河北醫(yī)科大學(xué)熒光定量pcr的原理與應(yīng)用課件

1、熒光定量PCR原理及其應(yīng)用免疫教研室 楊建嶺 熒光定量PCR的原理 熒光定量PCR標(biāo)記方法 熒光定量PCR不同方法學(xué)的應(yīng)用 熒光定量PCR的原理 熒光定量PCR標(biāo)記方法 熒光定量PCR不同方法學(xué)的應(yīng)用 熒光定量PCR的定量原理Y：擴增產(chǎn)物數(shù)量X ：起始模板數(shù)量n：擴增循環(huán)數(shù)Y=X*2n= (1+ Ev) 在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進行定量分析的方法 實時熒光定量PCR中的三個概念增長曲線 (primary curve)熒光閾值（threshold)CT 值(Cycle Threshold) 閾值：PCR擴增信號進入相對穩(wěn)定

2、的指數(shù)增長期時的熒光信號值 (相當(dāng)于公式Y(jié)= X （1+Ev）n中的Y)Ct值：閾值所對應(yīng)的擴增循環(huán)數(shù)n(也就是公式Y(jié)= X (1+Ev)n中的n) PCR擴增與實時定量關(guān)系圖YnCt值閾值Ct值與起始模板的關(guān)系Y= X （1+Ev）n LgX =b(常數(shù)) n*a (常數(shù)), n=Ct Ct值與起始模板的關(guān)系研究表明，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標(biāo)代表Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。 常用的熒光標(biāo)記方法 基于雙

3、鏈DNA 內(nèi)摻染料的方法EB （第一代）SYBR Green 1 （第二代）LC Green PlusSYTO 9 （第三代）EvaGreen基于序列特異性探針的方法TaqMan探針Molecular BeaconsDual Probes(FRET)第一代常規(guī)雙鏈DNA內(nèi)摻式染料： 溴化乙錠 (EB)首個應(yīng)用于均一實時檢測的方法Russell Higuchi et al. 1992Simultaneous amplification and detection of specificDNA sequences. BioTechnology 10:413417熒光信號隨雙鏈DNA的出現(xiàn)而增強信號

4、弱，并且EB對PCR擴增有毒性(抑制作用)已不再使用第二代常規(guī)雙鏈DNA內(nèi)摻式染料： SYBR Green I價格便宜，使用簡便更亮 效果優(yōu)于EB廣泛應(yīng)用可用于熔解分析 + 電泳分析5353SGExcitationSGSGSGSGEmission內(nèi)摻式染料的工作原理 53535353SGSGSGSGSGEmissionEmissionExcitationExcitation內(nèi)摻式染料的工作原理 溫度熒光強度TmTm值：50%DNA變成單鏈時的溫度。熔解曲線分析PCR過程結(jié)束后，將溫度緩慢升高，此時雙鏈DNA解鏈成為單鏈，內(nèi)摻染料會被釋放出來，熒光信號逐漸減弱將溫度對熒光強度的變化求導(dǎo)。(-dI

5、/dT) 峰值代表斜率改變最大時的溫度值，即Tm，其值與雙鏈DNA的長度、GC%含量有關(guān)，可部分代表序列的特異性溶解曲線分析融解曲線分析，單一峰無非特異性熒光定量準(zhǔn)確融解曲線分析，出現(xiàn)雜峰其他產(chǎn)物出現(xiàn)非特異性熒光，因此定量不準(zhǔn)確常用的熒光標(biāo)記方法 基于雙鏈DNA 內(nèi)摻染料的方法EB （第一代）SYBR Green 1 （第二代）LC Green PlusSYTO 9 （第三代）EvaGreen基于序列特異性探針的方法TaqMan探針Dual Probes(FRET)Molecular Beacons與目標(biāo)序列互補TaqMan水解型雜交探針 5端標(biāo)記有報告基團(Reporter, R) ，如FA

6、M、VIC等 3端標(biāo)記有熒光淬滅基團 (Quencher, Q) 探針完整，R所發(fā)射的熒光能量被Q基團吸收 ，無熒光， R與Q分開，發(fā)熒光RQ53535353ExcitationRQQRQRExcitationTaqMan水解型雜交探針Oligo 1: FluoresceinOligo 2: LC Red 640ExcitationEmissionTransfer熒光共振能量傳遞（FRET Probe） 熒光定量PCR的原理 熒光定量PCR標(biāo)記方法 熒光定量PCR不同方法學(xué)的應(yīng)用 絕對定量（基因拷貝數(shù)的絕對定量） 熒光定量PCR不同方法學(xué)的應(yīng)用 相對定量（ 基因表達調(diào)控的相對定量） 相對定量

7、絕對定量 熒光定量PCR不同方法學(xué)的應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)曲線由系列稀釋的已知濃度的樣品做標(biāo)準(zhǔn)曲線計算待測樣品的初始模板濃度 LgX =b Ct*a定量分析絕對定量 未知濃度的樣品與標(biāo)準(zhǔn)曲線相比較X1X2Ct1Ct2 相對定量 絕對定量 熒光定量PCR不同方法學(xué)的應(yīng)用定量分析相對定量 Ct 雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法待測組目的基因平均Ct值待測組看家基因平均Ct值對照組目的基因平均Ct值對照組看家基因平均Ct值F=2-相對定量Ct法：公式： 應(yīng)用：基因表達調(diào)控研究中最常用與公認(rèn)的兩種相對定量方法之一CtCt待測Ct對照F=2 -Ct使用Ct法所要滿足的條件：條件： 1.假定目的基因與看家基因的擴增效率一致 2.假定擴增效

8、率為 100 %缺點： 實驗條件優(yōu)化（使目的基因和看家基因擴增效率相同）較為復(fù)雜優(yōu)點： 優(yōu)化的體系建立后，每次實驗中無需再對看家基因和目的基因做標(biāo)準(zhǔn)曲線，而只需對待測樣品分別進行PCR擴增即可某科研用戶使用Rotor-Gene 3000進行基因表達相對定量分析，下圖為用Ct法得出的分析結(jié)果 。（自備標(biāo)準(zhǔn)品，檢測樣品做3次重復(fù)復(fù)管）HouseKeeper GeneGene of Interest 定量分析相對定量定量分析相對定量Ct 雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法相對定量方法二雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法應(yīng)用：基因表達調(diào)控研究中最常用與公認(rèn)的兩種相對定量方法之一公式：待測樣品目的基因濃度待測樣品看家基因濃度對照樣品目的基因濃度對

9、照樣品看家基因濃度F=優(yōu)點：消除了由Ev差別而造成的誤差，結(jié)果更為準(zhǔn)確，分析簡單， 實驗優(yōu)化簡單缺點：對每一個基因，每一輪實驗都必需做標(biāo)準(zhǔn)曲線相對定量雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法某科研用戶使用Rotor-Gene 3000進行基因表達相對定量分析，下圖為用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法得出的分析結(jié)果 Comparative Delta-delta Ct法定量先進行預(yù)實驗，驗證目的基因與看家基因的擴增效率是否一致，具體操作如下：先將標(biāo)準(zhǔn)品進行系列稀釋作為模板，分別擴增看家基因和目的基因，分別做看家基因和目的基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線，比較兩個標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。如果斜率之差小于0.1，說明兩者擴增效率相同，可以用比較CT值法進行相對定量完成了上

10、述預(yù)試驗后，接下來對待測樣品和對照樣品進行相對定量分析首先分別對待測樣品和對照樣品的目的基因和看家基因進行擴增，然后將擴增的樣品頁面進行編輯，將目的基因和看家基因通過“yes”“no”的設(shè)定，分別列在兩頁中，相同的樣品命名相同的名稱，然后分別分析兩頁。分析完兩頁后進入Delta Delta CT 分析界面，進行分析Comparative Delta-delta Ct法定量P1相同的樣品在兩頁里命名成相同的名稱，并定義為unknown分別分析P1和P2頁選delta-delta Ct選項依次填入，并定義對照樣品完成分析P2公式 特點及注意事項優(yōu)點：當(dāng)優(yōu)化的體系已經(jīng)建立后，在每次實驗中無需再對看家

11、基因和目的基因做標(biāo)準(zhǔn)曲線，而只需對待測樣品分別進行PCR擴增即可。缺點：每次實驗都默認(rèn)目的基因和看家基因的擴增效率一致，而并非真實擴增情況的反映，這里勢必存在一定的誤差。注意事項：在預(yù)實驗中，必需對目的基因和看家基因做兩組標(biāo)準(zhǔn)曲線。Rotor-Gene 的軟件會自動給出兩組標(biāo)準(zhǔn)曲線的R值、擴增效率等信息，如果兩組標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，即M值的差小于0.1，那么后續(xù)實驗中就可以用Comparative Delta-delta Ct法進行相對定量分析。反之，如果M差值大于0.1，就無法用該方法進行相對定量分析。此時的解決方法有兩種，一是優(yōu)化實驗，使兩組標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率差值小于0.1，二是換用其它的相對定量

12、方法。將標(biāo)準(zhǔn)品進行梯度稀釋后，分別對目的基因（Gene of Interest）和看家基因（Housekeeper Gene）做標(biāo)準(zhǔn)曲線。 預(yù)試驗分別對待測樣品和對照樣品的看家基因和目的基因進行擴增 。 將目的基因和看家基因分別編輯在兩頁中（page），并將同一樣品命名成相同名稱。 Page 2：目的基因，其中10-18號管通過YES選中，樣品分別命名為A、B、C，其它未選中的樣品可以不進行編輯。Page 1：看家基因，其中1-9號管通過YES選中，樣品分別命名為A、B、C，其它未選中的樣品可以不進行編輯。通過進入Analysis，分別對page1和page2進行分析。注意：由于沒有標(biāo)準(zhǔn)品，軟

13、件無法自動給出閾值，需用手動設(shè)定，軟件會提示需手動進行閾值設(shè)定，此時只要點中右側(cè)按扭，在熒光曲線圖中上下拖動光標(biāo)即可。 問題：在分別分析兩頁時，是用絕對定量分析方法進行分析還是用別的方法分析？Validation Run Performed，提示是否已驗證過兩個基因的擴增效率一致，可用該定量方法進行分析。Gene of Interest Quantitation，選中Page 1或Page 2中編輯了目的基因的那一頁；Normaliser Quantitation，選中Page 1或Page 2中編輯了看家基因的那一頁；Calibrator Defined，選中A、B、C三個樣品中用來作為對照

14、組的一個。 雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量穩(wěn)定的梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品：梯度稀釋的含目的基因的質(zhì)粒或PCR產(chǎn)物，并設(shè)類型為Standard，給出濃度待檢測樣品：擴增目的基因unknown同一待測樣品命名同一名稱，并設(shè)類型為unknown分別分析P1和P2頁選Two Standard Curve選項依次填入，并定義對照樣品完成分析穩(wěn)定的標(biāo)準(zhǔn)品：梯度稀釋的含看家基因的質(zhì)?；騊CR產(chǎn)物，并設(shè)類型為Standard，給出濃度待檢測樣品：擴增看家基因unknownP1P2公式 特點及注意事項優(yōu)點：應(yīng)用簡便，無需像Delta-delta CT法那樣對實驗進行嚴(yán)格的優(yōu)化。缺點：每次實驗都必需對目的基因和看家基因做兩組標(biāo)準(zhǔn)曲線。 注意事項：如果用于做標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)品不同于樣品，比如標(biāo)準(zhǔn)品為質(zhì)粒或純化的PCR產(chǎn)物，而待測樣品為cDNA，那么標(biāo)準(zhǔn)曲線的擴增效率并不能真實地反映樣品的擴增情況，因此以標(biāo)準(zhǔn)曲線來計算樣品的實際濃度就存在一定誤差。1-6為目的基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線，7-12為看家基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線，待測樣品A、B、C，其中15-17擴增了樣品的看家基因，18-20擴增了樣品的目的基因。將所有目的基因編輯在一個page里，所有看家基因編輯在另一個page里，且相同的樣品以同樣名稱命名。編輯完成之后即得：Page 1：看家基因，其中7-12號管為標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過YES選中，15-17號管為待測