復旦藥學專業(yè)課課件相關(guān)專業(yè)復試看藥物分析第十四章

1、第十四章 中藥及其制劑分析概論（二）主要內(nèi)容第一節(jié)： 概述中藥及其制劑分析的特點中藥及其制劑的分類與質(zhì)量分析要點中藥及其制劑中待測成分的提取分離與純化方法主要內(nèi)容第二節(jié)：中藥及其制劑分析的一般程序取樣和樣品保存中藥及其制劑的鑒別中藥及其制劑的雜質(zhì)檢查中藥及其制劑的含量測定主要內(nèi)容第三節(jié)：中藥指紋圖譜研究技術(shù)中藥指紋圖譜的定義及基本屬性中藥指紋圖譜的類型中藥指紋圖譜研究的技術(shù)關(guān)鍵中藥指紋圖譜研究示例第二節(jié) 中藥及其制劑的一般分析程序 藥材和中藥飲片的法定標準為國家藥品標準和地方標準或炮制規(guī)范； 提取物和有效成分的法定標準為國家藥品標準取樣和樣品保存 供試品溶液的制備 鑒別：性狀、顯微、理化 檢查

2、：一般理化檢查項目和雜質(zhì)檢查 含量測定 檢查紀錄 中藥分析程序鑒定有臨床療效的已知成分黃連 小檗堿（抗菌消炎） 麻黃 麻黃堿（支氣管哮喘）烏頭 烏頭堿（毒性）洋地黃 強心苷（強心）延胡索 延胡索乙素（鎮(zhèn)痛）二、中藥及其制劑的鑒別 選取原則1. 單味制劑-選該制劑；復方制劑-按君、臣、佐、使選擇；2. 藥味多時，首選君、臣藥、貴重藥、毒劇藥；3. 原粉入藥，顯微鑒別；4. 不少于1/3的藥味鑒別性狀鑒別理化鑒別顯微鑒別（一） 性狀鑒別 利用外觀、形狀及感官性質(zhì) 參照國家藥典、藥品標準和中藥鑒定學藥材鑒定通則（二） 顯微鑒別 （含生藥粉制劑） 丸劑、片劑、膠囊劑、散劑快速，簡便，覆蓋面大 顯微組織

3、鑒別法：中藥材的組織構(gòu)造、細胞形狀和內(nèi)含物的特征顯微化學鑒別法：確定特殊化學成分的存在及在組織中的分布情況顯微鏡（普通光學、電子）適用情況1、含原藥材粉末的中藥制劑；2、藥材及炮制品的外形鑒別特征不明顯或外形相似難于鑒別或組織構(gòu)造不同時；3、藥材破碎或粉末肉眼不易辨別或區(qū)分時。選擇原則 1、應(yīng)選有專屬性的特征進行鑒別，多味藥共同的特征不適用2、多來源的藥材應(yīng)選擇共有的特征進行鑒別3、顯微特征應(yīng)明顯、易見1、水牛角濃縮粉 2、麝香 3、珍珠 4、朱砂 5、雄黃 6、黃連 7、梔子 8、郁金 9、黃芩 安宮牛黃丸 （三）理化鑒別 抗干擾能力差 顯微化學反應(yīng)法微量升華法顏色、沉淀反應(yīng)法熒光與分光光度

4、法方法藥材 加入試劑 顯色、熒光 黃連粉末黃色結(jié)晶(顯微鏡下觀察)稀鹽酸黃連粉末的鑒別 例： 置載玻片上1. 顯微化學反應(yīng)法微量升華法適用于一些具有升華性成分的中藥材及其制劑加熱冷卻2. 微量升華法如大黃、牡丹皮、薄荷等；主要是一些蒽醌、酚類、揮發(fā)油3. 顏色、沉淀反應(yīng)法是常用的鑒別方法中藥成分復雜，在應(yīng)用中應(yīng)注意排除干擾。樣品醚層褪色乙醚KMnO4蒼術(shù)酮蒼術(shù)炔二妙丸中蒼術(shù)的鑒別 例：4. 熒光法與分光光度法 有特征的光譜峰，適用于顯微特征和化學反應(yīng)相似的中藥TLC法應(yīng)用最多 （Rf、顏色、熒光） GC法 適用于含揮發(fā)性成分 的藥物 HPLC法常與含量測定同時進行 (四) 色譜鑒別法薄層色譜法

5、（TLC）樣品需要預制備（分離、富集）溶劑提取法蒸餾法升華法柱色譜法1. 供試品溶液的制備 2. 色譜條件選擇 要求規(guī)定一種活度的吸附劑，選用1-2種通用展開劑1）薄層板的選擇 硅膠G板(可加0.3% 0.5% CMC-Na)氧化鋁板 常用于生物堿類藥物聚酰胺板 常用于黃酮類及酚類藥物纖維素板 常用于氨基酸類藥物2）展開系統(tǒng)選擇1、突出斑點、有利于主斑點的分析比較，Rf一般在0.2-0.8 ；2、通用型的展開劑有 無水乙醇-苯（1:4）、苯-氯仿（1:3）、丙酮-甲醇（1:1）。3）系統(tǒng)適用性試驗：靈敏度、分離度和重復性要求3. 對照物的選擇原則：1）有對照品的須采用對照品； 2）無對照品的須

6、采用對照藥材； 3）既無對照品又無對照藥材的，采用自身對照的方法。方法:1) 對照品對照法 對照品和陰性對照溶液和供試品點于同一薄層板，展開，比對；2) 對照藥材對照法 某藥味制成對照溶液；3) 陽性對照法 將要鑒別的藥材按制劑工藝處理，再按鑒別方法提取的溶液；4) 陰性對照法 把制劑中要鑒別的藥材除去，用剩下的各味藥按制劑工藝處理，再按鑒別方法提取的溶液。 OO O O O O O O O O O 陰 樣 陽 對 品 對例大補陰丸 黃柏的TLC法鑒別 樣品對照藥材小檗堿O O OO O 例5）顯色和檢視方法（1）可見光、紫外光下直接檢視；（2）采用熒光板，檢視熒光淬滅度；（3）噴霧、浸漬、加

7、熱顯色后檢視。6）測定方法（1）鑒別： 對照品、供試品、陰性對照共同檢視，特征斑點比較；（2）限度檢查： 定量配制的對照品或?qū)φ掌废♂寣φ针s質(zhì)檢查 三主要雜質(zhì)檢查項目水分總灰分和酸不溶性灰分重金屬砷鹽殘留農(nóng)藥一般理化檢查項目有：浸出物、總固體、 乙醇含量、揮發(fā)油、總氮測定、相對密度、旋光度、折光率、水分、干燥失重等雜質(zhì)來源及檢查意義 水分 結(jié)塊、霉變或有效成分水解 灰分 控制藥物本身及泥土、沙石等無機雜質(zhì)砷鹽 劇毒，常由除草劑、殺蟲劑或化肥引入重金屬 環(huán)境污染和使用農(nóng)藥引入 殘留農(nóng)藥 有毒烘干法 （適用于不含或少含揮發(fā)性成分） 甲苯法 （含揮發(fā)性成分）減壓干燥法（含揮發(fā)性成分貴重藥） GC法（

8、一） 水分測定法烘干法供試品2-5g扁形稱量瓶100-105oC干燥5h干燥器30min100-105oC再干燥1h稱重W2稱重W11、要求W1和W2間相差不大于5mg；2、含有大量水或糖類，需在低溫下先烘去大部分水分，再干燥至恒重。根據(jù)減少的重量計算水分百分率甲苯法原理：水可與甲苯在69.3oC共沸蒸出，收集流出液，待分層后由刻度管測定出所含水量適于含揮發(fā)性成分樣品的水分測定；不適于微量水分的測定，中藥制劑含水量高，常使用。減壓干燥法減壓干燥器中，放入加有新鮮P2O5的培養(yǎng)皿，樣品至于已在相同條件下干燥至恒重的稱量瓶中，于2.67kPa以下干燥30min，最后精密稱定重量，計算水分百分率。氣

9、相色譜法無水乙醇浸提供試品，提出樣品中水分，以純化水作為標準對照，同法操作，在氣相色譜儀上進樣測定，外標法定量。特點：適用于各種情況的中藥水分測定；簡便、快速、靈敏度高。酸不溶性灰分的測定 總灰分的測定 （二） 總灰分和酸不溶性灰分的測定 更能表明外來雜質(zhì)含量 WHO規(guī)定植物藥 鉛 10ppm 鎘0.3ppm 干法破壞 濕法破壞 硫代乙酰胺法 （三） 重金屬的測定 干法破壞（ChP）濕法破壞（USP）(調(diào)到中性)鉛的選擇性測定 二硫腙比色法和原子吸收分光光度法二硫腙CH3ClpH 8.5-9.0紅色絡(luò)合物Pb2+提取測定A值鉛空心陰極燈=283.3nm 原子吸收分光光度法堿融法破壞濕法破壞堿融

10、法 H+（四） 砷鹽的測定 砷空心陰極燈=193.7nm 原子吸收分光光度法（五）殘留農(nóng)藥的測定1、總氯量的測定2、總磷量的測定3、GC法（有機氯-ECD；有機磷-火焰光度檢測器FPD） 中國藥典中藥制劑含量測定所占比例 版本 % 1977 1.48 1985 5.31 1990 8.73 1995 12.81 2000 62.09 （HPLC 36% TLCS 24% GC 3%)四、含量測定 測定項目的選定原則 1 單方制劑所含成分必須清楚，有針對性的選擇有效成分、指示性成分2 首選君藥及貴重藥、劇毒藥建立含量測定方法3 其次考慮臣藥及其他味藥4 有效成分明確的，可選有效成分6 確無法含量

11、測定的，可測定浸出物含量 7 檢測成分應(yīng)歸屬某單一藥味 8 檢測成分應(yīng)與中醫(yī)用藥的功能主治相近 9 測定成分需考慮與生產(chǎn)工藝的關(guān)系 5 有效成分類別清楚的，可測某一類總成分的含量 常用定量方法 化學分析法 分光光度法 薄層掃描色譜法(TLCS)氣相色譜法 高效液相色譜法 （一）高效液相色譜法（HPLC） RP - HPLC色譜柱 ODS流動相 甲醇 - 水色譜條件選擇： 固定相 ODS；流動相 甲醇水；乙腈水；黃酮類、酚酸類成分：選擇乙腈-水-酸系統(tǒng)；皂苷類成分：乙腈-水系統(tǒng)生物堿類成分：乙腈-水-三乙胺系統(tǒng)。洗脫方式 等度洗脫、梯度洗脫；等度洗脫：在同一周期內(nèi)流動相的組成保持恒定；梯度洗脫：

12、在一個分析周期內(nèi)程序控制流動相得組成。PIC 反離子 氫氧化四丁基銨RP - PIC 反離子 烷基磺酸鹽 無機陰離子A 酸性組分：酸性較弱，加入酸抑制電離；酸性強，離子對色譜法PICB 堿性較強組分：反相離子對色譜法RP-PIC外標法和內(nèi)標法 分析實例復方丹參片中丹參酮IIA的含量測定處方 丹參450g 三七141g 冰片8g 1000片有效成分有效脂溶性成分：丹參酮IIA；有效水溶性成分：丹酚酸B和丹參素色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗：ODS、甲醇-水（73:27）、檢測波長：270nm；對照品溶液的制備：甲醇配制；供試品溶液的制備：超聲處理，脂溶性成分和水溶性成分，利用不同濃度的乙醇和水提取。2

13、. 銀杏葉提取物中總黃酮醇苷的含量測定色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗：ODS、甲醇-0.4%磷酸溶液（50:50）、檢測波長：360nm；對照品溶液的制備：甲醇配制；供試品溶液的制備：甲醇-25%鹽酸（4:1）加熱回流提取。（二）氣相色譜法用于測定制劑中揮發(fā)油及其他揮發(fā)性組分的測定；中藥制劑中含水量和含醇量測定。實驗條件1）固定相多為高分子多孔微球，分離水或含羥基化合物2）柱溫保證難分離組分符合分離度要求下，盡可能采用較低柱溫；保留時間適宜，不拖尾，低于固定液溫度3）載氣熱導檢測器選用H2、He；ECD用N24）檢測器FID含碳有機物；NPD-氮、磷檢測器；ECD-鹵素、S、O、硝基、羰基和氰基5）

14、其他氣化室溫度取決于樣品沸點，高于柱溫3050度；檢測室高于柱溫30度左右；6）進樣量分流進樣測定方法的選擇：常用的有內(nèi)標法、外標法、歸一化法。內(nèi)標法：對進樣量、進樣速度等要求不高；適于微量物質(zhì)檢查；外標法：操作簡便、計算方便、不需校正因子；歸一化法：簡便，定量結(jié)果與進樣重復性無關(guān)。不適于微量雜質(zhì)的含量測定。 一定波長的光照射到薄層板上，測定薄層板上斑點對單色光的吸收或反射光強度，或吸收后激發(fā)的熒光強度，用于鑒別、檢查和含量測定的方法特點: A、具有分離效能，簡便快速 B、適用于無法用UV、HPLC 法測定的組分 C、準確度、精密度低于HPLC（三）薄層色譜掃描法1、 選擇測定條件（1）薄層色

15、譜條件分離好 對稱均勻 不拖尾（2）檢測方法吸收測定法熒光測定法反射法透射法（3）掃描方式 單波長雙波長線性掃描法鋸齒掃描法外標法內(nèi)標法 樣 樣 對 對 樣 樣 對 對 樣 樣 對 對 低 高 低 高 低 高 外標法（兩點校正法）內(nèi)標法（比較樣品與內(nèi)標品峰比值）（4）散射參數(shù)SX薄層板的散射使 Kubelka-Munk方程（1）薄層板 均勻、平整2、 注意事項（2）點樣量 準確（4）顯色劑 均勻、適當（3）斑點 應(yīng)完全分離，不拖尾（5）斑點不穩(wěn)定 用相同大小潔凈玻璃蓋住薄層板，并用透明膠紙封住邊緣，以起固定和隔絕空氣作用（6）掃描時應(yīng)沿展開方向掃描，不得橫向掃描（7）線性范圍窄，注意測定濃度在

16、線性范圍內(nèi)UV法 比色法特點 A、靈敏度高 B、簡便、快速 C、精密度稍低 D、干擾多 主要用于總黃酮、總生物堿、人參總皂苷（四）分光光度法示例一 山楂葉中總黃酮氯仿提取藥物細粉原理：在中性或弱堿性條件下，黃酮類化合物由亞硝酸鈉還原，與鋁鹽生成螯和物，加入氫氧化鈉溶液，開環(huán)生成2羥基查耳酮顯紅橙色，在500波長處有吸收峰，一般與蘆丁標準系列比較定量。一定要有鄰位無取代鄰二酚羥基的黃酮醇類蒸去溶劑甲醇提取蒸去溶劑乙醇溶解+ NaNO2 + Al(NO3)3 + NaOH顯色測定示例二 烏頭總生物堿的含量測定提取分離；加入溴甲酚綠，在醋酸鹽緩沖液中反應(yīng)；三氯甲烷提取后測定吸收度。（五）化學分析法重

17、量分析法 容量分析法特點 A、準確度、精密度高 B、抗干擾能力差用于制劑組方簡單的樣品例總生物堿含量分析實例萬氏牛黃清心丸方藥分析牛黃清熱解毒藥，主含膽酸類成分；黃連清熱燥濕藥，主要為小檗堿；黃芩清熱燥濕藥，主要為黃酮類；梔子清熱瀉火藥，主含梔子甙；朱砂安神藥，主含硫化汞（HgS）；郁金活血去瘀藥，主含揮發(fā)油。制法以上六味，除牛黃外，朱砂或粉碎成極細粉；其余黃連等四味粉碎成細粉；將牛黃研細，與上述粉末配研，過篩，混勻。每100g粉末加煉蜜100-200g制成大蜜丸，即得。性狀本品為紅棕色至棕褐色的大蜜丸；氣特異，味甜、微澀、苦。功能主治清熱解毒，鎮(zhèn)驚安神。用于熱邪內(nèi)閉，煩躁不安，神昏譫語，小兒

18、高熱驚厥。方藥分析 本方來源于明.痘疹世醫(yī)心法 ，本方為清心開竅劑，主治熱邪內(nèi)陷心包所致竅閉神昏癥。 方中牛黃，清心解毒，豁痰開竅為君藥；黃連、黃芩、梔子清熱瀉火，為臣藥；朱砂清心，重鎮(zhèn)安神，郁金行氣開竅共為佐使藥，合用以奏透邪瀉熱，開竅安神之效。鑒別顯微鑒別郁金糊化淀粉團塊幾乎無色。梔子種皮石細胞。黃芩纖維淡黃色，梭形，厚壁，孔溝細。黃連纖維鮮黃色，壁稍厚，紋孔明顯。朱砂不規(guī)則塊狀物或顆粒狀物，暗紅棕色、鮮紅色或棕黃色。郁金糊化淀粉團塊梔子種皮石細胞黃芩纖維黃連纖維朱砂不規(guī)則塊狀物或顆粒狀物，暗紅棕色、鮮紅色或棕黃色 化學鑒別1. 朱砂的鑒別 取本品3g，加水適量，研勻，反復洗去懸浮物，可得

19、少量朱紅色沉淀，取出，加入鹽酸1ml及銅片少量，加熱煮沸，銅片由黃色變?yōu)殂y白色。 HgS+2HCl+CuCuCl2+Hg+H2S NOTES：在酸性條件下，朱砂與銅片發(fā)生置換反應(yīng)析出金屬汞，在銅片表面形成銀白色汞齊。2. 人工牛黃的鑒別 取本品，剪碎，加硅藻土0.6g，研勻，加氯仿10ml、冰醋酸0.5ml，加熱回流30min,放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加乙醇2ml使溶解，濾過，濾液作為供試品溶液。 膽酸和豬去氧膽酸加乙醇制成1ml含1mg的混合溶液，作為對照品溶液。TLC法 CMC-Na，硅膠G展開劑 醋酸乙酯-正己烷-醋酸-甲醇 （32:6:1:1）顯色劑 10%磷鉬酸乙醇液， 1100C

20、,10min人工牛黃供試品牛黃空白豬去氧膽酸膽酸3. 黃芩的鑒別 供試品溶液的制備：取本品3g，剪碎，加硅藻土0.5g，研勻，加甲醇20ml，加熱回流1hr,放冷，濾過，濾液作為供試品溶液。 對照品溶液的制備：黃芩甙對照品加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作為對照品溶液。TLC法 CMC-Na，硅膠G （4%醋酸鈉）展開劑 醋酸乙酯-丁酮-甲酸-水 （5:3:1:1）顯色劑 2%三氯化鐵乙醇液使斑點更為集中-OH與Fe+3絡(luò)合黃芩甙供試品黃芩空白4. 梔子的鑒別 供試品溶液的制備：取本品3g，加乙醚15ml，研磨，棄去乙醚。殘渣揮干乙醚，加醋酸乙酯30ml，加熱回流1hr,放冷，濾過，濾液蒸干

21、，殘渣加甲醇3ml溶解，濾過，濾液作為供試品溶液。 對照品溶液的制備：梔子甙對照品加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作為對照品溶液。TLC法 CMC-Na，硅膠G展開劑 醋酸乙酯-丙酮-甲酸-水 （10 : 7 : 2 : 0.5）顯色劑 10%硫酸乙醇 1050C, 10min梔子甙供試品梔子空白5. 黃連的鑒別 供試品溶液的制備：取含量測定項下剩余的鹽酸-甲醇提取液4ml，水浴蒸干，殘渣加甲醇溶解，使成1ml作為供試品溶液。 對照藥材溶液的制備：黃連對照藥材50mg，加甲醇10ml，回流加熱15min ,濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1ml使溶解，作為對照藥材溶液。 對照品溶液的制備：再取鹽酸

22、小檗堿對照品，加甲醇制成每1ml含 0.5mg的溶液，作為對照品溶液。TLC法 硅膠G CMC-Na展開劑 苯-醋酸乙酯-甲醇-異丙醇-濃氨試液（12:6:3:3:1）顯色劑 UV（365nm）鹽酸小檗堿黃連供試品黃連空白對照品第三節(jié) 中藥指紋圖譜新技術(shù)中藥指紋圖譜（traditional chinese medicine fingerprint）定義： 中藥材、提取物或中藥制劑經(jīng)適當處理后，采用一定的分析手段，得到的能夠標示該中藥材、提取物或中藥制劑特性的共有峰的圖譜特點：1）通過中藥指紋圖譜的特異性，能有效的鑒別樣品的真?zhèn)位虍a(chǎn)地；2）通過主要特征峰的含量或比例，能有效的控制樣品的質(zhì)量，確保

23、質(zhì)量的相對穩(wěn)定。光譜、色譜、波譜、核磁、X-射線衍射2. 色譜指紋圖譜的基本屬性整體性 將指紋圖譜作為一個整體來分析和比較它的綜合特征以達到鑒別的目的模糊性 強調(diào)分析、比較指紋圖譜的相似性，而不是完全相同是一種綜合的、量化的色譜鑒別手段。色譜指紋圖譜在中藥質(zhì)量評價中能夠盡可能多地反應(yīng)中藥的全貌。不需要清楚每一個組分的化學結(jié)構(gòu)；不需要對每一個組分都進行定量；只要求不同批號的同一種藥品的指紋圖譜保持一致。目的和意義目的： 可用于定性和定量，控制中藥及其制劑質(zhì)量意義：1）有利于控制中間體、成品的一致性，減少批間差異；2）有利于保證成品在成分含量、組成比例上的一致，減少批間差異。原則系統(tǒng)性：反映中藥的

24、大多數(shù)組分的類別或指標成分的全部；特征性：具有選擇性，能區(qū)別優(yōu)劣和真?zhèn)危恢噩F(xiàn)性（可操作性）：不同的操作者，采用相同的方法和條件，結(jié)果應(yīng)該在誤差范圍內(nèi)。 二、中藥指紋圖譜的類型按測定手段分類中藥化學成分指紋圖譜中藥生物指紋圖譜按應(yīng)用對象分類中藥材指紋圖譜中藥原料藥指紋圖譜生產(chǎn)工藝過程中間產(chǎn)物指紋圖譜中藥制劑指紋圖譜中藥化學成分指紋圖譜 采用色譜、光譜、其它分析方法建立的表征中藥化學成分的圖譜 如：IR、GC、HPLC、 HPCE、MS、NMR、GC-MS、HPLC-MS、HPLC-MS-MS中藥生物指紋圖譜中藥材DNA指紋圖譜中藥基因組學指紋圖譜中藥蛋白組學指紋圖譜指作用于某特定細胞或動物后，引起基因和蛋白的復雜變化，反應(yīng)生物活性指紋圖譜研究技術(shù)關(guān)鍵（一）研究思路與內(nèi)容確定研究對象 成分研究內(nèi)容 對于中藥注射劑，固定藥用品種、部位、產(chǎn)地、采收季節(jié)、產(chǎn)地加工、炮制方法前提下，制訂中藥材、有效成分或中間體、制劑的指紋圖譜 研究方案樣品的選擇和收集供試品制備參照物制備研究方法選擇方法條件選擇 色譜條件選擇指紋特征的選擇與技術(shù)參數(shù)供試品的制備：應(yīng)根據(jù)生藥中所含化學成分的理化性質(zhì)和檢測方法的需要，選擇適宜的方法進行制備。 參照物的制備：應(yīng)說明參照物的選擇和試驗樣品制備的依據(jù)。 多采用HPLC法；揮發(fā)性成分選GC法；其它如HPCE和TLC 檢測方法：根據(jù)供試品的