醫(yī)學(xué)藥敏試驗方法簡介培訓(xùn)課件

1、藥敏試驗方法簡介藥敏試驗方法簡介耐藥菌問題日益嚴(yán)重“目前藥物失去作用的速度與科學(xué)家發(fā)現(xiàn)新藥物的速度差不多?！?摘自WHO報告耐藥菌問題日益嚴(yán)重“目前藥物失去作用的速度與科學(xué)家發(fā)現(xiàn)新藥物抗微生物治療面臨的困境抗藥性問題始終存在細(xì)菌不斷獲得新的耐藥機(jī)制以往對付耐藥性的策略收效不顯抗微生物治療面臨的困境抗藥性問題始終存在醫(yī)學(xué)藥敏試驗方法簡介培訓(xùn)課件一、 抗菌藥物敏感試驗（AST）預(yù)測抗菌治療的效果；指導(dǎo)抗菌藥物的臨床應(yīng)用；發(fā)現(xiàn)或提示細(xì)菌耐藥機(jī)制的存在，指導(dǎo)合理用藥，避免產(chǎn)生或加重細(xì)菌的耐藥；監(jiān)測細(xì)菌耐藥性，分析耐藥菌的變遷，掌握耐藥菌感染的流行病學(xué)，以控制和預(yù)防耐藥菌感染的發(fā)生和流行。 一、 抗菌藥

2、物敏感試驗（AST）預(yù)測抗菌治療的效果；（1）抗菌藥物的選擇在我國主要遵循臨床實(shí)驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會（Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI）制定的抗菌藥物選擇原則A組：對特定菌群常規(guī)測試并報告的藥物 B組：可常規(guī)測試、選擇性報告的藥物C組：替代性或補(bǔ)充性藥物U組：僅用于泌尿道感染的抗菌藥物（1）抗菌藥物的選擇葡萄球菌屬抗菌藥物藥敏試驗推薦分組葡萄球菌屬抗菌藥物藥敏試驗推薦分組腸桿菌科抗菌藥物敏感試驗推薦分組腸桿菌科抗菌藥物敏感試驗推薦分組假單胞菌屬的抗菌藥物藥物敏感推薦分組假單胞菌屬的抗菌藥物藥物敏感推薦分組不動桿菌屬的抗菌藥物藥敏試驗

3、推薦分組不動桿菌屬的抗菌藥物藥敏試驗推薦分組腸球菌屬抗菌藥物藥敏試驗推薦分組 腸球菌屬抗菌藥物藥敏試驗推薦分組 肺炎鏈球菌抗菌藥物藥敏試驗推薦分組肺炎鏈球菌抗菌藥物藥敏試驗推薦分組藥敏試驗的折點(diǎn)亦遵照每年最新公布的CLSI標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，分為敏感（S）、耐藥（R）和中介（I）。藥敏試驗的折點(diǎn)亦遵照每年最新公布的CLSI標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，分為敏感敏感：分離菌株能被測試藥物使用推薦劑量時在感染部位通?？蛇_(dá)到的抗菌藥物濃度所抑制耐藥：分離菌株不能被測試藥物常規(guī)劑量可達(dá)到的藥物濃度所抑制；分離菌株可能存在某些特定的耐藥機(jī)制；治療研究顯示藥物對分離菌株的臨床療效不可靠耐藥治療無效；敏感治療有效敏感：分離菌株能被測試藥

4、物使用推薦劑量時在感染部位通?？蛇_(dá)到二、抗菌藥物的種類及作用機(jī)制二、抗菌藥物的種類及作用機(jī)制三、藥敏試驗方法學(xué)紙片擴(kuò)散法（K-B法）稀釋法（MIC法）肉湯稀釋法常量稀釋法微量稀釋法瓊脂稀釋法E-test法1.手工試驗三、藥敏試驗方法學(xué)紙片擴(kuò)散法（K-B法）1.手工試驗2.自動儀器藥敏系統(tǒng) 2.自動儀器藥敏系統(tǒng)紙片擴(kuò)散法（K-B法）原理：抑菌圈的大小反映受試菌對測定藥物的敏感程度，并與該藥對測試菌的MIC呈負(fù)相關(guān)。 紙片擴(kuò)散法（K-B法）耐藥 中介 敏感RISLog2. MIC d1 d2 抑菌圈直徑（mm)MIC與抑菌圈直徑的線性關(guān)系耐藥 中介 準(zhǔn)備抗菌藥物紙片和水解酪蛋白（M-H）培養(yǎng)基；挑

5、取孵育16 24小時已分純菌落，置于生理鹽水管中，振蕩混勻后校正濃度至0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)；準(zhǔn)備抗菌藥物紙片和水解酪蛋白（M-H）培養(yǎng)基；用無菌棉拭子蘸取菌液，在試管內(nèi)壁旋轉(zhuǎn)擠去多余菌液，然后在MH瓊脂表面均勻涂布接種3次，每次旋轉(zhuǎn)平板60度，最后沿平板內(nèi)緣涂抹1周；平板在室溫下干燥35min，用無菌鑷子或商品化的紙片分配器將含藥紙片緊貼于瓊脂表面；用無菌棉拭子蘸取菌液，在試管內(nèi)壁旋轉(zhuǎn)擠去多余菌液，然后在MH35孵育1624小時，量取抑菌圈直徑；根據(jù)抑菌環(huán)的直徑，按照CLSI標(biāo)準(zhǔn)判讀，報告敏感、中介、耐藥。35孵育1624小時，量取抑菌圈直徑；2022/10/223CLSI對K-B法的標(biāo)準(zhǔn)化規(guī)定紙片

6、藥物含量、細(xì)菌接種濃度、培養(yǎng)基、平皿厚度、孵育時間、環(huán)境、判定標(biāo)準(zhǔn)、質(zhì)控方法等；常規(guī)測試、報告的抗生素。不同的藥判定標(biāo)準(zhǔn)不同；不同的菌判定標(biāo)準(zhǔn)也不同。2022/10/22022/10/223CLSI對K-B法的標(biāo)準(zhǔn)化規(guī)定2022擴(kuò)散法藥敏影響因素培養(yǎng)基pH值7.2-7.4營養(yǎng)程度（腸球菌能生長）厚度抗生素拮抗劑含量（用29212監(jiān)控）鈣鎂離子含量、鋅離子含量（用27853氨基糖苷類和亞胺配能結(jié)果監(jiān)控）菌懸液濃度高抑菌環(huán)縮?。倌退帲舛鹊蛣t擴(kuò)大（假敏感）細(xì)菌純度氣體環(huán)境普通細(xì)菌放CO2時由于碳酸的影響，藥物活性受到影響，形成假敏感或假耐藥苛養(yǎng)菌放普通環(huán)境生長不良，導(dǎo)致假敏感培養(yǎng)時間粘液性銅綠需

7、48小時測量方法擴(kuò)散法藥敏影響因素培養(yǎng)基細(xì)菌純度稀釋法以一定濃度的抗菌藥物與含有受試菌的培養(yǎng)基進(jìn)行一系列不同倍數(shù)稀釋（通常為雙倍稀釋），培養(yǎng)1624h后，通過觀察細(xì)菌生長現(xiàn)象來測得藥物對受試菌的最低抑菌濃度（MIC）。2022/10/2稀釋法2022/10/2稀釋法（MIC法）MIC法：分為常量法和微量法常量法：肉湯稀釋法、瓊脂稀釋法微量法：微量肉湯稀釋法簡化雙濃度折點(diǎn)法 ATB藥敏簡化常規(guī)濃度分布MIC法 BD、德靈藥敏動力學(xué)計算MIC法 VITEK32、VITEK2藥敏稀釋法（MIC法）MIC法：分為常量法和微量法肉湯稀釋法不生長 = 抗生素抑制細(xì)菌生長 生長 = 抗生素?zé)o法抑制細(xì)菌生長M

8、IC (最小抑菌濃度) = 抗生素可抑制細(xì)菌生長的最小濃度。.250.512481632MIC = 8Increasing Antibiotic Conc.肉湯稀釋法不生長 = 抗生素抑制細(xì)菌生長 .250.512常量稀釋法藥敏試驗的參考方法： 將標(biāo)準(zhǔn)接種物加入含対倍稀釋抗生素的MH肉湯管中. 過夜培養(yǎng). MIC 即是能抑制細(xì)菌生長的含最低抗生素的濃度的那一管所標(biāo)示的濃度值(瓊脂稀釋法是將対倍稀釋后的抗生素加入融化后平衡到50的MHA中再傾制平皿，接種物為一定大小的斑點(diǎn)，濃度也為104CFU/ml). 解釋標(biāo)準(zhǔn)(S or R) 是建立在體內(nèi)可達(dá)到的抗生素濃度水平上104 cfu/ml4210.

9、50.250.120mg/ml常量稀釋法藥敏試驗的參考方法： 將標(biāo)準(zhǔn)接種物加入含対倍稀釋抗微量肉湯稀釋法微量肉湯稀釋法醫(yī)學(xué)藥敏試驗方法簡介培訓(xùn)課件醫(yī)學(xué)藥敏試驗方法簡介培訓(xùn)課件接種后應(yīng)充分混勻，但不能有氣泡產(chǎn)生靜置培養(yǎng)培養(yǎng)溫度；35氣體環(huán)境：所有細(xì)菌（包括苛養(yǎng)菌）均置大氣環(huán)境；厭氧菌置厭氧環(huán)境；微需氧菌置微需氧環(huán)境；淋菌瓊脂稀釋法置CO2培養(yǎng)時間：18小時接種后應(yīng)充分混勻，但不能有氣泡產(chǎn)生藥敏結(jié)果報告可用MIC（g/ml）或?qū)φ誄LSI標(biāo)準(zhǔn)用S、R和I報告。對于稀釋法的批量試驗，有時需要報告MIC50、MIC90。2022/10/2藥敏結(jié)果報告可用MIC（g/ml）或?qū)φ誄LSI標(biāo)準(zhǔn)用S、稀釋法

10、藥敏影響因素培養(yǎng)基pH值 7.2-7.4營養(yǎng)程度抗生素拮抗劑含量鈣鎂離子含量（鈣10-25；鎂10-12.5g/ml）菌懸液（5104CFU/ml）接種效應(yīng)濃度高M(jìn)IC抬高濃度低MIC壓低細(xì)菌純度氣體環(huán)境所有需氧細(xì)菌均放普通大氣環(huán)境。如果放CO2，由于碳酸的影響，藥物活性受到影響，形成假敏感或假耐藥培養(yǎng)時間真菌需48小時奴卡菌需5天稀釋法藥敏影響因素培養(yǎng)基細(xì)菌純度E-test法將稀釋法和擴(kuò)散法的原理結(jié)合起來，直接測定藥物對受試菌的MIC 。2022/10/2E-test法2022/10/2MIC 值標(biāo)注于試條的光面Etest 試條毛面貼于MHA上MIC 值標(biāo)注于試條的光面Etest 試條毛面貼

11、于MHA上Etest 操作程序按照擴(kuò)散法標(biāo)準(zhǔn)操作涂布接種貼上試條并培養(yǎng)15-18小時讀取抑菌濃度并按標(biāo)準(zhǔn)解釋Etest 操作程序按照擴(kuò)散法標(biāo)準(zhǔn)操作涂布接種貼上試條并培養(yǎng) 細(xì)菌生長區(qū)E試條細(xì)菌生長抑制區(qū) 256 128 80.16判讀MIC2022/10/2 細(xì)菌生長區(qū)E試條細(xì)菌生長抑制區(qū) 判讀MIC2022/10/肺炎鏈球菌青霉素 MIC = 3 g/ml 結(jié)果讀取肺炎鏈球菌青霉素 MIC 結(jié)果讀取醫(yī)學(xué)藥敏試驗方法簡介培訓(xùn)課件BD PhoenixTM -100 鳳凰全自動細(xì)菌鑒定/藥敏檢測系統(tǒng)最大的標(biāo)本容量：對100個標(biāo)本同時進(jìn)行鑒定與藥敏測試！BD PhoenixTM -100 最大的標(biāo)本容

12、量：對100醫(yī)學(xué)藥敏試驗方法簡介培訓(xùn)課件醫(yī)學(xué)藥敏試驗方法簡介培訓(xùn)課件鑒定部分：51孔鑒定實(shí)驗改良經(jīng)典實(shí)驗顯色熒光檢測無需附加實(shí)驗與試劑藥敏部分：85孔藥敏實(shí)驗比濁氧化還原（專利）實(shí)測倍比稀釋MIC值藥物種類與濃度梯度最多耐藥機(jī)制檢測同步進(jìn)行封閉式設(shè)計，安全無泄漏先進(jìn)的鑒定/藥敏復(fù)合板設(shè)計鑒定部分：藥敏部分：封閉式設(shè)計，安全無泄漏先進(jìn)的鑒定/藥敏復(fù)PhoenixTM100鑒定板革蘭氏陽性板、革蘭氏陰性板生化反應(yīng)組合革蘭氏陽性菌鑒定板革蘭氏陰性菌鑒定板鑒定部分：51孔鑒定實(shí)驗,改良經(jīng)典實(shí)驗顯色熒光檢測,無需附加實(shí)驗與試劑PhoenixTM100鑒定板革蘭氏陽性板、革蘭氏陰性板生醫(yī)學(xué)藥敏試驗方法簡介

13、培訓(xùn)課件醫(yī)學(xué)藥敏試驗方法簡介培訓(xùn)課件鑒定實(shí)驗方法在研究了上百種反應(yīng)底物基礎(chǔ)上，選擇了45種反應(yīng)底物。檢測板每20分鐘檢測一次Green, blue and red 檢測顯色反應(yīng)UV light檢測熒光反應(yīng)panel鑒定實(shí)驗方法在研究了上百種反應(yīng)底物基礎(chǔ)上，選擇了45種反應(yīng)底Phoenix工作流程 從經(jīng)過夜純培養(yǎng)的新鮮平板上挑取菌落Phoenix工作流程 從經(jīng)過夜純培養(yǎng)的新鮮平板上挑取菌落Phoenix工作流程 在ID肉湯中制成標(biāo)準(zhǔn)濁度（0.50.6麥 氏單位）的菌懸液Phoenix工作流程 在ID肉湯中制成標(biāo)準(zhǔn)濁度（0.5 加一滴AST指示劑到AST肉湯中 Phoenix工作流程 加一滴AST

14、指示劑到AST肉湯中Phoenix工作流程 從ID肉湯管中準(zhǔn)確吸取25 L菌懸液， 加入到AST肉湯中Phoenix工作流程 從ID肉湯管中準(zhǔn)確吸取25 L菌懸液，Phoenix工 將肉湯倒入檢測板，蓋蓋子。檢測板 已準(zhǔn)備好，可以上機(jī)檢測。Phoenix工作流程巧妙的重力加樣技術(shù) 將肉湯倒入檢測板，蓋蓋子。檢測板 Phoenix工作流 掃描板條，輸入資料Phoenix工作流程 掃描板條，輸入資料Phoenix工作流程 將檢測板放入儀器（隨意位置） Phoenix工作流程 將檢測板放入儀器（隨意位置） Phoenix工作流程僅需區(qū)別革蘭氏染色即可選板板條種類齊全： 鑒定板、藥敏板、鑒定藥敏復(fù)合板

15、同時提供獨(dú)立密封包裝的鑒定肉湯和藥敏肉湯，無需用戶配制。試劑常溫保存配套試劑僅需區(qū)別革蘭氏染色即可選板配套試劑強(qiáng)大軟件支持： BDXpert微生物專家系統(tǒng)幫助解釋和監(jiān)測檢測結(jié)果檢測結(jié)果分別可分別傳入LIS系統(tǒng)或BD Epicenter數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)或打印機(jī)，并能進(jìn)行各種統(tǒng)計學(xué)分析強(qiáng)大的軟件系統(tǒng)強(qiáng)大軟件支持：強(qiáng)大的軟件系統(tǒng)鑒定能力 革蘭氏陽性菌鑒定180種 革蘭氏陽性球菌 革蘭氏陽性桿菌 革蘭氏陰性菌鑒定200種 革蘭氏陰性發(fā)酵桿菌 革蘭氏陰性非發(fā)酵桿菌無需附加實(shí)驗95-96% 準(zhǔn)確性鑒定時間 minimum 1:26 hr maximum 12:25 hr average 3:24 hr med

16、ian 2:26 hr 95th % 6:26 hr優(yōu)異的鑒定性能鑒定能力鑒定時間優(yōu)異的鑒定性能檢測反應(yīng)孔內(nèi)微生物生長情況濁度（傳統(tǒng)方法）： 微生物生長形成小顆粒和聚集成團(tuán)塊 氧化還原作用（BD專利技術(shù)） ： 通過藥敏實(shí)驗指示劑顏色變化檢測微生物的新陳代謝濁度與氧化還原的變化通過紅、藍(lán)、綠光每20分鐘檢測一次 藥敏實(shí)驗方法檢測反應(yīng)孔內(nèi)微生物生長情況藥敏實(shí)驗方法藥敏種類與時間葡萄球菌屬鏈球菌腸球菌屬腸桿菌屬其他革蘭氏陰性桿菌GN - 90% in 5 HrsGP - 80% in 6 Hrs藥敏特點(diǎn)對倍稀釋藥物濃度真正的MIC檢測延遲耐藥檢測急診報告快速完成功能 耐藥檢測無需附加板條 自動檢測1

17、8種耐藥機(jī)制產(chǎn)超廣譜Beta內(nèi)酰胺酶檢測(ESBL)耐甲氧西林葡萄球菌檢測(MRS)鏈霉素高耐株檢測(HLSR)慶大霉素高耐株檢測(HLGR)耐萬古霉素腸球菌檢測(VRE)產(chǎn)Beta內(nèi)酰胺酶革蘭氏陽性菌檢測優(yōu)異的藥敏性能 耐藥檢測無需附加板條優(yōu)異的藥敏性能儀器判讀結(jié)果儀器自動記錄每次判讀的每個反應(yīng)孔的結(jié)果。 將反應(yīng)結(jié)果與上一次判讀結(jié)果進(jìn)行比較。當(dāng)兩次結(jié)果沒有差別，則該反應(yīng)結(jié)束。內(nèi)置的運(yùn)算法則：顏色比率的變化依時間而變的數(shù)據(jù)庫：2、3、4、6、12小時，依據(jù)每個測試周期的判讀結(jié)果產(chǎn)生“百分比圖”，如獲得足夠的信息，則給出鑒定結(jié)果。標(biāo)準(zhǔn)菌量,可信度90，給出結(jié)果。儀器判讀結(jié)果儀器自動記錄每次判讀的

18、每個反應(yīng)孔的結(jié)果。 BDXpert微生物專家系統(tǒng)鑒定實(shí)驗BDXpert專家系統(tǒng) - NCCLS - DIN - SFM - BD Rules報告 - ID - MI - Rule set SIR - BDXpert SIR - 特殊信息 藥敏實(shí)驗BDXpert微生物專家系統(tǒng)鑒定實(shí)驗BDXpert專家藥敏實(shí)BDXpert微生物專家系統(tǒng)目的對藥敏結(jié)果進(jìn)行解釋與修正，保證藥敏實(shí)驗結(jié)果準(zhǔn)確可靠，從而指導(dǎo)臨床正確進(jìn)行抗感染治療 專家規(guī)則來自于：已確定的標(biāo)準(zhǔn)（NCCLS,DIN,SFM)藥物研發(fā)單位的文獻(xiàn)資料已廣為接受的文獻(xiàn)資料和經(jīng)驗持續(xù)更新BDXpert微生物專家系統(tǒng)目的對藥敏結(jié)果進(jìn)行解釋與修正，保BD

19、Xpert微生物專家系統(tǒng)規(guī)則的應(yīng)用SIR結(jié)果的解釋來自于專家系統(tǒng)規(guī)則的設(shè)置NCCLS, DIN, SFM, Custom藥物分級規(guī)則天然耐藥和天然敏感規(guī)則耐藥標(biāo)記規(guī)則腸桿菌科： ESBL葡萄球菌： MRS, beta-內(nèi)酰胺酶 (GP BL)腸球菌：VRE, HLGR, HLSRBDXpert微生物專家系統(tǒng)規(guī)則的應(yīng)用SIR結(jié)果的解釋來自于舉例：SIR解釋 規(guī)則規(guī)定 腸桿菌科細(xì)菌Ampicillin breakpoints: S8 (I=16) R32Ref: Table 2A(NCCLS M100-S12, 2002)Phoenix 顯示如果 待檢菌是腸桿菌科細(xì)菌，且藥物為 ampicillin，MIC = 2 那么 結(jié)果顯示為“S”BDXpert微生物專家系統(tǒng)規(guī)則的應(yīng)用舉例：SIR解釋 規(guī)則規(guī)定Phoenix 顯示B舉例：天然耐藥規(guī)則規(guī)定規(guī)則： C. freundii 在體內(nèi)對ampicillin和 amoxicillin天然耐藥Ref: Br