收集1、來源豐富、個體較小的小動物骨髓細胞收集法：（1）處死動物，取長骨（2）去干凈骨上所附肉（先用刀片刮，再用紗布擦）（3）用剪刀剪開骨頭兩端（4）用注射器吸生理鹽水或低滲液將骨髓腔中細胞沖出，收集到離心管中2、大動物骨髓細胞收集：骨髓穿刺