基因表達(dá)分析技術(shù)課件

1、 醫(yī)學(xué)分子遺傳學(xué) 第四章分子遺傳技術(shù)方法 基因表達(dá)分析技術(shù)METHODS FOR ANALYZING GENE EXPRESSIONSpeaker：2022/9/301genemRNAProtein polypeptide chainGene Expression2022/9/302一、實時熒光定量PCR （real time quantitative PCR，RT-qPCR）2022/9/303實時熒光定量PCR (real time quantitative PCR，RT-qPCR)是熒光化學(xué)物質(zhì)與PCR產(chǎn)物相結(jié)合，在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號累積實現(xiàn)了實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)

2、程，對起始模板進(jìn)行定量分析的方法。熒光定量實時PCR與普通PCR的比較在線實時監(jiān)控 對樣品擴(kuò)增的整個過程進(jìn)行實時監(jiān)控，能夠?qū)崟r地觀察到產(chǎn)物的增加，直觀地看到反應(yīng)的對數(shù)期 降低反應(yīng)的非特異性 使用引物和熒光探針同時與模板特異性結(jié)合，提高了PCR反應(yīng)的特異性 增加定量的精確性 全程監(jiān)控，精確定量 結(jié)果分析更快捷方便，無需電泳 非特異性熒光染料標(biāo)記：SYBR Green I 特異性熒光標(biāo)記：TaqMan優(yōu)點與特異性的熒光探針相比價格便宜 只需要設(shè)計PCR引物熒光信號強(qiáng)與其它探針相比設(shè)計簡單可用于多通道檢測 可用于SNP的檢測缺點由于它和模板的結(jié)合是非特異性的，它可以和所有的雙鏈DNA包括引物和非特異

3、性擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合，不能真實反映目 的基因的擴(kuò)增情況比DNA結(jié)合染料價格高2022/9/307Ct（ threshold value ）值是指熒光信號達(dá)到設(shè)定閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，此時熒光信號明顯高于背景熒光信號。2022/9/308相對定量（Relative quantification）是計算要處理樣本相對于正常（內(nèi)參基因）樣本的基因表達(dá)量變化，屬于倍數(shù)關(guān)系式，擴(kuò)增效率達(dá)到100%時用2 -CT 法來分析處理實驗數(shù)據(jù)。實驗過程中還要引入一個或多個內(nèi)參基因進(jìn)行校正和標(biāo)準(zhǔn)化。內(nèi)參基因（Reference gene）是指在不同類型細(xì)胞、不同實驗處理條件下恒定表達(dá)的一類管家基因，常用的內(nèi)參基因有b-a

4、ctin、GAPDH、18sRNA、efla等。2022/9/3010相對定量分析方法1 2 -Ct前提：目標(biāo)序列和內(nèi)參序列的擴(kuò)增效率接近100且偏差在5以內(nèi)。1計算Ct：Ct=Ct 靶基因Ct GAPDH，分別計算實驗組和對照組的Ct。2計算Ct：Ct=Ct實驗組Ct對照組。3計算相對表達(dá)量的差值。2 Ct 靶基因AGAPDHCt對照組實驗組相對定量分析方法2：雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法前提：目標(biāo)基因與內(nèi)參基因擴(kuò)增效率不同 待測樣品目的基因濃度 待測樣品內(nèi)參基因濃度 F= 對照樣品目的基因濃度 對照樣品內(nèi)參基因濃度2、反轉(zhuǎn)錄2022/9/3014（1）、NCBI 官網(wǎng) gene bank 查找xx基因cD

5、NA序列，根據(jù)cDNA序列設(shè)計RT-qPCR引物，產(chǎn)物長度80-150bp最佳。引物由primer 5軟件設(shè)計，正反引物的Tm 值相差小于2，GC%比小于3。（2）、設(shè)計好的引物再通過NCBI blast 引物比對官網(wǎng)進(jìn)行初步篩選，并將設(shè)計好的引物交由相關(guān)基因公司（如華大基因）合成。（3）、新合成的引物以cDNA 為模板，添加gene star PCR mix 進(jìn)行預(yù)實驗，設(shè)計多個實驗重復(fù)，ABI梯度PCR儀上進(jìn)行梯度PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，marker 比對結(jié)果判定產(chǎn)物大小及引物退火溫度的最佳條件。（4）、將ABI 梯度PCR 儀在最佳退火條件下擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物交由相關(guān)基因公司（

6、如華大基因）進(jìn)行普通測序，用于判斷測序結(jié)果與目標(biāo)片段是否吻合，引物位置與初始引物設(shè)計位置是否相同。3、設(shè)計引物2022/9/30155、確定目的基因和內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率 及定量PCR數(shù)據(jù)處理方法根據(jù)絕對定量PCR原理，對cDNA進(jìn)行5個數(shù)量級的10倍梯度稀釋，利用各個濃度的cDNA進(jìn)行絕對定量以獲得相關(guān)基因的擴(kuò)增效率。2022/9/3017每個樣本基因的PCR反應(yīng)設(shè)置3個平行重復(fù)以保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，數(shù)據(jù)處理采用均值計算。反應(yīng)體系體積SYBR Green I Master Mix10ulForward Primer(10umol/L)1ulReverse Primer(10umol/L)1ulcDNA 模板1ulRnase ddH2O7ul總體積20ul6、實時熒光定量PCR (real time quantitative PCR，RT-qPCR)反應(yīng)體系2022/9/3018PCR均采用10 min預(yù)變性，徹底打開聚合酶活性。為了提高PCR擴(kuò)增效率，采用變性及退火進(jìn)行擴(kuò)增40個循環(huán)。擴(kuò)增結(jié)束后在相應(yīng)的溫度和時間中進(jìn)行變性和退火后開始“溶解曲線程序”。通過溶解曲線判斷產(chǎn)物的單一性及引