原核表達(dá)實(shí)驗(yàn)

1、原核表達(dá)操作流程實(shí)驗(yàn)概要本實(shí)驗(yàn)介紹了原核表達(dá)的具體操作流程，包括：外源基因的誘導(dǎo)表達(dá)，大腸桿 菌包涵體的分離與蛋白質(zhì)純化。實(shí)驗(yàn)原理E. coli表達(dá)系統(tǒng)E. coli是重要的原核表達(dá)體系。在重組基因轉(zhuǎn)化入E. coli菌株以后，通過 溫度的控制，誘導(dǎo)其在宿主菌內(nèi)表達(dá)目的蛋白質(zhì)，將表達(dá)樣品進(jìn)行SDS以檢測(cè)表達(dá)蛋白質(zhì)。外源基因的誘導(dǎo)表達(dá)提高外源基因表達(dá)水平的基本手段之一，就是將宿主菌的生長(zhǎng)與外源基因的表 達(dá)分成兩個(gè)階段，以減輕宿主菌的負(fù)荷。常用的有溫度誘導(dǎo)和藥物誘導(dǎo)。本實(shí) 驗(yàn)米用異丙基硫代-0 -D-半乳糖昔(IPTG)誘導(dǎo)外源基因表達(dá)。不同的表達(dá)質(zhì)粒表達(dá)方法并不完全相同，因啟動(dòng)子不同，誘導(dǎo)表達(dá)要

2、根據(jù)具體 情況而定。主要試劑誘導(dǎo)表達(dá)材料LB (Luria一Bertani)培養(yǎng)基酵母膏(Yeast extract) 5g 蛋白胨(Peptone) 10gNaCl 10g 瓊脂(Agar) 1-2%蒸餾水(Dis tilled wa ter) 1000ml pH 7.0 適用范圍：大腸桿菌IPTG貯備液：2 g IPTG溶于10 mL蒸餾水中，0 22卩m濾膜過濾除 菌，分裝成1 mL /份，一20 C保存。IX凝膠電泳加樣緩沖液：50 mmol / L Tris -CI ( pH 6 . 8 )50 mmol / L DTT2 % SDS (電泳級(jí))0.1 %溴酚藍(lán)10 %甘油大腸桿菌包

3、涵體的分離與蛋白純化材料酶溶法裂解緩沖液：50 mmol / L Tris-CI ( pH 8 . 0 )1 mmol / L EDTA100 mmol / LNaCl50 mmol / L苯甲基磺酰氟（PMSF ）。10 mg / mL 溶菌酶。脫氧膽酸。1 mg / mL DNase I。2）超聲破碎法TE緩沖液。2XSDS 凝膠電泳加樣緩沖液：100 mmol / L Tris-HCI （ pH 8 . 0 ）100 mmol / L DTT4 %SDS0.2 %溴酚藍(lán)20 %甘油主要設(shè)備超凈工作臺(tái)超聲破碎儀電泳設(shè)備移液槍培養(yǎng)皿實(shí)驗(yàn)步驟外源基因的誘導(dǎo)表達(dá)1）用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切核酸酶消化載

4、體DNA和目的基因。2）按連接步驟連接目的基因和載體，并轉(zhuǎn)化到相應(yīng)的宿主菌。3）篩選出含重組子的轉(zhuǎn)化菌落，提取質(zhì)粒DNA作限制性內(nèi)切核酸酶圖譜， DNA序列測(cè)定，確定無誤后進(jìn)行下一步。4）如果表達(dá)載體的原核啟動(dòng)子為PL啟動(dòng)子，則在30 -32C培養(yǎng)數(shù)小時(shí)， 使培養(yǎng)液的OD60達(dá)0.4-0.6，迅速使溫度升至42C繼續(xù)培養(yǎng)3 -5h ；如果表 達(dá)載體的原核啟動(dòng)子為tac等，則37C培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)小時(shí)達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后加 IPTG至終濃度為1 mmol / L。繼續(xù)培養(yǎng)3 -5h。5）取上述培養(yǎng)液1 mL , 1000g離心，1 min，沉淀，加100 “L聚丙烯 酰胺凝膠電泳上樣緩沖液后，作SDS 檢

5、測(cè)。大腸桿菌包涵體的分離與蛋白質(zhì)純化1）細(xì)菌的裂解常用方法有：高溫珠磨法；高壓勻漿；超聲破碎法；酶溶法；化學(xué)滲透等。前 三種方法屬機(jī)械破碎法，并且方法高溫珠磨法、高壓勻漿已在工業(yè)生產(chǎn)中得到 應(yīng)用，后三種方法在實(shí)驗(yàn)室研究中應(yīng)用較為廣泛。下面介紹酶溶法和超聲破碎 法的實(shí)驗(yàn)步驟。酶溶法。常用的溶解酶有溶菌酶；p -1,3 -葡聚糖酶；p -1,6 -葡聚 糖酶；蛋白酶；殼多糖酶；糖昔酶等。溶菌酶主要對(duì)細(xì)菌類有作用，而其他幾 種酶對(duì)酵母作用顯著。主要步驟為：4C, 5000rpm離心，15 min，收集誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)菌培養(yǎng)液（100 mL ）。棄上清，約每克濕菌加3 mL裂解緩沖液，懸浮沉淀。每克菌加8

6、p L PMSF及80p L溶菌酶，攪拌20 min ；邊攪拌邊 每克菌加4 mg脫氧膽酸（在冷室中進(jìn)行）。37C，玻棒攪拌，溶液變得粘稠時(shí)加每克菌20p L DNase I。室 溫放置至溶液不再粘稠。超聲破碎法。聲頻為15-20 kHz的超聲波在高強(qiáng)度聲能輸入下可以 進(jìn)行細(xì)胞破碎，在處理少量樣品時(shí)操作簡(jiǎn)便，液體量損失較少，同時(shí)還可對(duì)染 色體DNA進(jìn)行剪切，大大降低液體的粘稠度。收集1 L誘導(dǎo)表達(dá)的工程菌，40 C，5000r pm離心，15 min ； 棄上清，約每克濕菌加3 mLTE緩沖液。按超聲處理儀廠家提供的功能參數(shù)進(jìn)行破菌；10 000g離心，15min，分別收集上清液和沉淀。分別取

7、少量上清和沉淀，加入等體積的2X凝膠電泳加樣緩沖液, 進(jìn)行 SDS 。注意事項(xiàng)：超聲破碎與聲頻、聲能、處理時(shí)間、細(xì)胞濃度、菌種類型等因素有 關(guān)，應(yīng)根據(jù)具體情況掌握；超聲波破菌前，標(biāo)本經(jīng)3 -4次凍溶后更容易破碎。2）包涵體的分離蛋白質(zhì)在細(xì)菌中的高水平表達(dá)，常形成相差顯微鏡下可見到的細(xì)胞質(zhì)顆粒，即 為包涵體，經(jīng)離心沉淀后可用Triton-X100 / EDTA或尿素洗滌，若為獲取可 溶性的活性蛋白，須將洗滌過的包涵體重新溶解并進(jìn)行重折疊。a.試劑與配制洗滌液I:0.5 % Tri ton X -10010 mmol / L EDTA （ pH 8 . 0 ）溶于細(xì)胞裂解液中。2X凝膠電泳加樣緩沖

8、液。b.細(xì)胞裂解混合物12 OOOg離心，15 min , 4C；棄上清，沉淀用9X 洗滌液l懸浮；室溫放置5 min ; 12 OOOg離心15 min , 4C；吸出上清， 用100卩L水重新懸浮沉淀；分別取10卩L上清和重新懸浮的沉淀，加10 M L 2X凝膠電泳加樣緩沖液，進(jìn)行SDS。包涵體的溶解和復(fù)性試劑與配制緩沖液I：1 mmol / L PMSF8mol /L尿素10 mmol / L DTT溶于前述裂解緩沖液中。緩沖液II：50 mmol / L KH PO241 mmol / L EDTA ( pH 8 . 0 )50 mmol / L NaCI2 mmol / L還原型谷胱甘肽1 mmol / L氧化型谷胱甘肽KOH 和 HCI。2X凝膠電泳加樣緩沖液。用100 m L緩沖液I溶解包涵體；室溫放置lh ；加9乂緩沖液II, 室溫放置30 min，用KOH調(diào)pH到10.7 ；用HCI調(diào)至pH 8 . 0，在室溫放 置至少30 min; 1000g離心，15 min，室溫；吸出上清液并保留，用100 M L 2X凝膠電泳加樣緩沖液溶解沉淀；取10 m L上清，加10 M L 2X凝膠電泳 加樣緩沖液，與20 m L重新溶解的沉淀進(jìn)行