大孔吸附樹脂在丁香葉中丁香苦苷類成分富集工藝中的應用

1、PAGE 8大孔吸附樹脂在丁香葉中丁香苦苷類成分富集工藝中的應用王建明*，劉欣，許貴軍，高月娟,薛紅梅(黑龍江中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥研究院，黑龍江 哈爾濱 150040）摘要 目的：研究大孔吸附樹脂富集丁香苦苷類成分的工藝條件及參數(shù)。方法：以丁香葉中主要有效成分丁香苦苷為考察指標，建立HPLC分析方法，通過考察6種大孔吸附樹脂對丁香苦苷的吸附分離性能，篩選出AB-8樹脂作為分離純化丁香苦苷類成分的介質(zhì)，并對AB-8樹脂的吸附性能進行研究，考察富集丁香苦苷類成分的最佳工藝條件。結(jié)果：丁香葉經(jīng)水提醇沉濃縮后，以AB-8型大孔樹脂為吸附劑，4BV的水洗脫出去雜質(zhì)后，收集5BV的50%乙醇洗脫液為最佳工藝條

2、件。結(jié)論：大孔吸附樹脂分離工藝可作為富集丁香苦苷類成分的有效方法，并為丁香葉藥材的質(zhì)量控制和新型給藥系統(tǒng)的研究奠定基礎。關鍵詞 丁香葉；大孔吸附樹脂；丁香苦苷；富集Enrichment of syringopicroside in Folium syringae with Macroporous ResinWANG Jian-Ming, LIU Xin, XU Gui-Jun, GAO Yue-Juan, XUE Hong-Mei(Academy of Traditional Chinese Medicine, Heilongjiang University of Chinese Medici

3、ne, Harbin 150040, China)Abstract Objective: To study the optimal conditions and parameters for the enrichment process of syringopicroside in Folium syringae with macroporous resin. Methods: With the enrichment degree of syringae as an index, the analytical method of HPLC was developed , AB-8 resin

4、was selected as the medium for purification of syringae on the basis of comparing six kinds of macroporous resins adsorption and separation performance,and the optimal conditions of the enrichment process were investigated. Results: The optimal conditions were that the extract of Folium syringae was

5、 taken into AB-8 resin column, the resin was washed by 4 times of distilled water to get rid of impurity and 5 times of 50% ethanol to elute syringae. Conclusion:The process is a effective method to enrich syringae,and provides a way to research new medicine delivery system.Key word: Folium syringae

6、；macroporous resin；syringopicroside；enrichment丁香葉為木樨科植物紫丁香（syringa oblata lindl.）、洋丁香（syringa vulgaris L.）和朝鮮丁香（syringa diatata Nakai）的干燥葉，具有廣譜抗菌和抗病毒作用，收載于黑龍江省藥品標準，在東北地區(qū)分布廣泛，資源豐富。丁香葉制劑炎立消膠囊、片劑收載于中華人民共和國部頒藥品標準，用于治療急性腸炎、菌痢、上呼吸道感染及急慢性扁桃體炎等感染性疾病，療效顯著。丁香葉的藥效物質(zhì)基礎主要為丁香苦苷、3，4二羥基苯甲酸、3，4二羥基苯乙醇、酪醇、反式對羥基肉桂酸等，其中

7、以丁香苦苷含量較高，為主要活性成分。生理活性試驗表明，五種化合物的苷元對金色葡萄球菌、痢疾桿菌、大腸桿菌及綠膿桿菌均有不同程度的抑制作用1。由于大孔吸附樹脂對中藥提取物中苷類、黃酮、生物堿的分離純化效果較好，并且具有吸附性強、解吸容易、可反復使用等優(yōu)點2，因此本文采用大孔吸附富樹脂柱層析結(jié)合HPLC在線檢測，對丁香苦苷類成分的富集工藝進行研究，實現(xiàn)丁香葉制劑高效、低劑量的科學化改造，為新型給藥系統(tǒng)的研究奠定基礎。實驗材料11儀器Waters 600E-2487型高效液相色譜儀；Millennium32色譜工作站數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；SHB-循環(huán)水真空泵（

8、上海亞榮生化儀器廠）；THZ-82型水浴恒溫振蕩器（江蘇金壇市望華科教儀器廠）；AG135型電子天平（瑞士METTLER-TOLEDO公司）。12藥材及試劑丁香葉（syringa oblata lindl.）采自黑龍江中醫(yī)藥大學藥圃，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學生藥學教研室鑒定為木樨科植物紫丁香。丁香苦苷對照品（自制，UV、IR、MS、HNMR等波譜分析確定為丁香苦苷，經(jīng)高效液相色譜歸一化法計算，純度為98.8%）AB-8型、D101型、X-5型、NKA-型大孔吸附樹脂（南開大學化工廠）；HPD400型、HPD500型大孔吸附樹脂（河北滄州寶恩化工有限公司）。試驗所用大孔吸附樹脂理化性質(zhì)見表1Tab.1

9、樹脂的物理結(jié)構(gòu)參數(shù) Characteristics of resins樹脂型號 極性 比表面積（m2/g） 孔徑（nm） 孔容（mL/g）Type of resin polarity Specific area Pore diameter Pore volumeX-5 非極性 500600 2930 1.201.24 D101 非極性 500550 100110 AB-8 弱極性 480520 1314 0.730.77 HPD400 中極性 550 80 HPD500 極性 500600 4050 NKA- 極性 160200 14.515.5 0.620.66實驗中所用水為超純水，甲醇為色

10、譜醇，其余試劑均為分析純。2方法與結(jié)果2.1丁香苦苷的定量方法2.1.1色譜條件及系統(tǒng)適應性 色譜柱： Diamonsil(TM) C18柱（4.6mm X 200mm，5m）；流動相：甲醇-水（40：60）；流速：1.0mL.min-1；檢測波長：221nm；柱溫：25。在上述色譜條件下，進樣量10L,丁香苦苷對照品的保留時間為22.358min，理論塔板數(shù)以丁香苦苷計算應不低于2500，色譜圖見圖1，圖 2和圖3。圖1 丁香苦苷對照品圖2 丁香葉供試液圖3 AB-8型大孔吸附樹脂洗脫液2.1.2對照品溶液的制備 精密稱取丁香苦苷對照品0.695mg ，置10mL量瓶，加甲醇溶解并稀釋至刻度

11、，搖勻，備用。2.1.3檢測波長的選擇 精密吸取對照品溶液1mL于10mL量瓶中，用流動相溶液定溶，并以流動相溶液作為參比溶液，在190600nm波長范圍內(nèi)進行全波長掃描，結(jié)果顯示丁香苦苷在221nm處有一最大吸收峰，故選定221nm為檢測波長。2.1.4線性關系考察 精密丁香苦苷對照品溶液2.5，5，10，15，20l進樣，測定峰面積，以進樣量（g) 為橫坐標，以峰面積積分值為縱坐標，作圖，得一直線，其回歸方程為: Y = 2.79106X-8.23104 r= 0.999983 丁香苦苷進樣量在0.173751.39g呈良好的線性關系。2.1.5方法學考察2.1.5.1精密度試驗精密吸取丁

12、香苦苷對照品溶液10l，注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測定5次，丁香苦苷峰面積積分值的RSD=1.63%，結(jié)果表明該定量分析方法具有較好的精密度。2.1.5.2重復性試驗精密吸取同一批大孔吸附樹脂洗脫液5份，每份1mL，在上述色譜條件下進樣10l，測定峰面積積分值，計算丁香苦苷含量。RSD= 2.02%，重現(xiàn)性良好。2.1.5.3穩(wěn)定性試驗取同一批大孔吸附樹脂洗脫液，分別于0，2，4，8，12，24h各精密吸取10l，在上述色譜條件下測定。結(jié)果表明，24h內(nèi)峰面積無明顯變化，RSD=1.42%，大孔吸附樹脂洗脫液穩(wěn)定性良好。2.1.5.4加樣回收率試驗 分別精密吸取丁香苦苷含量為47.63

13、%的70%乙醇洗脫液5份，每份10mL，水浴蒸干，加入對照品，用甲醇溶解，超聲提取10min后，定容于50mL量瓶中按上述色譜條件測定丁香苦苷含量。RSD=2.66 %。2.2丁香葉供試品溶液的制備丁香葉適當粉碎，分別加16倍量的水煎煮2h，加12倍量的水煎煮1h，過濾，合并濾液，濃縮至含2g生藥/mL，加乙醇至含醇量為70%，醇沉24h，濾液減壓回收至無醇味，加蒸餾水調(diào)節(jié)至含0.5g生藥/mL，作為供試品溶液。精密吸取供試液5mL,加蒸餾水定容于50mL量瓶中，用0.45m微孔濾膜過濾，進樣10l，按上述色譜條件測定供試液中丁香苦苷含量為16.4mg/mL。2.3大孔吸附樹脂預處理與再生 新

14、樹脂用95% 乙醇浸泡24h，充分溶脹，用95% 乙醇洗脫，不時檢測流出的乙醇液，至流出的乙醇液與蒸餾水（1：3）混合時不呈白色渾濁，并且流出乙醇液在200 400nm處，以95% 乙醇為空白對照，不產(chǎn)生紫外吸收峰。再用蒸餾水洗至無醇，備用。 再生時樹脂先用樹脂柱床體積4BV的95% 乙醇，以2BV/h的流速洗脫，并用蒸餾水以同樣流速洗去乙醇；用4BV的5%HCl溶液浸泡24h，并以2BV/h的流速通過樹脂床，而后用蒸餾水以同樣流速洗至pH中性；再用4BV的2%NaOH溶液浸泡24h，并以2BV/h的流速通過樹脂床，而后用蒸餾水以同樣流速洗至pH中性。2.4靜態(tài)吸附-解吸實驗篩選樹脂型號 選取

15、經(jīng)預處理的AB-8型、D101型、X-5型、NKA-型、HPD400型、HPD500型6種大孔吸附樹脂，抽濾至不滴水為度，準確稱取5g，置具塞錐形瓶中，加入30mL丁香葉供試品溶液，恒溫振蕩器100rpm，室溫條件下振蕩24h，過濾，用適量蒸餾水清洗樹脂表面殘留液，合并濾液，乙酸乙酯萃取4次（50mL，50mL，40mL，40mL），水浴蒸干，殘渣用甲醇溶解并定溶于50mL量瓶中，HPLC測定吸附前后供試液中丁香苦苷含量，計算吸附率。將吸附平衡后的樹脂加入30mL95% 乙醇，恒溫振蕩器100rpm，室溫條件下振蕩24h，過濾，蒸干，甲醇溶解并定溶于50mL量瓶中，測定丁香苦苷含量，計算解吸率

16、。吸附率(%) =( C0V0- C1V1)/ C0V0 100%解吸率（%) = C2V2/（C0V0- C1V1）100 %式中C0為供試液濃度，V0為供試液體積；C1為流出液濃度，V1為流出液體積；C2為解吸液中濃度，V2為解吸液體積。結(jié)果見表2Tab.2 Absorption and desorption of different type of MARType of resin AB-8 D101 X-5 NKA- HPD400 HPD500Ratio of absorption(%) 95.54% 91.12% 90.35% 39.86% 97.70% 95.05%Ratio of

17、 desorption(%) 92.47% 97.14% 85.59% 47.84% 82.65% 83.28%由上表可知，AB-8型大孔吸附樹脂的吸附率和解吸率相對較高，結(jié)合樹脂成本綜合考慮，選擇AB-8型大孔吸附樹脂進行富集工藝研究。2.5樹脂吸附性能研究2.5.1吸附等溫線的測定 準確稱取經(jīng)預處理并抽濾至干的AB-8型大孔吸附樹脂5g置于具塞錐形瓶中，加入40mL一系列不同濃度的丁香葉供試品溶液，100rpm，分別于25，40，50條件下恒溫振蕩24h，測定吸附前后供試液中丁香苦苷含量，根據(jù)下式計算吸附量： q = (c0 c)V/W 式中q為吸附量，c0 , c分別為吸附前和吸附平衡后

18、溶液中丁香苦苷的濃度（mg/mL)；V為吸附液的體積(mL) ，W為樹脂的重量（g)。圖3是以c為橫坐標，q為縱坐標繪制的吸附等溫線。結(jié)果見圖3。 Fig. 3 Absorption isotherm curve of syringopicroside 隨著供試液中丁香苦苷濃度的增加，樹脂的吸附量逐漸增大，最后趨于飽和吸附值，吸附曲線符合Langmiur吸附等溫方程，表明浸提物中丁香苦苷在AB-8型樹脂上基本呈單分子吸附，有利于在柱層析過程中擴大吸附量。隨著溫度的升高，同一濃度下樹脂的吸附量降低，表明丁香苦苷在AB-8型樹脂上的吸附過程是放熱過程，低溫有利于吸附。2.5.2鹽離子濃度對吸附的影

19、響 由于鹽離子的存在，使溶液中的自由水減少，產(chǎn)生鹽析作用，丁香苦苷的溶解度降低。溶解度越小，溶質(zhì)與溶劑之間的相互作用力相對減弱，則被吸附的傾向越大，也就越容易吸附。因此，本文以NaCl為介質(zhì)，考察鹽離子濃度對丁香苦苷吸附量的影響。 準確稱取經(jīng)預處理并抽濾至干的AB-8型大孔吸附樹脂5g,置于具塞錐形瓶中，加入50mL含丁香苦苷1.64mg/mL的供試液，加入NaCl調(diào)節(jié)供試液NaCl分別為0.5,1.0,1.5,2.0,2.5 moL/L,恒溫振蕩24h,平衡后測定樹脂吸附量，以鹽離子濃度為橫坐標，吸附量為縱坐標，作圖4。Fig.4 Effect of ion strength on the

20、absorption of extract可見適量鹽離子的存在，使大孔吸附樹脂對丁香苦苷的吸附量有所增加，主要是由于鹽析作用使供試液中物質(zhì)的溶解度下降，吸附平衡向吸附方向偏移。下一步需要對鹽離子的種類進行考察。2.5.3動態(tài)吸附曲線（泄漏曲線）的測定準確稱取預處理并抽濾至干AB-8型樹脂15g，濕法裝柱（30cm1.3cm）,將含丁香苦苷4.1mg/mL的供試液300mL,以2BV/h的流速通過樹脂柱，每5mL收集一次，并測定流出液中丁香苦苷含量，以流出液體積（mL）為橫坐標, 流出液中丁香苦苷濃度（mg/mL）為縱坐標,繪制動態(tài)吸附曲線。將動態(tài)飽和吸附的樹脂用95% 乙醇完全洗脫，定溶，HP

21、LC分析計算樹脂的動態(tài)飽和吸附容量。結(jié)果見圖5Fig. 5 Leakage curve of extract solution on AB-8 resin從圖5中可以看出，對應于流出液中丁香苦苷濃度是上樣液濃度的5%時，15g AB-8型樹脂可處理5倍柱體積的上樣液，共吸附471.5mg丁香苦苷，動態(tài)飽和吸附量為31.43mg/g（相當于3.84g生藥/g樹脂）。2.6洗脫劑濃度的考察準確稱取預處理并抽濾至干AB-8型大孔樹脂4份，每份15g,濕法裝柱（30cm1.3cm），將含丁香苦苷4.1mg/mL的供試液以2BV/h的流速上樣20mL,飽和吸附30min，先用4BV蒸餾水洗至洗脫液還原糖

22、反應（Molish反應）為陰性，分別用5BV的30%乙醇，5BV的50%乙醇，5BV的70%乙醇，5BV的90%乙醇洗脫，流速1mL/min，分別收集洗脫液，定容于250mL量瓶中, 搖勻。用0.45m微孔濾膜過濾，棄去初濾液，取續(xù)濾液，按上述色譜條件測定丁香苦苷含量，計算不同濃度乙醇的解吸率。結(jié)果見表3。Tab. 3 Effect of eluate on the desorption with different concentration of ethanolDifferent concentration of ethanol 30% 50% 70% 90%Content of syri

23、ngopicroside (mg/mL) 0.22mg/mL 0.76 mg/mL 0.81 mg/mL 0.65 mg/mLRatio of desorption(%) 26.83% 92.68% 98.78% 80.24%以上結(jié)果表明，70%乙醇（V/V）解吸效果較好，達到了95%以上，解吸液中丁香苦苷含量較高，所以選擇70%乙醇作為洗脫劑。2.7洗脫劑用量的考察稱取AB-8型大孔吸附樹脂15g, 根據(jù)動態(tài)吸附曲線確定的上樣量，吸附丁香葉提取液，然后用蒸餾水洗去雜質(zhì)，再用70%乙醇以2BV/h的流速洗脫，25mL收集一次流出液。以洗脫液的體積（mL）與洗脫液的濃度（mg/mL）作圖，結(jié)果見

24、Fig. 6 Fig.6 Desorption curve of extract solution on AB-8 resin 由上圖可知，洗脫劑用量對解吸過程影響較大，70%乙醇125mL(相當于5BV)能夠?qū)⒈晃降亩∠憧嘬疹惓煞窒疵撏耆?.8工藝驗證 稱取AB-8型大孔樹脂3份，每份15g,根據(jù)動態(tài)吸附曲線確定的上樣量上樣，先用4BV蒸餾水洗去雜質(zhì)，再用5BV的70%乙醇洗脫，收集洗脫液，定容于100mL量瓶中, 測定丁香苦苷含量。原藥液、醇洗脫液分別干燥，稱重。結(jié)果：原藥液固形物分別為8.52g ,丁香苦苷含量為 19.92 % ；醇洗脫液固形物為 2.74g，丁香苦苷含量為 47.56% 。洗脫率為 91.57%，精制程度為 238%。3討論 大孔樹脂的極性和空間結(jié)構(gòu)是影響吸附性能的重要因素，本實驗從生產(chǎn)成本考慮，選取非極性（D101、X-5）、弱極性(AB-8)、中極性(HPD400)和極性(NKA-、HPD500)四類典型的大孔吸附樹脂進行靜態(tài)吸附-解吸篩選，結(jié)果弱極性AB-8型和極性HPD400、HPD500型樹脂對丁香苦苷的吸附量較大，這是由于丁香苦苷分子由非極性的環(huán)烯醚萜母核和葡萄糖苷鏈組成，這種分子結(jié)構(gòu)使其總體具有一定的極性和親