放射免疫-熒光標(biāo)記免疫課件

1、 現(xiàn)代免疫分析技術(shù)-放射免疫與熒光免疫免疫分析技術(shù)的發(fā)展多元免疫技術(shù)免疫沉淀免疫凝集補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)中和反應(yīng)免疫標(biāo)記技術(shù)經(jīng)典免疫學(xué)方法化學(xué)發(fā)光膠體金酶免疫免疫熒光放射免疫PCR-免疫分析時(shí)間分辨熒光分析免疫標(biāo)記技術(shù)=抗原抗體反應(yīng)示蹤物標(biāo)記靈敏度特異性免疫標(biāo)記技術(shù)的主要特點(diǎn)：高特異性、高靈敏度免疫技術(shù)+標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)方法 檢測(cè)范圍生化、常規(guī)免疫 mgg（10-3 10-6 g）熒光免疫、酶免疫 gng（10-6 10-9 g）放射免疫、發(fā)光免疫 ngpg（10-9 10-12 g）PCR pgfg（10-12 10-15 g）標(biāo)記技術(shù)：將可被探測(cè)的示蹤物質(zhì)用化學(xué)方法與化合物連接。免疫技術(shù)：以抗原-抗體

2、反應(yīng)原理為基礎(chǔ)，對(duì)樣品中相應(yīng)抗原或抗體進(jìn)行檢測(cè)。標(biāo)記免疫分析：是利用多種標(biāo)記技術(shù)與免疫技術(shù)相結(jié)合而建立的測(cè)定技術(shù)體系。其核心即是高靈敏性和高度特異性的有機(jī)結(jié)合。標(biāo)記免疫技術(shù)基本概念放射免疫技術(shù)1959年，美國(guó)，Yalow和Berson測(cè)定血清胰島素含量（標(biāo)記抗原）1977年獲諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng) 放射免疫分析技術(shù)（Radioimmunoassay，RIA） 優(yōu)點(diǎn)：特異性強(qiáng)，靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確，檢樣用量少，結(jié)果重復(fù)性好，操作易自動(dòng)化；缺點(diǎn)：對(duì)抗體質(zhì)量要求高，有放射性危害，檢測(cè)儀器價(jià)格較高 Ag Ab *Ag Ag-Ab+標(biāo)記抗原（F） 特異性抗體 被檢抗原 非標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物（B）

3、*Ag-Ablimited, competitive 1.1 放射免疫分析（RIA）技術(shù)原理抗原標(biāo)準(zhǔn)品與待測(cè)抗原 結(jié)構(gòu)-完全相同/結(jié)構(gòu)相似且親和力相近 純度-純度90%以上（免疫純） 較高的放射比放射性同位素特異性抗體 特異性高、親和力高（Ka）、效價(jià)高 ?！叭摺保?1.2 放射免疫技術(shù)基本條件標(biāo)記核素125I 3H 射線(xiàn) 理化性活潑 差核素豐度 90% 半衰期 60.2d 12.3y標(biāo)記方法 簡(jiǎn)單復(fù)雜標(biāo)記設(shè)備 低廉( 計(jì)數(shù)儀)昂貴( 液閃儀)測(cè)量條件 簡(jiǎn)單 復(fù)雜125I -標(biāo)記物的鑒定比放射性：?jiǎn)挝换瘜W(xué)量標(biāo)記物中所含的放射性強(qiáng)度;免疫活性：與過(guò)量抗體反應(yīng)的百分比越大，標(biāo)記物免疫活性越好 游

4、離抗原與免疫復(fù)合物的分離第二抗體沉淀法 PEG 沉淀法 PR 試劑法 活性炭吸附法 分離徹底，迅速分離試劑和過(guò)程不影響反應(yīng)平衡效果不受反應(yīng)介質(zhì)影響 操作應(yīng)簡(jiǎn)單、重復(fù)性好經(jīng)濟(jì) Ag* Ab Ag 標(biāo)記抗原 特異性抗體 待測(cè)抗原( Ag*-Ab)+ (Ag-Ab) 抗原抗體復(fù)合物分離Ag*-Ab 和游離Ag*從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上讀知含量 測(cè)定Ag*-Ab和游離Ag*放射性 放射免疫測(cè)定法(RIA)示意圖 1.3 放射免疫技術(shù)基本類(lèi)型液相法 平衡法（一步法） 順序加樣法 固相法免疫放射分析技術(shù)（immunoradiometric assay，IRMA）1968年，Miles 和Hales應(yīng)用同位素標(biāo)記胰島素

5、抗體，成功檢測(cè)牛血清中的胰島素。Type IRMARIA被標(biāo)記物質(zhì)抗體抗原抗體用量過(guò)量限量被檢抗原相對(duì)分子量相對(duì)較大相對(duì)較小反應(yīng)方式分步結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合B、F分離方法固相洗滌分離液相沉淀/吸附分離2.1 免疫放射技術(shù)基本條件標(biāo)記抗體的制備 抗體親和力要求不高固相抗原免疫吸附劑 對(duì)抗原吸附力強(qiáng)，對(duì)非特異性蛋白吸附少，結(jié)合過(guò)程中高度分散 （重氮化纖維素，瓊脂糖4B珠）2.2 免疫放射技術(shù)基本類(lèi)型 經(jīng)典IRMA） 雙抗夾心法2.2 免疫放射技術(shù)基本類(lèi)型熒光免疫技術(shù)Immunofluorescence technique， IFAIntroduction:1958年，Riggs等合成了異硫氰酸熒光黃（fl

6、uorescent isothiocyanate，F(xiàn)ITC）；Marshall對(duì)熒光標(biāo)記方法進(jìn)行了改進(jìn)，熒光技術(shù)逐漸推廣1942年，Coons等，異硫氰酸熒光素標(biāo)記抗體，檢測(cè)小鼠組織切片中可溶性肺炎鏈球菌多糖抗原IFA熒光素敏感可測(cè)抗原抗體反應(yīng)特異性顯微技術(shù)高度精確優(yōu)點(diǎn)：特異性強(qiáng)，敏感性高，速度快，結(jié)果直觀-病原微生物缺點(diǎn)：熒光標(biāo)本保存難（淬滅）非特異性染色 熒光免疫分析（IFA）技術(shù)原理YYY 一種有機(jī)或無(wú)機(jī)化學(xué)物質(zhì)，其接受激發(fā)光后，能夠以發(fā)射光形式產(chǎn)生明亮的熒光而作為染料使用。 各種熒光素都有各自的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)。因發(fā) 射波長(zhǎng)不同而顏色不同。 異硫氰酸熒光黃（FITC），四乙基羅丹明（

7、Rb200），藻紅蛋白（PE）。 熒光免疫分析（IFA）基本條件 1. 熒光素較高較穩(wěn)定的熒光效率具有能與蛋白質(zhì)分子形成穩(wěn)定共價(jià)鍵的化學(xué)基團(tuán)與蛋白質(zhì)結(jié)合簡(jiǎn)單快速結(jié)合產(chǎn)物的熒光顏色與實(shí)驗(yàn)對(duì)象的自發(fā)熒光對(duì)比鮮明結(jié)合物具有一定的耐貯藏性 標(biāo)記用熒光素應(yīng)具備的條件抗體：特異性強(qiáng)、效價(jià)高、標(biāo)記后活性高標(biāo)記前：梅花狀雙擴(kuò)測(cè)效價(jià)標(biāo)記抗體種類(lèi)：多克隆抗體、單克隆抗體、葡萄球菌A蛋白（熒光二抗通用試劑） 2. 待標(biāo)記抗體1mg/mL FITC（ 異硫氰酸熒光黃）標(biāo)記抗體Marsshall法原理 當(dāng)FITC在堿性溶液中與抗體反應(yīng)時(shí)，主要是抗體分子上的賴(lài)氨酸-氨基與FITC上硫碳胺鍵結(jié)合，一個(gè)IgG分子中有86個(gè)賴(lài)

8、氨酸殘基，一般最多能結(jié)合1520個(gè)。 3. 熒光標(biāo)記抗體制備與純化熒光素- FITC- NC N - 蛋白質(zhì) FITC- N C N - 蛋白質(zhì) S H H H S H 操作流程抗體的準(zhǔn)備：20mg/ml(抗體+生理鹽水+碳酸鹽緩沖液） 碳酸鹽緩沖液為總量的1/10。熒光素的準(zhǔn)備：根據(jù)欲標(biāo)記的蛋白總量，每毫克加入0.01mgFITC （抗體與熒光素比例為50-100:1）標(biāo)記：邊攪拌邊將稱(chēng)取的熒光素加入抗體溶液中（5-10min)。避免粘于瓶壁或攪拌棒上，繼續(xù)攪拌12-18h，4透析：離心去沉淀，裝入透析袋pH8.0緩沖鹽水透析過(guò)夜，0-4過(guò)柱：葡萄糖凝膠G50或 G25柱分離游離熒光素保存

9、：4 -40等量甘油分裝保存。 3. 熒光標(biāo)記抗體制備與純化 4. 熒光標(biāo)記抗體鑒定1 特異性染色效價(jià)測(cè)定-與相應(yīng)抗原標(biāo)本染色2 非特異性染色測(cè)定-與相類(lèi)似抗原標(biāo)本染色3 吸收試驗(yàn)-在熒光抗體中加入過(guò)量抗原，吸收后再用相應(yīng)抗原陽(yáng)性 標(biāo)本染色，結(jié)果無(wú)明顯陽(yáng)性熒光。4 F/P比值的測(cè)定方法F（熒光素）和P（抗體蛋白）的克分子比值反映熒光抗體的特異性染色質(zhì)量， F/P=1-2， 過(guò)高-非特異染色增強(qiáng)； 過(guò)低-熒光很弱，降低敏感性。 經(jīng)典熒光抗體染色法流式細(xì)胞儀（Flow Cytometor, FCM），以熒光免疫技術(shù)為基礎(chǔ)發(fā)展起來(lái)的專(zhuān)門(mén)的細(xì)胞分析技術(shù)。是一項(xiàng)集液流噴射技術(shù)、激光技術(shù)、電子物理技術(shù)、光

10、電測(cè)量技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)以及細(xì)胞熒光化學(xué)技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)為一體的檢測(cè)儀器。 現(xiàn)代免疫熒光技術(shù) 1. 流式細(xì)胞技術(shù)1. 流動(dòng)室及液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)2. 激光光源及光束形成系統(tǒng)3. 光學(xué)系統(tǒng)4. 信號(hào)檢測(cè)與存貯、顯示、分析系統(tǒng)5. 細(xì)胞分選系統(tǒng) 流式細(xì)胞儀工作原理熒光染色的細(xì)胞（微粒）懸液標(biāo)本High Pressure流動(dòng)室及液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)若干組透鏡、濾光片、小孔 -將不同波長(zhǎng)的熒光信號(hào)送入到不同的電子探測(cè)器 單細(xì)胞分析：任何單細(xì)胞懸液，如血液、骨髓、體液中的細(xì)胞、培養(yǎng)細(xì)胞，實(shí)體組織經(jīng)處理后制成單細(xì)胞懸液?？焖俜治觯簶O短時(shí)間內(nèi)可分析大量細(xì)胞，只要標(biāo)本中的細(xì)胞數(shù)量足夠，流式細(xì)胞儀可以每秒鐘數(shù)十、數(shù)百、數(shù)千

11、個(gè)細(xì)胞的速率進(jìn)行測(cè)量，測(cè)量的細(xì)胞總數(shù)可達(dá)數(shù)千、數(shù)萬(wàn)乃至數(shù)百萬(wàn)個(gè)。 流式細(xì)胞技術(shù)應(yīng)用多參數(shù)分析：可同時(shí)分析單個(gè)細(xì)胞的多種特征,當(dāng)同時(shí)用多種分子探針,如用不同熒光素標(biāo)記的不同單克隆抗體進(jìn)行多色熒光染色,通過(guò)流式細(xì)胞分析,即可獲得單細(xì)胞的多種信息,使細(xì)胞亞群的識(shí)別、計(jì)數(shù)等更為準(zhǔn)確。定性或定量分析：通過(guò)熒光染色對(duì)單細(xì)胞的某些成分如DNA含量、抗原或受體表達(dá)量、Ca2+濃度等均可進(jìn)行單細(xì)胞水平的定性與定量分析。 流式細(xì)胞技術(shù)應(yīng)用1979年，芬蘭Wallac公司研發(fā)部的Soini和Hemmila首次建立稀土離子標(biāo)記物的“時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)分析”理論；1984年，Hemmila確定了DELFIA免疫熒光技

12、術(shù)方案，從而使DELFIA成為Wallac的專(zhuān)利技術(shù)。1989年該技術(shù)獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)提名。90年代以來(lái)，時(shí)間分辨熒光技術(shù)因其靈敏度高，操作簡(jiǎn)便，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)范圍寬，不受樣品自然熒光干擾，無(wú)放射性污染等特點(diǎn)，其方法學(xué)研究和臨床應(yīng)用的發(fā)展十分迅速。目前，時(shí)間分辨免疫熒光技術(shù)正成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究中最有發(fā)展的研究手段之一。 2. 時(shí)間分辨免疫熒光技術(shù) Time-resolveduoroimmunoassa（TrFIA）示蹤劑：三價(jià)稀土離子包括有銪（Eu），釤（Sm），鏑（Dy）等。雙功能基團(tuán)螯合劑：示蹤劑通過(guò)具有雙功能基團(tuán)螯合劑與抗體（或抗原）以共軛雙鍵結(jié)合成標(biāo)記物。稀土離子螯合物熒光光譜特點(diǎn)：1）特異性強(qiáng)

13、；2）Stokes位移大；3）熒光壽命長(zhǎng)解離-增強(qiáng)技術(shù)：螯合劑在中性條件下與鑭系離子形成穩(wěn)定的螯合物，而在增強(qiáng)液（酸性）作用下，鑭系離子迅速被徹底釋放并與增強(qiáng)液中的配體螯合，使其熒光得以成千萬(wàn)倍地放大。TrFIA的原理通過(guò)延續(xù)時(shí)間，使特異性熒光與非特異性熒光分辨開(kāi)來(lái)，使理論本底達(dá)到0。發(fā)射光譜與激發(fā)光譜之間存在很大的Stokes 位移。通過(guò)干涉濾光片可將發(fā)射光譜與激發(fā)光譜完全分離。技術(shù)特點(diǎn)檢驗(yàn)先進(jìn)性時(shí)間分辨光譜分辨特異性熒光與非特異性熒光分離發(fā)射熒光與激發(fā)熒光分離零背景、特異性高靈敏度高解離-增強(qiáng)熒光性大大提高穩(wěn)定的熒光螯合物線(xiàn)性范圍寬高靈敏度原子標(biāo)記標(biāo)記位點(diǎn)多，可達(dá)20個(gè)，對(duì)標(biāo)記物結(jié)構(gòu)及活性影響