實(shí)驗(yàn)室設(shè)備培養(yǎng)基無菌操作

1、關(guān)于實(shí)驗(yàn)室設(shè)備培養(yǎng)基無菌操作第1頁，共73頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)16分，星期三A Glimpse of Plant Tissue Culture第2頁，共73頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)16分，星期三第一節(jié) 基本設(shè)備一、實(shí)驗(yàn)室的組成實(shí)驗(yàn)室的大小取決于工作的目的和規(guī)模。以工廠化生產(chǎn)為目的，實(shí)驗(yàn)室規(guī)模太小，則會(huì)限制生產(chǎn)，影響效率。在設(shè)計(jì)組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室時(shí)，應(yīng)按組織培養(yǎng)程序來設(shè)計(jì)，避免某些環(huán)節(jié)倒排，引起日后工作混亂。植物組織培養(yǎng)是在嚴(yán)格無菌的條件下進(jìn)行的。要做到無菌的條件，需要一定的設(shè)備、器材和用具，同時(shí)還需要人工控制溫度、光照、濕度等培養(yǎng)條件。 第3頁，共73頁，2022年，5月2

2、0日，22點(diǎn)16分，星期三標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)室包括洗滌室（區(qū)）制備室（區(qū)）滅菌室（區(qū)）儲(chǔ)放室（區(qū)）操作室（區(qū)）培養(yǎng)室（區(qū)）觀察室（區(qū)）藥品室（區(qū)）實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)原則： 保證無菌操作，達(dá)到工作方便，防止污染第4頁，共73頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)16分，星期三洗滌室藥品室滅菌室貯放室配制室 走 廊 培養(yǎng)室緩沖間 接種室第5頁，共73頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)16分，星期三、洗滌室玻璃器皿和塑料器皿、洗滌包括用自來水、洗液、洗滌劑清洗、烘干包括自然晾干和烘箱干燥洗滌室用于完成玻璃器皿等儀器的清洗、干燥和貯存。室內(nèi)應(yīng)配備大型水槽，最好是白瓷水槽。為防止碰壞玻璃器皿，可鋪墊橡膠。上下水道要暢通。

3、備有塑料筐，用于運(yùn)輸培養(yǎng)器皿。備有干燥架，用于放置干燥涮凈的培養(yǎng)器皿。 第6頁，共73頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)16分，星期三、藥品室存放常用的化學(xué)試劑無機(jī)鹽類、有機(jī)物、生長調(diào)節(jié)劑等、制備室培養(yǎng)基的配制生理生化測(cè)定、儲(chǔ)存室（區(qū)）存放配制后的培養(yǎng)基或未用完的培養(yǎng)基、滅菌室即消毒室，是培養(yǎng)基、玻璃器皿、塑料器皿和其他物品消毒滅菌的地方第7頁，共73頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)16分，星期三、操作室也稱接種室，用于植物材料的消毒、接種、培養(yǎng)物的轉(zhuǎn)移、試管苗的繼代、原生質(zhì)體的制備以及一切需要進(jìn)行無菌操作的技術(shù)程序要求：干爽安靜，清潔明亮。墻壁光滑平整不易積污灰塵，地面平坦無縫便于清洗和滅

4、菌。接種室宜小不宜大，一般78平米，要求地面、天花板及四壁盡可能密閉光滑，易于清潔和消毒。配置拉動(dòng)門，以減少開關(guān)門時(shí)的空氣擾動(dòng)。在適當(dāng)位置吊裝12盞紫外線滅菌燈，用以照射滅菌。最好安裝一小型空調(diào)。 接種室應(yīng)設(shè)有緩沖間，面積1m2為宜。進(jìn)入無菌操作室前在此更衣?lián)Q鞋，以減少進(jìn)出時(shí)帶入雜菌。緩沖間最好也安一盞紫外線滅菌燈。 第8頁，共73頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)16分，星期三第9頁，共73頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)16分，星期三、培養(yǎng)室接種到培養(yǎng)瓶等器皿中的植物材料培養(yǎng)的場(chǎng)所。培養(yǎng)室的大小可根據(jù)需要培養(yǎng)架的大小、數(shù)目、及其他附屬設(shè)備而定。其設(shè)計(jì)以充分利用空間和節(jié)省能源為原則。培養(yǎng)材

5、料放在培養(yǎng)架上培養(yǎng)。培養(yǎng)架大多由金屬制成，一般設(shè)5層，最低一層離地高約10cm，其他每層間隔30cm左右，培養(yǎng)架高1.7m左右。長度根據(jù)日光燈的長度而設(shè)計(jì)， 培養(yǎng)室最重要的因子是溫度，一般2027左右，室內(nèi)濕度也要求恒定，相對(duì)濕度在70%80%為好，控制光照時(shí)間可安裝定時(shí)開關(guān)鐘，一般需要每天光照10-16h，現(xiàn)代組培實(shí)驗(yàn)室大多設(shè)計(jì)為采用天然太陽光照作為主要能源，可節(jié)省能源，且組培苗接受太陽光生長良好，馴化易成活。第10頁，共73頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)16分，星期三第11頁，共73頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)16分，星期三馴化室植物組織培養(yǎng)材料移到田間前，先移到馴化室進(jìn)行練苗，

6、待生根成活后，再移到田間苗圃。第12頁，共73頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)16分，星期三第13頁，共73頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)16分，星期三二、基本設(shè)備、烘箱洗滌室作用： 干燥洗凈的器皿高溫干熱滅菌測(cè)定培養(yǎng)物的干重氣浴第14頁，共73頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)16分，星期三、冰箱制備室作用：低溫保存材料，存放藥品、 培養(yǎng)基母液、激素、酶制劑。 超低溫冰箱：第15頁，共73頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)16分，星期三、滅菌鍋滅菌室類型：普通醫(yī)用消毒鍋大的高壓滅菌鍋?zhàn)饔茫号囵B(yǎng)基、水和各種器皿的消毒第16頁，共73頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)16分，星期三、超凈工

7、作臺(tái)操作室（接種室）類型：垂直式和水平式作用：無菌操作平臺(tái)第17頁，共73頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)16分，星期三、酸度計(jì)制備室作用：測(cè)定培養(yǎng)基及酶制劑的pH值酸度計(jì)第18頁，共73頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)16分，星期三6、顯微鏡觀察室類型：倒置顯微鏡 原生質(zhì)體觀察普通顯微鏡 染色體和葉片氣孔觀察熒光顯微鏡 細(xì)胞活力觀察解剖顯微鏡 立體觀察第19頁，共73頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)16分，星期三7、天平制備室作用： 稱取大量元素、微量元素、酶制劑第20頁，共73頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)16分，星期三8、玻璃器皿需大量的玻璃器皿。要求由堿性溶解度小的硬質(zhì)玻璃制

8、成，以保證長期貯存藥品及培養(yǎng)的效果；透光度好，能耐高壓高溫，能方便放人培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料的器皿。培養(yǎng)用的：試管、三角瓶、培養(yǎng)皿等顯微鏡下觀察用的：細(xì)胞微室、載玻片、培養(yǎng)皿等最常使用的是三角瓶，規(guī)格有l(wèi)OOml，250ml，500ml等，一般使用100ml三角瓶，無論靜止或振蕩培養(yǎng)皆適用。其培養(yǎng)面積大，利于組織生長，受光也比試管好。由于瓶口較小，亦不易污染。第21頁，共73頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)16分，星期三培養(yǎng)皿：要求上、下能密切吻合。在游離細(xì)胞、原生質(zhì)體、花粉等的靜置培養(yǎng)、看護(hù)培養(yǎng)、無菌種子的發(fā)芽、植物材料的分離等都需采用。 試管：18mmX180mm或20mmX200mm規(guī)格?？?/p>

9、用于培養(yǎng)較高的試管苗，另外也不易污染。培養(yǎng)器皿還可就地取材，采用一些代用品。廣口的200ml罐頭瓶：加蓋半透明的塑料蓋，瓶口大，大量繁殖時(shí)操作方便、工作效率高，也減少了培養(yǎng)材料的損傷。缺點(diǎn)：易引起污染。瓶口封塞：一定的通氣性和密閉性，以防止培養(yǎng)基干燥和雜菌污染。棉塞封口：夏季極易污染，且不易保持培養(yǎng)基的濕度?，F(xiàn)多采用聚丙烯塑料薄膜作為封口，以線繩結(jié)扎或橡皮圈箍扎。為了增加通氣性，可在里面襯一層硫酸紙或牛皮紙。第22頁，共73頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)16分，星期三目前，培養(yǎng)容器和制備培養(yǎng)基所需的玻璃器皿逐漸被塑料器皿所代替。塑料容器具有質(zhì)輕、透明、不易破碎、成本低等優(yōu)點(diǎn)，如培養(yǎng)容器多為

10、平底方盒形，可提高培養(yǎng)空間利用率的植株數(shù)，并能一層層地疊摞起來，從而節(jié)約空間。這類塑料制品多是采用聚丙烯材料制成，耐高溫，可進(jìn)行高壓滅菌。有些器皿為一次性消耗品，可節(jié)省洗滌人工，還可節(jié)省時(shí)間，提高效率。一次性塑料容器或帶螺絲帽的玻璃瓶，無須另外配蓋，使用時(shí)比較方便。 第23頁，共73頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)16分，星期三9、接種用具1鑷子類(forceps)根據(jù)操作需要有各種類型，鑷子過短容易使手接觸瓶口，造成污染。鑷子太長，使用起來不靈活。如在分離莖尖幼葉時(shí)，用更小的鐘表鑷子。2剪刀類(scissors)用于切斷莖段、葉片等。也可用彎形剪刀，可以深入到瓶口中進(jìn)行剪切。3解剖刀切割較

11、小材料和分離莖尖分生組織。刀片要經(jīng)常調(diào)換，使之保持鋒利狀態(tài)，否則切割時(shí)會(huì)造成擠壓，引起周圍細(xì)胞組織大量死亡，影響培養(yǎng)效果。4解剖針解剖針可深入到培養(yǎng)瓶中，轉(zhuǎn)移細(xì)胞或愈傷組織。也可用于分離微莖尖的幼葉，可自制。 第24頁，共73頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)16分，星期三第25頁，共73頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)16分，星期三10、微孔過濾器（細(xì)胞過濾器）滅菌用：如激素一般用石棉濾膜第26頁，共73頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)16分，星期三第27頁，共73頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)16分，星期三第二節(jié) 無菌操作一 、滅菌菌：細(xì)菌、真菌、放線菌、藻類及其他微生物。在自然條

12、件下忍耐力強(qiáng)，生活條件要求簡(jiǎn)單，繁殖力極強(qiáng)，條件適宜時(shí)便可大量滋生。滅菌是組織培養(yǎng)重要的工作之一。有菌的范疇是：凡是暴露在空氣中的物體，接觸自然水源的物體，至少它的表面都是有菌的。無菌室等未經(jīng)處理的地方、超凈臺(tái)表面、簡(jiǎn)單煮沸的培養(yǎng)基、我們使用的刀、剪在未處理之前、我們身體的整個(gè)外表及與外界相連的內(nèi)表，即我們呼出的氣體、培養(yǎng)容器無論洗得多干凈等等都是有菌的。第28頁，共73頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)16分，星期三無菌的范疇是：經(jīng)高溫灼燒或一定時(shí)間蒸煮過后的物體，經(jīng)其他物理的或化學(xué)的滅菌方法處理后的物體。滅菌是指用物理或化學(xué)的方法，殺死物體表面和孔隙內(nèi)的一切微生物或生物體，即把所有生命的物

13、質(zhì)全部殺死。與此相關(guān)的一個(gè)概念是消毒，它指殺死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再發(fā)生危害作用，顯然經(jīng)過消毒，許多細(xì)菌芽孢、霉菌的厚壁孢子等不會(huì)完全殺死，無菌操作：通過嚴(yán)格滅菌的操作空間(接種室、超凈臺(tái)、等)和使用的器皿，以及操作者的衣著和手都不帶任何活著的微生物。在這樣的條件下進(jìn)行的操作。第29頁，共73頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)16分，星期三常用的滅菌方法可分為物理的和化學(xué)的兩類：物理方法：干熱(烘燒和灼燒)、濕熱(常壓或高壓蒸煮)、射線處理(紫外線、超聲波、微波)、過濾、清洗和大量無菌水沖洗等措施；化學(xué)方法：使用升汞、甲醛、過氧化氫、高錳酸鉀、來蘇兒、漂白粉、次氯酸鈉、抗菌素、酒

14、精化學(xué)藥品處理。方法和藥劑要根據(jù)工作中的不同材料不同目的適當(dāng)選用。具體措施如下：第30頁，共73頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)16分，星期三1、濕熱滅菌（培養(yǎng)基）培養(yǎng)基在制備后的24h內(nèi)完成滅菌工序。原理：在密閉的蒸鍋內(nèi)，蒸氣不能外溢，壓力不斷上升，使水的沸點(diǎn)不斷提高，從而鍋內(nèi)溫度也隨之增加。在0.1MPa的壓力下，鍋內(nèi)溫度達(dá)121。可殺死各種細(xì)菌及其高度耐熱的芽孢。注意完全排除鍋內(nèi)空氣，使鍋內(nèi)全部是水蒸氣，使鍋內(nèi)均勻升溫,滅菌才能徹底。 常用排氣方法是：關(guān)閉放氣閥，通電后，待壓力上升到O.05MPa時(shí)，打開放氣閥，放出空氣，待壓力表指針歸零后，再關(guān)閉放氣閥。關(guān)閥再通電后，壓力表上升達(dá)到0

15、.1MPa時(shí)壓力0.1-0.15MPa，20min。第31頁，共73頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)16分，星期三培養(yǎng)基滅菌要嚴(yán)格遵守保壓時(shí)間，既要保壓徹底，又要防止培養(yǎng)基中的成分變質(zhì)或效力降低。對(duì)于一些布制品，如實(shí)驗(yàn)服、口罩等也可用高壓滅菌。洗凈晾干后用耐高壓塑料袋裝好，高壓滅菌20-30min。高壓滅菌后的培養(yǎng)基，其pH值下降0.2-0.3單位。高壓后培養(yǎng)基pH值的變化方向和幅度取決于多種因素。培養(yǎng)基中成分單一時(shí)和培養(yǎng)基中含有高或較高濃度物質(zhì)時(shí)，高壓滅菌后的pH值變化幅度較大，甚至可大于2個(gè)pH值單位。環(huán)境pH值的變化大于0.5單位就有可能產(chǎn)生明顯的生理影響。高壓滅菌通常使培養(yǎng)基中的蔗糖

16、水解為單糖，從而改變培養(yǎng)基的滲透壓。在8%-20%蔗糖范圍內(nèi)，高壓滅菌后的培養(yǎng)基約升高0.43倍。鐵在高壓滅菌時(shí)會(huì)催化蔗糖水解，可使15%-25%的蔗糖水解為葡萄糖和果糖。培養(yǎng)基pH值小于5.5，其水解量更多，培養(yǎng)基中添加0.1%活性炭時(shí)，蔗糖水解大大增強(qiáng)。第32頁，共73頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)16分，星期三防止高壓滅菌培養(yǎng)基變化的方法：(1)經(jīng)常注意搜集有關(guān)高壓滅菌影響培養(yǎng)基成分的資料，及時(shí)采取有效措施。(2)設(shè)計(jì)培養(yǎng)基配方時(shí)盡量采用效果類似的穩(wěn)定試劑并準(zhǔn)確掌握劑量。如避免使用果糖和山梨醇而用甘露醇，以IBA代替IAA，控制活性炭的用量(在0.1%以下)注意pH值對(duì)高壓滅菌下培養(yǎng)

17、基中成分的影響等。(3)配制培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)注意成分的適當(dāng)分組與加入的順序。如將磷、鈣和鐵放在最后加入。(4)注意高壓滅菌后培養(yǎng)基pH值的變化及回復(fù)動(dòng)態(tài)。如高壓滅菌后的pH值常由5.80升高至6.48。而96h后又回降至5.8左右。在實(shí)驗(yàn)中就可以根據(jù)這一規(guī)律加以掌握。第33頁，共73頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)16分，星期三2.灼燒滅菌（用于無菌操作的器械 ）在無菌操作時(shí)，把鑷子、剪子、解剖刀等浸入95%的酒精中，使用之前取出在酒精燈火焰處灼燒滅菌。冷卻后，立即使用。 第34頁，共73頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)16分，星期三3.干熱滅菌（玻璃器皿及耐熱用具）原理：利用烘箱加熱到160-

18、180殺死微生物。在干熱條件下，細(xì)菌的營養(yǎng)細(xì)胞的抗熱性大為提高，接近芽孢的抗熱水平，通常采用170持續(xù)90min來滅菌。干熱滅菌的物品要預(yù)先洗凈并干燥，工具等要妥為包扎，以免滅菌后取用時(shí)重新污染。包扎可用耐高溫的塑料。滅菌時(shí)應(yīng)漸進(jìn)升溫，達(dá)到預(yù)定溫度后記錄時(shí)間。烘箱內(nèi)放置的物品的數(shù)量不宜過多，以免妨礙熱對(duì)流和穿透，待充分冷涼，才能打開烘箱。缺點(diǎn)：能源消耗太大，浪費(fèi)時(shí)間。第35頁，共73頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)16分，星期三4.過濾滅菌（不耐熱的物質(zhì) ）一些生長調(diào)節(jié)劑，如赤霉素、玉米素、脫落酸和某些維生素不耐熱，不能用高壓滅菌處理，通常采用過濾滅菌方法。防細(xì)菌濾膜的網(wǎng)孔的直徑為0.45m

19、以下，當(dāng)溶液通過濾膜后，細(xì)菌的細(xì)胞和真菌的孢子等因大于濾膜網(wǎng)孔直徑而被阻。在需要過濾滅菌的液體量大時(shí)，常使用抽濾裝置；液量小時(shí)，可用注射器。使用前對(duì)其高壓滅菌，第36頁，共73頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)16分，星期三5.紫外線和熏蒸滅菌（空間）(1)紫外線滅菌 使細(xì)菌蛋白質(zhì)和核酸發(fā)生結(jié)構(gòu)變化。紫外線以260nm的殺菌能力最強(qiáng)，但穿透物質(zhì)的能力很弱，只適于空氣和物體表面的滅菌，且要求距照射物以不超過1.2m為宜。(2)熏蒸滅菌 加熱焚燒、氧化等使化學(xué)藥劑變?yōu)闅怏w狀態(tài)擴(kuò)散，以殺死空氣和物體表面的微生物。方法簡(jiǎn)便。 常用：甲醛，用量5-8ml/m3，加5g/m3高錳酸鉀氧化揮發(fā)。房間可預(yù)先噴

20、濕以加強(qiáng)效果。冰醋酸也可。 化學(xué)消毒劑的種類很多，一般說來，溫度越高，作用時(shí)間越長，殺菌效果越好。另外，消毒劑要制成水溶狀態(tài)，如升汞與高錳酸鉀。消毒劑一般是濃度越大，殺菌能力越強(qiáng)，但石炭酸和酒精例外。第37頁，共73頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)16分，星期三6.噴霧滅菌（物體表面）物體表面可用一些藥劑涂擦、噴霧滅菌。如桌面、墻面、雙手、植物材料表面等，70-75%的酒精反復(fù)涂擦滅菌l%-2%的來蘇兒溶液0.25%-1%的新潔爾滅第38頁，共73頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)16分，星期三7.植物材料表面消毒劑滅菌從外界或室內(nèi)選取的植物材料，都不同程度地帶有各種微生物。這些污染源一旦帶

21、入培養(yǎng)基，會(huì)造成培養(yǎng)基污染。因此，植物材料必須經(jīng)嚴(yán)格的表面滅菌處理。材料經(jīng)無菌操作手續(xù)接到培養(yǎng)基上的過程叫做接種。 主要步驟：第39頁，共73頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)16分，星期三第一步：材料水洗 切割成適當(dāng)大小。置自來水龍頭下流水沖洗幾分鐘至數(shù)小時(shí)。易漂浮或細(xì)小的材料，可裝入紗布袋內(nèi)沖洗。流水沖洗在污染嚴(yán)重時(shí)特別有用。 洗時(shí)可加入洗衣粉清洗，再用自來水沖凈洗衣粉水?？沙ポp度附著在植物表面的污物，脂質(zhì)性的物質(zhì)。最理想的清洗物表面活性物質(zhì)：吐溫。第二步：對(duì)材料的表面浸潤滅菌。在超凈臺(tái)或接種箱內(nèi)完成，準(zhǔn)備好消毒的燒杯、玻璃棒、70%酒精、消毒液、無菌水、手表等。用70%酒精浸1030s

22、。 酒精使植物材料表面易被浸濕，70%酒精穿透力強(qiáng)，易殺傷植物細(xì)胞，故浸潤時(shí)間不能過長。有一些特殊的材料，如果實(shí)、花蕾、包有苞片、苞葉等的孕穗，多層鱗片的休眠芽等等，以及主要取用內(nèi)部的材料，酒精處理可稍長。第40頁，共73頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)16分，星期三第三步：滅菌劑處理。表面滅菌劑的種類較多，可根據(jù)情況選取12種使用。常用滅菌劑使用濃度及效果比較表滅菌劑使用濃度(%)持續(xù)時(shí)間（min）去除的難易效果次氯酸鈣9-105-30易很好次氯酸鈉25-30易很好氯化汞0.1-15-8較難最好抗菌素4-50mg/L30-60中較好第41頁，共73頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)16分，

23、星期三除氯化汞，上述滅菌劑應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用。次氯酸鈉和次氯酸鈣都是利用分解產(chǎn)生氯氣來殺菌的，故滅菌時(shí)加蓋較好；升汞是由重金屬汞離子來達(dá)到滅菌的；過氧化氫是分解中釋放原子態(tài)氧來殺菌的，殘留的影響較小，滅菌后用無菌水涮洗34次即可。滅菌時(shí)間是從倒入消毒液開始，至倒入無菌水時(shí)為止。記錄時(shí)間還便于比較消毒效果。滅菌液要充分浸沒材料，寧可多用些滅菌液。在滅菌溶液中加吐溫-80或Triton X效果較好，使藥劑更易于展布，更容易浸入到滅菌的材料表面。但吐溫加入后對(duì)材料的傷害也在增加，應(yīng)注意吐溫的用量和滅菌時(shí)間。第四步：無菌水涮洗，每次3min左右，涮洗3-l0次左右?？擅獬緞参锛?xì)胞的副作用。升汞殘毒較

24、難去除，應(yīng)當(dāng)多洗幾次。第42頁，共73頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)16分，星期三二、無菌操作接種時(shí)由于有一個(gè)敞口的過程，極易引起污染，主要由空氣中的細(xì)菌和工作人員本身引起，接種室要嚴(yán)格進(jìn)行空間消毒。接種室內(nèi)保持定期用1%-3%的高錳酸鉀溶液對(duì)設(shè)備、墻壁、地板等進(jìn)行擦洗。除了使用前用紫外線和甲醛滅菌外，還可在使用期間用70%的酒精或3%的來蘇兒噴霧，使空氣中灰塵顆粒沉降下來。無菌操作可按以下步驟進(jìn)行： 第43頁，共73頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)16分，星期三(1)接種4h前用甲醛熏蒸接種室，并打開其內(nèi)紫外燈進(jìn)行滅菌；(2)接種前20min，打開超凈工作臺(tái)的風(fēng)機(jī)以及臺(tái)上的紫外燈；(3

25、)先洗凈雙手，在緩沖間換好專用實(shí)驗(yàn)服，并換穿拖鞋等；(4)上工作臺(tái)后，用酒精棉球擦拭雙手，特別是指甲處。然后擦拭工作臺(tái)面；(5)先用酒精棉球擦拭接種工具，再將鑷子和剪子從頭至尾過火一遍，然后反復(fù)過火尖端處，對(duì)培養(yǎng)皿要過火烤干；(6)接種時(shí)，雙手不能離開工作臺(tái)，不能說話、走動(dòng)和咳嗽等；(7)接種完畢后要清理干凈工作臺(tái)，可用紫外燈滅菌30min。若連續(xù)接種，每5天要大強(qiáng)度滅菌一次。第44頁，共73頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)16分，星期三三、接種(1)材料吸干后，一手拿鑷子，一手拿剪子或解剖刀，對(duì)材料進(jìn)行適當(dāng)?shù)那懈?。如葉片：0.5cm見方的小塊；莖：含有一個(gè)節(jié)的小段。微莖尖剝成只含l-2片幼

26、葉。接種過程中要經(jīng)常灼燒接種器械，防止交叉污染。(2) 將切割好的外植體插植或放置到培養(yǎng)基上。 具體過程是：揭開蓋子 試管口過火 夾取材料插入培養(yǎng)基 試管口過火 加蓋子 先解開包口紙，將試管幾乎水平拿著，使試管口靠近酒精燈火焰，并將管口在火焰上方轉(zhuǎn)動(dòng)，使管口里外灼燒數(shù)秒鐘。然后用鑷子夾取一塊切好的外植體送入試管內(nèi)，輕輕插入培養(yǎng)基。材料放置方法除莖尖、莖段要正放(尖端向上)外，其他尚無統(tǒng)一要求。放置材料數(shù)量現(xiàn)在傾向少放，一旦培養(yǎng)物污染可以拋棄，接完種后，將管口在火焰上再灼燒數(shù)秒鐘。加蓋。第45頁，共73頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)16分，星期三第46頁，共73頁，2022年，5月20日，2

27、2點(diǎn)16分，星期三第三節(jié) 培養(yǎng)基組成及母液配制培養(yǎng)基culture medium是植物組織培養(yǎng)的重要基質(zhì)。在離體培養(yǎng)條件下，不同種植物的組織對(duì)營養(yǎng)有不同的要求，甚至同一種植物不同部位的組織對(duì)營養(yǎng)的要求也不相同，只有滿足了它們各自的特殊要求，它們才能很好地生長。沒有一種培養(yǎng)基能夠適合一切類型的植物組織或器官，在建立一項(xiàng)新的培養(yǎng)系統(tǒng)時(shí)，首先必須找到一合適的培養(yǎng)基，培養(yǎng)才有可能成功。在植物組織培養(yǎng)歷史進(jìn)程中，事實(shí)上也緊密地伴隨著培養(yǎng)基的研制史。對(duì)植物的營養(yǎng)要求的不斷認(rèn)識(shí)，對(duì)已有培養(yǎng)基的改進(jìn)，或者將新發(fā)現(xiàn)的植物激素、新的有益成分應(yīng)用于培養(yǎng)基之中，都大大促進(jìn)了組織培養(yǎng)研究的迅速發(fā)展。第47頁，共73頁，

28、2022年，5月20日，22點(diǎn)16分，星期三 一、培養(yǎng)基的種類根據(jù)不同的植物和培養(yǎng)部位及不同的培養(yǎng)目的需選用不同的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基的產(chǎn)生最早是Sacks(1680)和Knop(1681)，他們對(duì)綠色植物的成分進(jìn)行了分析研究，根據(jù)植物從土中主要是吸收無機(jī)鹽營養(yǎng)，設(shè)計(jì)出了由無機(jī)鹽組成的Sacks和Knop溶液，至今仍在作為基本的無機(jī)鹽培養(yǎng)基得到廣泛應(yīng)用。以后根據(jù)不同目的進(jìn)行改良產(chǎn)生了多種培養(yǎng)基，White培養(yǎng)基在40年代用得較多，現(xiàn)在還常用。而到60和70年代則大多采用MS等高濃度培養(yǎng)基，可以保證培養(yǎng)材料對(duì)營養(yǎng)的需要，并能生長快、分化快，且由于濃度高，在配制、消毒過程中某些成分有些出入，也不致影響培

29、養(yǎng)基的離子平衡培養(yǎng)基的名稱，多數(shù)以發(fā)明人的名字來命名，如White培養(yǎng)基，Murashige和Skoog培養(yǎng)基(簡(jiǎn)稱MS培養(yǎng)基)，也有對(duì)某些成分進(jìn)行改良稱作改良培養(yǎng)基。第48頁，共73頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)16分，星期三常用的培養(yǎng)基及特點(diǎn)如下：(1)MS培養(yǎng)基 1962年由Murashige和Skoog為培養(yǎng)煙草細(xì)胞而設(shè)計(jì)的。特點(diǎn)是無機(jī)鹽和離子濃度較高，為較穩(wěn)定的平衡溶液。其養(yǎng)分的數(shù)量和比例較合適，可滿足植物的營養(yǎng)和生理需要。它的硝酸鹽含量較其他培養(yǎng)基為高，廣泛地用于植物的器官、花藥、細(xì)胞和原生質(zhì)體培養(yǎng)，效果良好。有些培養(yǎng)基是由它演變而來的。(2)B5培養(yǎng)基 1968年由Gambo

30、rg等為培養(yǎng)大豆根細(xì)胞而設(shè)計(jì)的。其主要特點(diǎn)是含有較低的銨，這可能對(duì)不少培養(yǎng)物的生長有抑制作用。從實(shí)踐得知有些植物在B5培養(yǎng)基上生長更適宜，如雙子葉植物特別是木本植物。(3)White培養(yǎng)基 1943年由White為培養(yǎng)番茄根尖而設(shè)計(jì)的。1963年又作了改良，稱作White改良培養(yǎng)基，提高了MgSO4：的濃度和增加了硼素。其特點(diǎn)是無機(jī)鹽數(shù)量較低，適于生根培養(yǎng)。 第49頁，共73頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)16分，星期三(4)N6培養(yǎng)基 1974年朱至清等為水稻等禾谷類作物花藥培養(yǎng)而設(shè)計(jì)的。其特點(diǎn)是成分較簡(jiǎn)單，KN03和(NH4)2S04含量高。在國內(nèi)已廣泛應(yīng)用于小麥、水稻及其他植物的花藥培

31、養(yǎng)和其他組織培養(yǎng)。(5)KM-8P培養(yǎng)基 1974年為原生質(zhì)體培養(yǎng)而設(shè)計(jì)的。其特點(diǎn)是有機(jī)成分較復(fù)雜，它包括了所有的單糖和維生素，廣泛用于原生質(zhì)融合的培養(yǎng)。 第50頁，共73頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)16分，星期三MS培養(yǎng)基成分表成分母液MS培養(yǎng)基大量元素NH4NO3KNO3CaCl2H2OKH2PO4 MgSO47H2O mg/L(100)165000190000440001700037000mg/L16501900440170370 第51頁，共73頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)16分，星期三微量元素mg/L(100)mg/LMnSO44H2OZnSO44H2OH3BO3KINa

32、2MoO42H2OCuSO45H2OCoCl26H2O 223086062083252.52.5 22.38.66.20.830.250.0250.025 第52頁，共73頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)16分，星期三鐵鹽Na2EDTA FeSO47H2O mg/L(100)37252785 mg/L37.2527.85 有機(jī)物質(zhì)甘氨酸硫銨素?zé)熕猁}酸吡哆醇肌醇 mg/L(100)20040505010000 mg/L2.00.40.50.5100 第53頁，共73頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)16分，星期三二、培養(yǎng)基的成分水、無機(jī)鹽、有機(jī)物、天然復(fù)合物、培養(yǎng)體的支持材料等五大類。1水水是

33、植物原生質(zhì)體的組成成分，也是一切代謝過程的介質(zhì)和溶媒。配制培養(yǎng)基母液時(shí)要用蒸餾水，以保持母液及培養(yǎng)基成分的精確性，防止貯藏過程發(fā)霉變質(zhì)。大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)可用自來水。2、無機(jī)元素(inorganicelement) 指濃度大于0.5mmolL的元素：N，P，K，Ca，Mg，S等。(1)N 蛋白質(zhì)、酶、葉綠素、維生素、核酸、磷脂、生物堿等的組成成分。在制備培養(yǎng)基時(shí)以N03-N和NH4-N兩種形式供應(yīng)。NH4-N對(duì)植物生長較為有利。供應(yīng)的物質(zhì)有KN03、NH4NO3等。也可添加氨基酸。第54頁，共73頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)16分，星期三(2)P ： 磷脂的主要成分。磷脂又是原生質(zhì)、細(xì)胞核的重

34、要組成部分。磷也是ATP、ADP等的組成成分。向培養(yǎng)基內(nèi)添加磷，不僅增加養(yǎng)分、提供能量，而且也促進(jìn)對(duì)N的吸收，增加蛋白質(zhì)在植物體中的積累。常用的物質(zhì)有KH2P04或NaH2P04等。(3)K ：和碳水化合物合成、轉(zhuǎn)移、以及氮素代謝等有密切關(guān)系。K增加時(shí)，蛋白質(zhì)合成增加，維管束、纖維組織發(fā)達(dá)，對(duì)胚的分化有促進(jìn)作用。但濃度不易過大，一般為1-3mgL為好。制備培養(yǎng)基時(shí)，常以KCl、KNO3等鹽類提供。 第55頁，共73頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)16分，星期三(4)Mg、S和Ca Mg 是葉綠素的組成成分，又是激酶的活化劑；S是含S氨基酸和蛋白質(zhì)的組成成分。它們常以MgS047H20提供。用

35、量為1-3mgL較為適宜；Ca是構(gòu)成細(xì)胞壁的一種成分，Ca對(duì)細(xì)胞分裂、保護(hù)質(zhì)膜不受破壞有顯著作用，常以CaCl22H20提供。(5)微量元素 指小于0.5mmolL的元素，F(xiàn)e，B，Mn，Cu，Mo，Co等。鐵是一些氧化酶、細(xì)胞色素氧化酶、過氧化氫酶等的組成成分。又是葉綠素形成的必要條件。培養(yǎng)基中的鐵對(duì)胚的形成、芽的分化和幼苗轉(zhuǎn)綠有促進(jìn)作用。在制做培養(yǎng)基時(shí)不用Fe2 (S04) 3和FeCl3 (因其在pH值5.2以上，易形成不溶性沉淀)，而用FeS047H20和Na2-EDTA結(jié)合成螯合物使用。B，Mn，Zn，Cu，Mo，Co等，缺少這些物質(zhì)會(huì)導(dǎo)致生長、發(fā)育異?，F(xiàn)象。第56頁，共73頁，20

36、22年，5月20日，22點(diǎn)16分，星期三3有機(jī)化合物(organic compound)培養(yǎng)基中若只含有大量元素與微量元素，常稱為基本培養(yǎng)基。為不同的培養(yǎng)目的往往要加入一些有機(jī)物以利于快速生長。常加入的有機(jī)成分主要有以下幾類：(1)碳水化合物 常用的碳源是蔗糖，葡萄糖和果糖也可，可支持許多組織很好的生長。麥芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖在組織培養(yǎng)中也有應(yīng)用。蔗糖使用濃度在2-3，常用3，但在胚培養(yǎng)時(shí)采用4-15的高濃度，因蔗糖對(duì)胚狀體的發(fā)育起重要作用。不同糖類對(duì)生長的影響不同。不同植物不同組織的糖類需要量也不同。高壓滅菌時(shí)一部分糖發(fā)生分解、制定配方時(shí)要給予考慮。在大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)，綿白糖成本低。第57

37、頁，共73頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)16分，星期三 (2)維生素(vitamin) 主要以各種輔酶的形式參與多種代謝活動(dòng)，對(duì)生長、分化等有很好的促進(jìn)作用。大多數(shù)的植物細(xì)胞在培養(yǎng)中都能合成所必需的維生素，但數(shù)量上還明顯不足，通常需加入一至數(shù)種維生素。 主要有VB1(鹽酸硫胺素)、VB6 (鹽酸吡哆醇)、Vpp(煙酸)、VC(抗壞血酸)、有時(shí)還使用Wh生物素、葉酸、VB2等。一般用量為0.1-1.OmgL。有時(shí)用量較高。VB1對(duì)愈傷組織的產(chǎn)生和生活力有重要作用，VB6能促進(jìn)根的生長，Vpp與植物代謝和胚的發(fā)育有一定關(guān)系。Vc有防止組織變褐的作用。第58頁，共73頁，2022年，5月20日，

38、22點(diǎn)16分，星期三(3)肌醇 又叫環(huán)己六醇，在糖類的相互轉(zhuǎn)化中起重要作用。通常可由磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)化而成，還可進(jìn)一步生成果膠物質(zhì)，用于構(gòu)建細(xì)胞壁。肌醇與6分子磷酸殘基相結(jié)合形成植酸，植酸與鈣、鎂等陽離子結(jié)合成植酸鈣鎂，植酸可進(jìn)一步形成磷脂，參與細(xì)胞膜的構(gòu)建。使用濃度一般為100mgL，適當(dāng)使用肌醇，能促進(jìn)愈傷組織的生長以及胚狀體和芽的形成。對(duì)組織和細(xì)胞的繁殖、分化有促進(jìn)作用，對(duì)細(xì)胞壁的形成也有作用。(4)氨基酸(aminoacide) 很好的有機(jī)氮源，可直接被細(xì)胞吸收利用。最常用的氨基酸是甘氨酸，其他的如精氨酸、谷氨酸、谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等也常用。有時(shí)應(yīng)用水解乳蛋白或水解酪蛋白，

39、它們是牛乳用酶法等加工的水解產(chǎn)物，是含有約20種氨基酸的混合物，用量在10-1000mgL之間。營養(yǎng)豐富，極易引起污染。第59頁，共73頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)16分，星期三(5)天然復(fù)合物成分比較復(fù)雜，大多不清楚，多含氨基酸、激素、酶等一些復(fù)雜化合物。它對(duì)細(xì)胞和組織的增殖與分化有明顯的促進(jìn)作用，但對(duì)器官的分化作用不明顯。一般應(yīng)盡量避免使用。1)椰乳 椰子的液體胚乳。是使用最多、效果最大的一種天然復(fù)合物。一般使用濃度在10-20，與其果實(shí)成熟度及產(chǎn)地關(guān)系也很大。它在愈傷組織和細(xì)胞培養(yǎng)中有促進(jìn)作用。在馬鈴薯莖尖分生組織和草莓微莖尖培養(yǎng)中起明顯的促進(jìn)作用，但莖尖組織的大小若超過1mm時(shí)，

40、椰乳就不發(fā)生作用。2)香蕉 用量為150-200ml/l。用黃熟的香蕉，加入培養(yǎng)基后變?yōu)樽仙?。?duì)pH值的緩沖作用大。主要在蘭花的組織培養(yǎng)中應(yīng)用，對(duì)發(fā)育有促進(jìn)作用。第60頁，共73頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)16分，星期三3)水解酪蛋白 蛋白質(zhì)的水解物，主要成分為氨基酸，使用濃度為100-200mgL。受酸和酶的作用易分解，使用時(shí)要注意。4)其他 酵母提取液(YE)(0.01-0.05)，成分為氨基酸和維生素類；麥芽提取液(001-05)、蘋果和番茄的果汁、黃瓜的果實(shí)、未熟玉米的胚乳等。遇熱較穩(wěn)定，大多在培養(yǎng)困難時(shí)使用，有時(shí)有效。 第61頁，共73頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)16分，

41、星期三4植物激素(hormone)激素：能以極微小的量影響到植物的細(xì)胞分化、分裂、發(fā)育，影響到植物的形態(tài)建成、開花、結(jié)實(shí)、成熟、脫落、衰老和休眠以及萌發(fā)等許多的生理生化活動(dòng)，在培養(yǎng)基的各成分中，植物激素是培養(yǎng)基的關(guān)鍵物質(zhì)，對(duì)植物組織培養(yǎng)起著決定性作用。(1)生長素類(auxin) 主要用于誘導(dǎo)愈傷組織形成，誘導(dǎo)根的分化和促進(jìn)細(xì)胞分裂、伸長生長。在促進(jìn)生長方面，根對(duì)生長素最敏感。在極低的濃度下，就可促進(jìn)生長，其次是莖和芽。天然的生長素?zé)岱€(wěn)定性差，高溫高壓或受光條件易被破壞。在植物體內(nèi)也易受到體內(nèi)酶的分解。組織培養(yǎng)中常用人工合成的生長素類物質(zhì)。第62頁，共73頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)16

42、分，星期三IAA(indoaceticacid吲哚乙酸)天然存在，亦可人工合成，是生長素中活力最弱的激素，對(duì)器官形成的副作用小，高溫高壓易被破壞，受光也易分解。NAA(naphthaleneaceticacid萘乙酸) 起動(dòng)能力比IAA高3-4倍，可人工合成，耐高溫高壓，應(yīng)用較普遍。NAA和IBA廣泛用于生根，并與細(xì)胞分裂素互作促進(jìn)芽的增殖和生長。IBA(indolebutyric acid吲哚丁酸)促進(jìn)發(fā)根能力較強(qiáng)的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)。 2,4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)起動(dòng)能力比IAA高10倍，特別在促進(jìn)愈傷組織的形成上活力最高，但強(qiáng)烈抑制芽的形成，影響器官的發(fā)育。適宜的用量范圍較狹窄，過量常有

43、毒效應(yīng)。生長素配制時(shí)可先用少量95酒精助溶。2,4-D可用01molL的NaOH或KOH助溶。生長素常配成1mg / ml的溶液貯于冰箱中備用。第63頁，共73頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)16分，星期三(2)GA(gibberellicacid赤霉素) 有20多種，生理活性及作用的種類、部位、效應(yīng)等各有不同。常用的是GA3，主要用于促進(jìn)幼苗莖的伸長生長，促進(jìn)不定胚發(fā)育成小植株；赤霉素和生長素協(xié)同作用，對(duì)形成層的分化有影響，當(dāng)生長素赤霉素比值高時(shí)有利于木質(zhì)部分化，比值低時(shí)有利于韌皮部分化；此外，赤霉素還用于打破休眠，促進(jìn)種子、塊莖、鱗莖等提前萌發(fā)。一般在器官形成后，添加赤霉素可促進(jìn)器官或胚

44、狀體的生長。赤霉素溶于酒精，配制時(shí)可用少量95酒精助溶。赤霉素不耐熱，高壓滅菌后將有70-100失效，應(yīng)當(dāng)采用過濾滅菌法加入。 第64頁，共73頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)16分，星期三(3)細(xì)胞分裂素類(cytokinin) 這類激素是腺嘌呤的衍生物，包括6-BA(6-芐基氨基嘌呤)、KT(kinetin激動(dòng)素)、ZT(zeatin玉米素)等。其中ZT活性最強(qiáng)，但非常昂貴，常用的是6-BA。細(xì)胞分裂素有三個(gè)作用：誘導(dǎo)芽的分化促進(jìn)側(cè)芽萌發(fā)生長，細(xì)胞分裂素與生長素相互作用，當(dāng)組織內(nèi)細(xì)胞分裂素生長素的比值高時(shí)，誘導(dǎo)愈傷組織或器官分化出不定芽。促進(jìn)細(xì)胞分裂與擴(kuò)大。抑制根的分化。因此，細(xì)胞分裂素

45、多用于誘導(dǎo)不定芽的分化、莖、苗的增殖，而避免在生根培養(yǎng)時(shí)使用。第65頁，共73頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)16分，星期三生長素與細(xì)胞分裂素的比例決定著發(fā)育的方向，是愈傷組織、是長根還是長芽。如為了促進(jìn)芽的分化，應(yīng)除去或降低生長素的濃度，或者調(diào)整培養(yǎng)基中生長素與細(xì)胞分裂素的比例。TDZ：（噻苯隆）新型植物生長調(diào)節(jié)劑，有很強(qiáng)的細(xì)胞分裂素活性(CTK)，其CTK活性比一般CTK高幾十倍至幾百倍，可促進(jìn)植物芽的再生和繁殖，打破芽的休眼，促進(jìn)種子萌發(fā)，促進(jìn)愈傷組織生長，延緩植物衰老等。并且可以對(duì)其它的植物激素和生理活性物質(zhì)的作用來調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育過程。其他激素：ABA，乙烯，水楊酸，生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的使用量甚微，一般用mgL表示濃度。在組織培養(yǎng)中生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的使用濃度，因植物的種類、部位、時(shí)期、內(nèi)源激素等的不同而異，一般生長素濃度的使用為0.05-5mgL，細(xì)胞分裂素0.05-10mgL。 第66頁，共73頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)16分，星期三第67頁，共73頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)16分，星期三5 .培養(yǎng)材料的支持物 (1)瓊脂(agar) 固化劑本身不提供任何營養(yǎng)。溶解在熱水中，成為溶膠，冷卻至40即凝固為固體狀凝膠。瓊脂的用量在6-10gL之間，一般以顏色淺、透明度好、潔凈的為上品。瓊