第十三章生化藥物制造工藝酶類藥物課件

1、第十三章生化藥物制造工藝酶類藥物2022/10/2第十三章生化藥物制造工藝酶類藥物第十三章生化藥物制造工藝酶類藥物2022/9/24第十三章生（3）從原料來源是否豐富考慮；（4）從簡化提純步驟著手。（5）如用動物組織作原料，則此動物宰殺后應(yīng)立即取材。 從動物或植物中提取酶受到原料的限制。 用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)藥用酶，不受季節(jié)、氣候和地域的限制，生產(chǎn)周期短，產(chǎn)量高，成本低，能大規(guī)模生產(chǎn)。 第十三章生化藥物制造工藝酶類藥物（3）從原料來源是否豐富考慮；第十三章生化藥物制造工藝酶類藥（二）微生物酶制劑高產(chǎn)菌株的選育 菌種是工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)酶制劑的重要條件。 目前，優(yōu)良菌種的獲得有三條途徑： 是從自然界分離

2、篩選； 是用物理或化學方法處理、誘變； 是用基因重組與細胞融合技術(shù)。 微生物的分離篩選是一切工作的基礎(chǔ)。第十三章生化藥物制造工藝酶類藥物（二）微生物酶制劑高產(chǎn)菌株的選育第十三章生化藥物制造工藝酶類（三）微生物酶制劑生產(chǎn)的發(fā)酵技術(shù) 有了優(yōu)良的生產(chǎn)菌株，只是酶生產(chǎn)的先決條件，要有效地進行生產(chǎn)還必須探索菌株產(chǎn)酶的最適培養(yǎng)條件。首先要合理選擇培養(yǎng)方法、培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度、pH和通氣量等。 在工業(yè)生產(chǎn)中還要摸索一系列工程和工藝條件，如培養(yǎng)基的滅菌方式、種子培養(yǎng)條件、發(fā)酵罐的型式、通氣條件、攪拌速度、溫度和pH調(diào)節(jié)控制等。 還要研究酶的分離提純技術(shù)和制備工藝，這些條件的綜合結(jié)果將決定酶生產(chǎn)本身的經(jīng)濟效益。第

3、十三章生化藥物制造工藝酶類藥物（三）微生物酶制劑生產(chǎn)的發(fā)酵技術(shù)第十三章生化藥物制造工藝酶類二、酶類藥物的提取和純化（一）生物材料的預(yù)處理 一般應(yīng)避免劇烈處理，但如是結(jié)合酶，則必須進行劇烈處理。1、動物材料的預(yù)處理（1）機械處理 用絞肉機絞，一般細胞并不破碎，而有的酶必須細胞破碎后才能有效地提取，因此須采用特殊的勻漿才行。第十三章生化藥物制造工藝酶類藥物二、酶類藥物的提取和純化第十三章生化藥物制造工藝酶類藥物 在實驗室常用的是玻璃勻漿器和組織搗碎器。 工業(yè)上可用高壓勻漿泵。（2）反復(fù)凍融 由于細胞中冰晶的形成，及剩下液體中鹽濃度的增高，能使細胞中顆粒及整個細胞破碎，從而使某些酶釋放出來。第十三章

4、生化藥物制造工藝酶類藥物 在實驗室常用的是玻璃勻漿器和組織搗碎器。第十三章（3）丙酮粉 組織經(jīng)丙酮迅速脫水干燥制成丙酮粉，不僅可減少酶的變性，同時因細胞結(jié)構(gòu)成分的破碎使蛋白質(zhì)與脂質(zhì)結(jié)合的某些化學鍵打開，促使某些結(jié)合酶釋放到溶液中，真空干燥即得丙酮粉。 丙酮粉在低溫下可保存數(shù)年。2、微生物的預(yù)處理 要是酶是胞外酶，則可除去菌體后再直接從發(fā)酵液中吸附提取酶。但對胞內(nèi)酶則需將菌體細胞破壁，制成無細胞的懸液后再行提取。第十三章生化藥物制造工藝酶類藥物（3）丙酮粉第十三章生化藥物制造工藝酶類藥物（1）干燥法 干燥方法很多，常見有空氣干燥、真空干燥和冷凍干燥三種。（2）機械法 常用的方法有研磨法，組織勻漿

5、法，超聲波法，高壓勻漿法等。（3）酶法處理 用得最多的是溶菌酶，也有用脫氧核糖核酸酶處理，操作與溶菌酶同。第十三章生化藥物制造工藝酶類藥物（1）干燥法第十三章生化藥物制造工藝酶類藥物（二）酶的提取 一般在提取前，應(yīng)通過調(diào)查研究，文獻檢索，詳細了解欲提取酶的性質(zhì)。 提取方法主要有水溶液法，有機溶劑法和表面活性劑法三種。第十三章生化藥物制造工藝酶類藥物（二）酶的提取第十三章生化藥物制造工藝酶類藥物1、水溶液法 常用稀鹽溶液或緩沖液提取。為了防止提取過程中酶活力降低，一般在低溫下操作。 第十三章生化藥物制造工藝酶類藥物1、水溶液法第十三章生化藥物制造工藝酶類藥物2、有機溶劑法 某些結(jié)合酶如微粒體和線

6、粒體膜的酶，由于和脂質(zhì)牢固結(jié)合，用水溶液很難提取，為此必須除去結(jié)合的脂質(zhì)，且不能使酶變性。 最常用的有機溶劑是丁醇。 丁醇具有下述性能： 親脂性強，特別是親磷脂的能力； 兼具親水性，在0在水中的溶解度為10.5； 在脂與水分子間能起類似去垢劑的橋梁作用。第十三章生化藥物制造工藝酶類藥物2、有機溶劑法第十三章生化藥物制造工藝酶類藥物3、表面活性劑法 表面活性劑分子具有親水性的或疏水性的原子基團。表面活性劑能與蛋白質(zhì)結(jié)合而分散在溶液中，故可用于提取結(jié)合酶，但此法用得較少。（三）酶制劑的工業(yè)提取法 工業(yè)生產(chǎn)的酶有二種劑型液體制劑和粉劑1、發(fā)酵液的預(yù)處理及過濾 現(xiàn)在處理方法是，在發(fā)酵液中加絮凝劑或凝固

7、劑。 微生物發(fā)酵液的分離，過濾，常采用的設(shè)備是轉(zhuǎn)鼓式真空吸濾機、離心沉降分離機和板框壓濾機。第十三章生化藥物制造工藝酶類藥物3、表面活性劑法第十三章生化藥物制造工藝酶類藥物2、酶液的脫色 工業(yè)上廉價的脫色劑是活性炭，用量通常為0115。 目前工業(yè)上大規(guī)模使用脫色樹脂國內(nèi)生產(chǎn)的幾種脫色樹脂，效果都較好。3、鹽析法 鹽析法的優(yōu)點是在常溫下不會造成酶的失活，若分級沉淀應(yīng)用得當，雜蛋白雜質(zhì)也較少，適用于多種酶沉淀。第十三章生化藥物制造工藝酶類藥物2、酶液的脫色第十三章生化藥物制造工藝酶類藥物4、有機溶劑法 用有機溶劑沉淀蛋白質(zhì)及用分級沉淀法純化蛋白質(zhì)。工業(yè)上通常采用乙醇作為沉淀劑。5、噴霧干燥直接制各

8、粉末酶制劑 噴霧干燥有很大局限性，尤其藥用酶制劑都很難過溫度這一關(guān)。 噴霧干燥用于菌體干燥，而藥用酶常用冷凍干燥。 除上述方法外，工業(yè)上提取酶制劑的方法還有丹寧沉淀法、白土活性氧化鋁吸附法、pH或加熱沉淀法、蛋白質(zhì)表面變性法等。 第十三章生化藥物制造工藝酶類藥物4、有機溶劑法第十三章生化藥物制造工藝酶類藥物（四）酶的純化 酶的純化。評價主要看二個指標，一是酶比活，二是總活力回收。 本節(jié)重點討論酶在純化過程中遇到的一些技術(shù)難點。1、雜質(zhì)的除去 酶提取液中，除所需酶外，還含有大量的雜蛋白、多糖、脂類和核酸等。第十三章生化藥物制造工藝酶類藥物（四）酶的純化第十三章生化藥物制造工藝酶類藥物（1）pH和

9、加熱沉淀法 利用蛋白質(zhì)酸堿變性性質(zhì)的差別可以通過調(diào)pH和等電點除去某些雜蛋白，也可利用不同蛋白質(zhì)對熱穩(wěn)定的差異，使雜蛋白變性而沉淀。（2）蛋白質(zhì)表面變性法 利用蛋白質(zhì)表面變性性質(zhì)的差別，也可除去雜蛋白。例如：加入三氯甲烷和乙醇進行震蕩，可以除去雜蛋白。（3）選擇性變性法 利用蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的不同，除去雜蛋白。甚至可用25三氯乙酸處理，這時其他雜蛋白都變性而沉淀。第十三章生化藥物制造工藝酶類藥物（1）pH和加熱沉淀法 第十三章生化藥物制造工藝酶類藥物（4）核酸沉淀劑法 在用微生物制備酶時，常含有較多的核酸，為此，可用核酸酶，將核酸降解成核苷酸。 也可用一些核酸沉淀劑如二甲基十六烷基溴化銨、硫酸鏈霉

10、素、聚乙烯亞胺、魚精蛋白和二氯化錳等：（5）將酶與底物結(jié)合， 酶和底物結(jié)合或競爭性抑制劑結(jié)合后，穩(wěn)定性大大提高，這樣就可用加熱法除去雜蛋白。第十三章生化藥物制造工藝酶類藥物（4）核酸沉淀劑法 第十三章生化藥物制造工藝酶類藥物2、脫鹽和濃縮（1）脫鹽 酶的提純以及酶的性質(zhì)研究中，常常需要脫鹽。最常用的脫鹽方法是透析和凝膠過濾。（2）濃縮 酶的濃縮方法很多，有冷凍干燥、離子交換、超濾、凝膠吸水、聚乙二醇吸水等。第十三章生化藥物制造工藝酶類藥物2、脫鹽和濃縮第十三章生化藥物制造工藝酶類藥物3、酶的結(jié)晶 把酶提純到一定純度以后（通常純度應(yīng)達50以上），可使其結(jié)晶，但伴隨著結(jié)晶的形成，酶的純度經(jīng)常有一定

11、程度的提高。 酶的結(jié)晶既是提純的結(jié)果，也是提純的手段，此外，為研究蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)提供射線衍射樣品，也是酶的結(jié)晶的重要目標之一。 第十三章生化藥物制造工藝酶類藥物3、酶的結(jié)晶第十三章生化藥物制造工藝酶類藥物（1）酶的結(jié)晶方法 酶的結(jié)晶方法主要是緩慢地改變酶蛋白的溶解度，使其略處于過飽和狀態(tài)。 改變酶溶解度的方法很多，一般新樣品往往要使用幾種方法才能得到結(jié)晶。第十三章生化藥物制造工藝酶類藥物（1）酶的結(jié)晶方法 第十三章生化藥物制造工藝酶類藥物 鹽析法。 在適當?shù)膒H、溫度等條件下，保持酶的穩(wěn)定，慢慢改變鹽濃度進行結(jié)晶。 結(jié)晶時采用的鹽有硫酸銨、檸檬酸鈉、乙酸鈉、硫酸鎂和甲酸鈉等。 第十三章生化藥物

12、制造工藝酶類藥物 鹽析法。第十三章生化藥物制造工藝酶類藥物 有機溶劑法。 酶液中滴加有機溶劑，有時也能使酶形成結(jié)晶。 結(jié)晶用的有機溶劑有：乙醇、丙醇、丁醇、乙腈、異丙醇、二惡烷、二甲亞砜、二氧雜環(huán)己烷等。用有機溶劑法易引起酶失活。 復(fù)合結(jié)晶法。 有時可以利用某些酶與有機化合物或金屬離子形成復(fù)合物或鹽的性質(zhì)來結(jié)晶。 透析平衡法。 對一定的鹽溶液或有機溶劑進行透析平衡，這時酶液可緩慢地達到過飽和而析出結(jié)晶。第十三章生化藥物制造工藝酶類藥物 有機溶劑法。第十三章生化藥物制造工藝酶類藥物 等電點法。 一般地說，在等電點附近酶的溶解度很小，這一特征為酶的結(jié)晶條件提供了理論根據(jù)。（2）結(jié)晶條件的選擇 在進

13、行酶的結(jié)晶時，要選擇一定條件與相應(yīng)的結(jié)晶方法配合。這不僅為了能夠得到結(jié)晶，也是為了保證不引起酶活力喪失。 影響酶結(jié)晶因素很多，下列幾個條件尤為重要：第十三章生化藥物制造工藝酶類藥物 等電點法。第十三章生化藥物制造工藝酶類藥物 酶的純度。 總的來說酶的純度越高，結(jié)晶越容易，長成大的單晶可能性也越大。 酶的濃度。 結(jié)晶母液通常應(yīng)保持盡可能高的濃度。酶的濃度越高越有利于溶液中溶質(zhì)分子間的相互碰撞聚合，形成結(jié)晶的機會也越大，對大多數(shù)酶來說，蛋白質(zhì)濃度為510mgml為好。 溫度。 結(jié)晶的溫度通常在4下或室溫25下，低溫條件下酶不僅溶解度低，而且不易變性。 第十三章生化藥物制造工藝酶類藥物 酶的純度。第

14、十三章生化藥物制造工藝酶類藥物 時間。 結(jié)晶形成的時間長短不一，從數(shù)小時到幾個月都有，有的甚至需要1年或更長時間。 pH。除沉淀劑的濃度外，在結(jié)晶條件方面最重要的因素是pH。結(jié)晶溶液pH一般選擇在被結(jié)晶酶的等電點附近。 金屬離子。許多金屬離子能引起或有助于酶的結(jié)晶，在二價金屬離子存在情況下，有促進結(jié)晶長大作用。第十三章生化藥物制造工藝酶類藥物 時間。第十三章生化藥物制造工藝酶類藥物 晶種。不易結(jié)晶的蛋白質(zhì)和酶，有的需加入微量的晶種才能結(jié)晶。生長大的單晶時，也可引入晶種。 結(jié)晶器皿處理。結(jié)晶用的器皿要充分清洗、烘干。使用前用結(jié)晶母液再沖洗一次，也可用壓縮空氣或惰性氣體吹去灰塵。 用于長結(jié)晶的玻璃

15、器皿，可用硅涂料進行表面處理，以使表面光滑且不潤濕。這樣可減少晶核數(shù)目，有助于形成大的單晶。第十三章生化藥物制造工藝酶類藥物 晶種。不易結(jié)晶的蛋白質(zhì)和酶，有的需加入微量的晶種4、酶分離和純化工作中的注意事項 酶是蛋白質(zhì)，一般不太穩(wěn)定。提純過程中，酶純度越高，就越不穩(wěn)定，酶分離純化時尤其要注意以下幾點：（1）防止酶蛋白變性 為防止酶蛋白變性，應(yīng)避免pH過高或過低，應(yīng)避免高溫。一般要在中性pH和低溫（4左右）下操作。為防止酶蛋白的表面變性，不可劇烈攪拌，以免產(chǎn)生泡沫。應(yīng)避免酶和重金屬或其他蛋白變性劑接觸。如要用有機溶劑處理酶液，操作盡可能在低溫下，短時間內(nèi)進行。（2）防止輔因子的流失 有些酶除酶蛋

16、白外，還含有輔酶、輔基和金屬等輔因子。在進行超濾、透析等操作時，要防止這些輔因子的流失。第十三章生化藥物制造工藝酶類藥物4、酶分離和純化工作中的注意事項第十三章生化藥物制造工藝酶類（3）防止酶被蛋白水解酶降解 在提取液尤其微生物培養(yǎng)液中，常常同時存在一些蛋白水解酶，要及時采取有效措施將它們除去。 如果操作時間長，還要防止雜菌污染酶液，造成所需要酶的失活。第十三章生化藥物制造工藝酶類藥物（3）防止酶被蛋白水解酶降解 在提取液尤其微生物培養(yǎng)液中，常三、重要酶類藥物的制備（一）藥用酶類的概述 現(xiàn)在國內(nèi)外已廣泛應(yīng)用于多種疾病的治療，其制劑品種已超過700余種。1、與治療胃腸道疾病有關(guān)的酶類藥物 利用酶

17、作為消化促進劑，早已為人們所采用。 2、消炎酶類3、與纖維蛋白溶解作用有關(guān)的酶類4、抗腫瘤的酶5、其它藥用酶第十三章生化藥物制造工藝酶類藥物三、重要酶類藥物的制備第十三章生化藥物制造工藝酶類藥物1、胃蛋白酶（Pepsin，EC3.4.4.1） 胃蛋白酶廣泛存在于哺乳類動物的胃液中，藥用胃蛋白酶系從豬、牛、羊等家畜的胃粘膜中提取。 （1）組成（結(jié)構(gòu)）、性質(zhì) 藥用胃蛋白酶是胃液中多種蛋白水解酶的混合物，含有胃蛋白酶、組織蛋白酶、膠原酶等，為粗制的酶制劑。 水溶液呈酸性，難溶于乙醇、氯仿等有機溶劑。 pI為pH1.0，最適pH1.52.0。可溶于70乙醇和pH4的20乙醇中。 胃蛋白酶能水解大多數(shù)天

18、然蛋白質(zhì)底物。 第十三章生化藥物制造工藝酶類藥物1、胃蛋白酶（Pepsin，EC3.4.4.1）第十三章生化（2）生產(chǎn)工藝 1）工藝路線： 胃蛋白酶原鹽酸催化激活成胃蛋白酶。 常用的脫脂劑有乙醚、氯仿、四氯化碳。第十三章生化藥物制造工藝酶類藥物（2）生產(chǎn)工藝第十三章生化藥物制造工藝酶類藥物 2）工藝過程： 3）胃膜素和胃蛋白酶聯(lián)產(chǎn)工藝：向經(jīng)消化、提取、脫脂、分層、濃縮及60丙酮沉淀分離胃膜素的母液中，邊攪拌邊加冷丙酮，至比重為0.91，即有淡黃色胃蛋白酶沉出，靜放過夜，去上清液，沉淀真空干燥，即得胃蛋白酶。 4）結(jié)晶胃蛋白酶的制備：藥用胃蛋白酶原粉，溶于20酒精中，加H2SO4調(diào)pH3.0，5

19、靜置20h后過濾，加硫酸鎂至飽和，進行鹽析。鹽析物再在pH3.84.0的乙醇中溶解，過濾，濾液用硫酸調(diào)pH至1.82.0，即析出針狀胃蛋白酶。沉淀再溶于20% pH4的乙醇中，過濾，濾液用硫酸調(diào)pH至1.8，在20放置，可得板狀或針狀結(jié)晶。第十三章生化藥物制造工藝酶類藥物 2）工藝過程：第十三章生化藥物制造工藝酶類藥物2、胰蛋白酶 胰蛋白酶是從牛、羊胰臟提取、結(jié)晶的凍干制劑。 （1）化學組成與性質(zhì) 易溶于水，不溶于氯仿、乙醇、乙醚等有機溶劑。在pH1.8時，短時煮沸幾乎不失活；在堿溶液中加熱則變性沉淀，Ca2+有保護和激活作用，胰蛋白酶的pI為10.1。 牛胰蛋白酶在腸激酶或自身催化下，釋放出

20、6肽，變成有活性的胰蛋白酶。 胰蛋白酶專一作用于由堿性氨基酸精氨酸及亮氨酸羧基所組成的肽鍵。酶本身很容易自溶。第十三章生化藥物制造工藝酶類藥物2、胰蛋白酶第十三章生化藥物制造工藝酶類藥物（2）生產(chǎn)工藝 1）工藝路線：第十三章生化藥物制造工藝酶類藥物（2）生產(chǎn)工藝 第十三章生化藥物制造工藝酶類藥物3、尿激酶（Urokinase，EC3.4.99.26） 尿激酶，是一種堿性蛋白酶。由腎臟產(chǎn)生，主要存在于人及哺乳動物的尿中。（1）組成（結(jié)構(gòu)）性質(zhì) 1）尿中的尿胃蛋白酶原，在酸性條件下可以激活生成尿胃蛋白酶，把天然尿激酶原降解成為尿激酶。 2）尿激酶是專一性很強的蛋白水解酶，它作用于精氨酸-纈氨酸鍵使

21、纖溶酶原轉(zhuǎn)為纖溶酶。尿激酶也具有酯酶活力。第十三章生化藥物制造工藝酶類藥物3、尿激酶（Urokinase，EC3.4.99.26）第十 3）尿激酶的pI為pH89，主要部分在pH8.6左右。溶液狀態(tài)不穩(wěn)定，凍干狀態(tài)可穩(wěn)定數(shù)年。加入1EDTA、人血白蛋白或明膠可防止酶的表面變性作用。（2）生產(chǎn)工藝1）工藝路線：第十三章生化藥物制造工藝酶類藥物 3）尿激酶的pI為pH89，主要部分在pH8.6左 2）工藝過程： 硅藻土吸附 ，0.02氨水加0.1molL氯化鈉洗脫。 QAESephadex層析柱 去熱原、色素。CMC濃縮 。 第十三章生化藥物制造工藝酶類藥物 2）工藝過程：第十三章生化藥物制造工藝

22、酶類藥物4、蚯蚓纖溶酶 本草綱目中記載蚯蚓又稱地龍、曲蟮，能活血化淤，主治肢體麻木，口眼歪斜語言障礙，半身不遂等。 近代生物學家發(fā)現(xiàn)，蚯蚓死后，其死體能很快的自行溶解。經(jīng)研究揭示，蚯蚓體內(nèi)存在有纖維蛋白水解酶及纖維蛋白酶原激活物質(zhì)而使其死體自行溶解。人們以人工養(yǎng)殖的蚯蚓為原料，獲得一組能水解纖維蛋白的活性物質(zhì)，稱為蚯蚓纖溶酶。經(jīng)藥理實驗證明，對體內(nèi)、體外血栓和纖維蛋白均有明顯的溶解作用，能使纖維蛋白的精氨酸及賴氨酸羧基端鏈水解，又能激活纖溶酶原轉(zhuǎn)化成纖溶酶，具有雙重作用，溶栓更迅速，更徹底。第十三章生化藥物制造工藝酶類藥物4、蚯蚓纖溶酶第十三章生化藥物制造工藝酶類藥物（1）化學組成和性質(zhì) 蚯蚓

23、纖溶酶是一組蛋白水解酶類。蚯蚓的種類不同，其含酶量和酶的活性也不同活性組分的相對分子量通常在2000070000。呈白色或微黃色粉末，易溶于水，最適pH8，加熱70全部失去活力。 制備時，常選用赤子愛勝蚓、鋸齒遠蚓、太平2號蚓（赤子愛勝蚓與美國紅蚯蚓雜交種）、湖北環(huán)毛蚓）等。第十三章生化藥物制造工藝酶類藥物（1）化學組成和性質(zhì)第十三章生化藥物制造工藝酶類藥物 2）以赤子愛勝蚓為原料制備蚯蚓纖溶酶 取人工養(yǎng)殖蚯蚓放入水中浸泡1h，盡量排出內(nèi)臟污物，洗凈，于組織搗碎機中勻漿，再加入等體積01molL NaCl液，于冰箱中提取6h，以6000rmin離心20min，棄取沉淀，上清液加固體（NH4）2SO4至70飽和度，冰箱放置過夜