重組蛋白和多肽的分離純化

1、重組蛋白和多肽的分離純化1. 概述分離純化組成了基因工程的下游處理（downstream processing） 階段，這一過程又和上游過程緊密相聯(lián)系，上游過程的諸方面影響到下游的分離純化，所以在進(jìn)行目標(biāo)蛋白質(zhì)表達(dá)純化時要統(tǒng)一考慮和整體設(shè)計，并充分考慮上游因 素對下游的影響，如是否帶有親和標(biāo)簽，是否進(jìn)行分泌表達(dá)。目前應(yīng)用最廣泛的表達(dá)系統(tǒng)有三大類，分別是大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、 HYPERLINK /Search.asp?Field=Title&ClassID=&keyword=%E9%85%B5%E6%AF%8D 酵母表達(dá)系統(tǒng)和CHO細(xì) 胞表達(dá)系統(tǒng)，不同的表達(dá)系統(tǒng)和培養(yǎng)方法顯著影響下游的處理過程，目

2、標(biāo)蛋白表達(dá)是否形成包涵體，目標(biāo)蛋白表達(dá)的定位（胞內(nèi)、細(xì)胞內(nèi)膜、周質(zhì)空間和胞外），蛋 白表達(dá)的量都依賴于所選擇的表達(dá)系統(tǒng)。選擇將所表達(dá)的蛋白分泌到細(xì)胞外或周質(zhì)空間可以避免破碎細(xì)胞的步驟，并且由于蛋白質(zhì)種類少，目標(biāo)蛋白容易純化；而在 細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)蛋白，可能是可溶性表達(dá)，可能形成包涵體，可溶性的蛋白往往需要復(fù)雜的純化步驟，而包涵體易于分離，純度較高，但回收具有生物活性的蛋白卻變 的相當(dāng)困難，需要對聚集的蛋白進(jìn)行變復(fù)性，通常活性蛋白的得率比較低，表1列出了不同策略對表達(dá)、純化的影響，對于其中的有些缺點可以通過一定的方法進(jìn)行克服和避免，如利用DNA重組技術(shù)給外源蛋白加上一個親和純化的標(biāo)簽，有助于可溶性外

3、源蛋白的選擇性純化，并能保護(hù)目標(biāo)蛋白不被降解（96）。表 1 重重組蛋白白不同表表達(dá)策略略的優(yōu)點點和缺點點表達(dá)策略優(yōu)點缺點分泌表達(dá)至至細(xì)胞外外增強正確二二硫鍵的的形成降低蛋白酶酶對表達(dá)達(dá)蛋白的的降解可獲得確定定的N末端顯著減少雜雜蛋白水水平，簡簡化純化化不需要細(xì)胞胞破碎表達(dá)水平低低多數(shù)蛋白不不能進(jìn)行行分泌表表達(dá)表達(dá)蛋白需需要進(jìn)行行濃縮細(xì)胞周質(zhì)空空間表達(dá)達(dá)增強正確二二硫鍵的的形成可獲得確定定的N末端顯著減少雜雜蛋白水水平，簡簡化純化化好些蛋白不不能分泌泌進(jìn)入周周質(zhì)空間間沒有大規(guī)模模選擇性性的釋放放周質(zhì)空空間蛋白白的技術(shù)術(shù)周質(zhì)蛋白酶酶可引起起重組蛋蛋白酶解解胞內(nèi)包涵體體表達(dá)包涵體易于于分離保護(hù)蛋白

4、質(zhì)質(zhì)不被降降解蛋白質(zhì)不具具有活性性對宿主主細(xì)胞生生長沒有有大的影影響，通通?？色@獲得高的的表達(dá)水水平需要體外的的折疊和和溶解，得得率較低低具有不確定定N末端胞內(nèi)可溶性性蛋白表表達(dá)不需要體外外溶解和和折疊一般具有正正確的結(jié)結(jié)構(gòu)和功功能高水平的表表達(dá)常難難以得到到需要復(fù)雜的的純化可發(fā)生蛋白白質(zhì)的酶酶解具有不確定定的N末端在 細(xì)胞的的提取物物中，除除了目標(biāo)標(biāo)蛋白外外，還含含有其它它各種性性質(zhì)的蛋蛋白、核核酸、多多糖等。在在這樣一一個混合合體系中中，蛋白白質(zhì)純化化要求將將目標(biāo)蛋蛋白與其其它的成成分分離離，得到到一定 的量，達(dá)達(dá)到一定定的純度度，同時時要盡可可能保留留蛋白的的生物活活性，并并使蛋白白保持

5、完完整。所所以蛋白白質(zhì)的分分離純化化可以看看作是一一系列的的分部收收集過程程，總是是希望目目標(biāo)蛋白白富集 于其中中的一個個收集部部位，而而大量的的雜蛋白白存在于于其它的的收集部部位。當(dāng)當(dāng)然對目目標(biāo)蛋白白純度的的要求要要根據(jù)純純化蛋白白的用途途而定，對對于治療療性的蛋蛋白要求求有大于于99%的純度度，并對對處方有有活性和和穩(wěn)定性性的要求求，對于于某些酶酶的純度度則要求求較低，需需要在純純度和得得率之間間進(jìn)行一一個平衡衡，所以以下游的的工藝流流程取決決于最終終對目標(biāo)標(biāo)蛋白的的要求。蛋 白質(zhì)的的功能依依賴于蛋蛋白質(zhì)的的結(jié)構(gòu)，對對于有生生物活性性的蛋白白質(zhì)，在在分離純純化過程程中必須須根據(jù)目目標(biāo)蛋白白

6、的特點點，采用用合適的的操作條條件和方方法，保保證目標(biāo)標(biāo)蛋白的的活性盡盡量不 損失。除除了在分分離純化化的初期期，要采采用快速速的方法法除去影影響目標(biāo)標(biāo)蛋白穩(wěn)穩(wěn)定性的的雜質(zhì)，還還要嚴(yán)格格控制涉涉及蛋白白質(zhì)變性性的各種種因素，來來避免蛋蛋白質(zhì)失失去活性性。蛋白白質(zhì)的構(gòu)構(gòu) 象穩(wěn)定定性可以以通過測測定蛋白白質(zhì)變性性反應(yīng)時時折疊（f）和去折疊（u）間自由能的變化（Gfu）來衡量，Gfu越大蛋白質(zhì)就越穩(wěn)定。根據(jù)報導(dǎo)蛋白質(zhì)的Gfu在520kcal/mol范圍之間，單個氫鍵可造成0.52kcal/mol自由能的變化，一個離子對可造成0.41.0kcal/mol自由能的變化，因此Gfu相對比較小，這樣天然狀態(tài)

7、僅僅比去折疊狀態(tài)穩(wěn)定一點，所以必須克服蛋白質(zhì)內(nèi)在的不穩(wěn)定性，保留蛋白的活性。這一點在分離純化和蛋白質(zhì)儲存中都很重要，影響蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的因素有溫度、pH、離子強度、某些添加劑、表面吸附、震搖、剪切力、凍融、蛋白濃度、壓力等，這些因素對折疊的影響有的是可逆的，有的是不可逆的，而且相互之間也有影響，在實際處理中應(yīng)選擇合適的條件，盡量避免不利因素的影響（2），并利用活性跟蹤的方法對處理進(jìn)行評價，指導(dǎo)分離純化。在 進(jìn)行任任何純化化工作時時，第一一步必須須針對目目標(biāo)蛋白白建立特特異性的的分析方方法。這這些特異異性的分分析方法法都是基基于目標(biāo)標(biāo)蛋白的的一些特特性，如如酶的活活性，免免疫學(xué)活活性，物物理特性性

8、 （如分分子量、等等電點、光光譜學(xué)特特征等），生生物學(xué)活活性。在在理想的的情況下下，我們們希望所所選擇的的分析方方法具有有特異、快快速、靈靈敏和可可定量的的特點。特特異性要要求分析析方法反反 映目標(biāo)標(biāo)蛋白的的獨特性性，以排排除假陽陽性?？炜焖賱t要要求能很很快的給給出定性性和定量量結(jié)果，以以便更好好的與分分離純化化的工作作相銜接接。靈敏敏的分析析方法僅僅需要少少量的樣樣品，這這就給 操作帶帶來了極極大的方方便。在在分離純純化的每每一步，都都需要對對蛋白和和活性進(jìn)進(jìn)行定量量，這就就要求分分析方法法有準(zhǔn)確確可定量量的特點點，以對對分離純純化的效效果進(jìn)行行評價。如如通過SSDS-PAGGE電泳泳測定蛋

9、蛋白質(zhì)分分子量來來鑒定蛋蛋白質(zhì)，由由于電泳泳的分辨辨率限制制，常常常不能確確定收集集部位中中是否含含有目標(biāo)標(biāo)蛋白或或目標(biāo)蛋蛋白是否否得到了了富集，這這時就需需要運用用更特異異的分析析方法，如如Wessterrn bblotttinng就 可以從從復(fù)雜的的混合物物中描述述蛋白的的分子量量，并對對蛋白進(jìn)進(jìn)行定量量。另外外當(dāng)一些些蛋白沒沒有方便便可用的的生物學(xué)學(xué)活性測測定方法法，或者者由于干干擾物質(zhì)質(zhì)的存在在不能測測活，可可應(yīng)用一一 些免疫疫學(xué)的方方法進(jìn)行行檢測。在在純化的的過程中中，需要要監(jiān)測以以下幾個個參數(shù)：總的樣樣品體積積，樣品品中總的的蛋白，目目標(biāo)蛋白白的活性性單位，通通過這些些基本的的信息

10、，就就可以跟跟蹤每 步純化化的效率率，計算算出目標(biāo)標(biāo)蛋白的的回收率率，目標(biāo)標(biāo)蛋白的的比活性性，以及及純化的的倍數(shù)，從從而對純純化的每每一步，乃乃至整個個流程進(jìn)進(jìn)行定量量評價。Richard等在純化重組大腸桿菌RNA聚合酶32亞基的工作中給出了很好的范例，在定量測定項中，包括了蛋白質(zhì)的定量測定、定量SDS、定量蛋白質(zhì)斑點印跡和酶活測定，使用這些方法對操作的每一個階段取樣進(jìn)行純化效果的評價，從而確保每一步純化的有效性（1）。正是由于分析方法在分離純化中的指導(dǎo)性作用，所以有效的分析方法是分離純化是否能夠成功的前提。1. 分離離純化的的方法策策略及其其應(yīng)用下 游的分分離純化化步驟不不僅要在在可替換換的

11、分離離技術(shù)間間進(jìn)行選選擇，如如細(xì)胞的的破碎可可選擇高高壓勻漿漿法、高高速珠磨磨法、超超聲破碎碎或酶溶溶法，分分離細(xì)胞胞、細(xì)胞胞碎片、包包涵體和和沉淀 物，可可選擇離離心或過過濾，需需要進(jìn)行行濃縮的的時候，可可選擇沉沉淀或超超濾；另另一方面面，設(shè)計計的純化化工藝包包括特定定的層析析步驟，及及層析的的先后順順序，以以期得到到最大的的得率。吸吸 附層析析，如離離子交換換層析，疏疏水層析析和親和和層析，可可基于特特定的選選擇性達(dá)達(dá)到對目目標(biāo)蛋白白的純化化，適用用于大量量樣品的的處理。凝凝膠過濾濾層析用用于后續(xù)續(xù)的精制制步驟，如如去除 少量的的雜蛋白白或聚合合體，在在純化過過程中用用于脫鹽鹽和緩沖沖液交

12、換換。在分分離純化化中對每每個步驟驟的選擇擇，可以以遵循以以下原則則：1 應(yīng)盡可可能的利利用蛋白白質(zhì)的不不同物理理特性選選擇所用用的分離離純化技技術(shù)，而而不是利利用相同同的技術(shù)術(shù)進(jìn)行多多次純化化；2不 同的蛋蛋白質(zhì)在在性質(zhì)上上有很大大的不同同，這是是能從復(fù)復(fù)雜的混混合物中中純化出出目標(biāo)蛋蛋白的依依據(jù)，每每一步純純化步驟驟應(yīng)當(dāng)充充分利用用目標(biāo)蛋蛋白和雜雜質(zhì)成分分物理性性質(zhì)的差差異。所所以在分分 離純化化的開始始階段，要要盡可能能的了解解目標(biāo)蛋蛋白的特特性，不不僅如此此還要了了解所存存在雜質(zhì)質(zhì)成分的的性質(zhì)，如如大腸桿桿菌的蛋蛋白大多多是一些些低分子子量的蛋蛋白（500000DDa），而而且酸性性蛋

13、白較較多；33 在純純化的早早期階段段要盡量量減少處處理的體體積，方方便后續(xù)續(xù)的純化化；4 在純化化的后期期階段，再再使用造造價高的的純化方方法，這這是因為為處理的的量和雜雜質(zhì)的量量都已減減少，有有利于昂昂貴純化化材料的的重復(fù)使使用，減減少再生生的復(fù)雜雜性（884）。在下游的純純化工藝藝中為了了提高蛋蛋白的得得率和處處理的效效率，應(yīng)應(yīng)當(dāng)使用用最少的的純化步步驟，經(jīng)經(jīng)典的純純化過程程如圖11 所示示。在初初始的純純化階段段，除了了使目標(biāo)標(biāo)蛋白和和細(xì)胞內(nèi)內(nèi)的DNNA、RNAA、 多糖以以及性質(zhì)質(zhì)差別較較大的蛋蛋白質(zhì)成成分分離離，采用用的分離離方法要要能除去去影響目目標(biāo)蛋白白穩(wěn)定性性的雜質(zhì)質(zhì)，保護(hù)護(hù)

14、目標(biāo)蛋蛋白不被被蛋白酶酶降解，進(jìn)進(jìn)行目標(biāo)標(biāo)蛋白的的捕獲和和濃縮。在在這 一階段段的純化化中，鹽鹽析沉淀淀仍然應(yīng)應(yīng)用，但但共沉淀淀的雜質(zhì)質(zhì)常常很很多，離離子交換換層析和和疏水層層析具有有操作上上的優(yōu)點點，可以以再生使使用，成成為這一一步通常常選用的的層析方方法；中中 間階段段純化是是最為關(guān)關(guān)鍵的階階段，這這時要能能達(dá)到和和大量的的雜蛋白白分離，利利用蛋白白質(zhì)不同同的性質(zhì)質(zhì)選擇不不同的純純化方法法，每一一步的方方法要有有足夠的的選擇性性，提高高目標(biāo)蛋蛋白質(zhì) 的純度度；最后后進(jìn)行精精制純化化，常用用凝膠層層析，使使目標(biāo)蛋蛋白的純純度進(jìn)一一步提高高達(dá)到要要求。對對于包涵涵體蛋白白質(zhì)，由由于涉及及包涵體

15、體蛋白質(zhì)質(zhì)的變復(fù)復(fù)性，其其純化步步驟和方方法與可可 溶性蛋蛋白不同同，需要要對每一一種包涵涵體蛋白白質(zhì)建立立相應(yīng)的的復(fù)性方方法，將將在后面面作介紹紹。圖1 經(jīng)典典的蛋白白質(zhì)純化化流程圖圖在工業(yè)上，為為了盡可可能提高高過程的的通量和和減少生生產(chǎn)的成成本，發(fā)發(fā)展的方方法與傳傳統(tǒng)的方方法不同同。雙水水相萃取取和擴張張床吸附附技術(shù)，可可以處理理全 HYPERLINK /Search.asp?Field=Title&ClassID=&keyword=%E7%BB%86%E8%83%9E%E5%9F%B9%E5%85%BB 細(xì)胞胞培養(yǎng)液液，通過過整合技技術(shù)的使使用，能能達(dá)到萃萃取、濃濃縮和初初步純化化的目

16、的的。另外外這兩種種技術(shù)和和親和相相互作用用結(jié)合可可進(jìn)一步步提高處處理的選選擇性。相相似的，親親和相互互作用還還可以整整合進(jìn)其其它的高高通量處處理，如如親和膜膜過濾和和親和沉沉淀（22）。生生產(chǎn)上使使用的非非線性色色譜，如如置換色色譜，一一次層析析的載量量很大，得得到的蛋蛋白純度度很高，近近年來也也有很大大的發(fā)展展和應(yīng)用用（855,366）。2.1 包包涵體蛋蛋白質(zhì)的的折疊復(fù)復(fù)性在過去幾十十年的發(fā)發(fā)展過程程中，重重組DNNA技術(shù)術(shù)為大規(guī)規(guī)模生產(chǎn)產(chǎn)目標(biāo)蛋蛋白提供供了新的的途徑，盡盡管有不不同的宿宿主系統(tǒng)統(tǒng)可供選選擇，如如果翻譯譯后修飾飾不是蛋蛋白質(zhì)功功能所必必需的話話，大腸腸桿菌和和其它的的原核

17、宿宿主系統(tǒng)統(tǒng)仍然是是生產(chǎn)重重組蛋白白的首選選(177)。細(xì)細(xì)菌如大大腸桿菌菌可以在在短時間間里得到到高水平平表達(dá)的的蛋白質(zhì)質(zhì)，但同同時表達(dá)達(dá)的蛋白白質(zhì)常常常形成非非活性的的包涵體體。包涵涵體的形形成是一一個由許許多蛋白白質(zhì)參與與的極端端復(fù)雜的的動力學(xué)學(xué)過程，依依賴于蛋蛋白質(zhì)的的折疊速速率和聚聚集速率率，并且且與蛋白白質(zhì)的合合成和降降解程度度相關(guān)（35）。 強的表達(dá)系統(tǒng)，高的誘導(dǎo)劑濃度，相對較高的培養(yǎng)溫度常常造成包涵體的形成。除了外界因素，包涵體的形成依賴于蛋白質(zhì)特異的折疊行為，而不是蛋白的通常特 性，如大小，融合標(biāo)簽，相對的疏水性。盡管如此，限制折疊速率的結(jié)構(gòu)特性，如二硫鍵的形成常常是含有二硫

18、鍵蛋白質(zhì)正確折疊的限速步驟（并不絕對，因為有些 蛋白質(zhì)二硫鍵的破壞并不影響其功能），富含二硫鍵的蛋白質(zhì)具有更為復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，當(dāng)高水平表達(dá)時，由于大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)是一個偏還原性的環(huán)境，蛋白質(zhì)容易形成 錯配的二硫鍵，這常常是包涵體形成的主要原因。膜蛋白具有暴露的疏水區(qū)，表達(dá)時易于聚集形成包涵體，也有可能由于降解或?qū)?xì)胞的毒性作用使得表達(dá)水平極低 （45）。蛋白質(zhì)的糖基化可以影響到蛋白質(zhì)的折疊行為和溶解性，當(dāng)它們在原核系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)時，也容易聚集（4）。蛋白質(zhì)進(jìn)行行可溶性性表達(dá)和和表達(dá)形形成包涵涵體各有有利弊，對對許多蛋蛋白，再再折疊很很困難，或或者不可可能，進(jìn)進(jìn)行可溶溶性的表表達(dá)就是是首選?，F(xiàn)現(xiàn)在發(fā)展展

19、了許多多方法減減少包涵涵體的形形成，如如使用中中等強度度或弱的的啟動子子，低溫溫培養(yǎng)，有有限的誘誘導(dǎo)，優(yōu)優(yōu)化培養(yǎng)養(yǎng)基條件件，進(jìn)行行融合表表達(dá)(449)，與與伴侶分分子和折折疊酶共共表達(dá)(3,55)，表表達(dá)定位位于不同同的空間間(7,58)，選擇擇突變的的菌株（6,43）或其他的原核表達(dá)系統(tǒng)(34)。由于影響蛋白質(zhì)細(xì)胞合成和折疊的因素太多，優(yōu)化結(jié)果不可預(yù)測，如對于 HYPERLINK /antibody/ 抗體Fab片段，盡管只有可變區(qū)序列不同，也不能預(yù)測新的Fab片段在體內(nèi)是否可以正確折疊（4），所以即使采用了促進(jìn)可溶性表達(dá)的方法，也不能保證不形成包涵體。從 另一方方面來講講形成的的包涵體體易

20、于和和細(xì)胞的的其它成成分分離離，而且且過量表表達(dá)的目目標(biāo)蛋白白在包涵涵體中得得到了富富集，提提高了純純度，降降低了分分離純化化的難度度。所以以如果包包涵體蛋蛋 白可以以進(jìn)行體體外的正正確折疊疊，那么么形成包包涵體就就可以接接受，對對易受細(xì)細(xì)菌蛋白白酶降解解的蛋白白質(zhì)或?qū)?xì)菌有有毒性的的蛋白質(zhì)質(zhì)來說，表表達(dá)產(chǎn)生生包涵體體是絕對對必要的的。內(nèi)皮皮抑素 （enddosttatiin）可可以特異異性的抑抑制內(nèi)皮皮細(xì)胞的的增殖，具具有抑制制新生血血管生成成和抑制制腫瘤生生長的作作用，已已進(jìn)入臨臨床研究究階段。采采用 HYPERLINK /Search.asp?Field=Title&ClassID=&

21、keyword=%E9%85%B5%E6%AF%8D 酵母母表 達(dá)系統(tǒng)統(tǒng)，可直直接產(chǎn)生生具有活活性的蛋蛋白質(zhì)，但但是表達(dá)達(dá)的水平平和蛋白白質(zhì)的回回收率較較低，采采用大腸腸桿菌表表達(dá)則形形成包涵涵體，包包涵體蛋蛋白質(zhì)的的折疊復(fù)復(fù)性非常常困難，改改善蛋白白質(zhì) 的折疊疊復(fù)性具具有實際際的應(yīng)用用意義。通通過對內(nèi)內(nèi)皮抑素素折疊機機制的研研究表明明，緊密密折疊的的內(nèi)皮抑抑素對酸酸耐受，在在酸性條條件下有有可能得得到大量量的正確確折疊的的蛋白質(zhì)質(zhì)（155）。所所以如果果對于包包涵體蛋蛋白質(zhì)，通通過機制制的研究究，能夠夠解決折折疊復(fù)性性的問題題，那么么利用包包涵體的的高水平平表達(dá)，就就可以得得到大量量的蛋白白

22、質(zhì)，降降低生產(chǎn)產(chǎn)的成本本。在包涵體蛋蛋白質(zhì)的的變復(fù)性性中，不不管是采采用什么么方法進(jìn)進(jìn)行折疊疊，都要要用變性性劑溶解解包涵體體，最終終又都要要去除變變性劑，理理解變性性劑對蛋蛋白質(zhì)的的影響可可以指導(dǎo)導(dǎo)我們設(shè)設(shè)計復(fù)性性過程。 圖2：在各各種變性性劑濃度度條件下下蛋白質(zhì)質(zhì)的溶解解性和構(gòu)構(gòu)象。如圖2所示示，隨著著變性劑劑濃度的的變化，不不僅具有有天然構(gòu)構(gòu)象狀態(tài)態(tài)蛋白質(zhì)質(zhì)的比率率在改變變，而且且蛋白質(zhì)質(zhì)的溶解解性也在在改變。在在高的變變性劑濃濃度條件件下，蛋蛋白質(zhì)的的極性和和非極性性側(cè)鏈都都是可溶溶的，但但是蛋白白質(zhì)卻是是去折疊疊的，如如圖2中d所標(biāo)的的區(qū)段。在在低的變變性劑濃濃度條件件下，如如圖2中

23、a區(qū)段所所示，天天然構(gòu)象象的蛋白白質(zhì)是穩(wěn)穩(wěn)定的，但但也會穩(wěn)穩(wěn)定部分分折疊的的中間體體，這些些部分折折疊的 HYPERLINK /industry/Special/middle/Index.shtml 中中間體易易于自我我締合形形成沉淀淀。所以以選擇bb區(qū)段所所在的變變性劑濃濃度來進(jìn)進(jìn)行蛋白白質(zhì)的折折疊更為為有效，這這一區(qū)段段即可以以穩(wěn)定蛋蛋白質(zhì)的的天然構(gòu)構(gòu)象，而而且可以以增加天天然構(gòu)象象蛋白質(zhì)質(zhì)的溶解解性，對對于部分分折疊的的 HYPERLINK /industry/Special/middle/Index.shtml 中間體體卻沒有有穩(wěn)定作作用。避避免選擇擇c區(qū)段所所在的條條件進(jìn)行行折疊，因

24、因為這一一區(qū)段天天然和變變性的蛋蛋白質(zhì)都都只有有有限的溶溶解性，折折疊速度度也很慢慢（133）。這這一圖示示所展示示的規(guī)律律對所有有蛋白并并不是統(tǒng)統(tǒng)一的，但但它向我我們描述述了一個個大概的的情況，在在這一過過程，不不僅僅要要考慮變變性劑對對天然構(gòu)構(gòu)象和折折疊 HYPERLINK /industry/Special/middle/Index.shtml 中間間體的穩(wěn)穩(wěn)定作用用，還要要考慮對對蛋白溶溶解性的的影響。在在高的變變性劑濃濃度，蛋蛋白質(zhì)是是去折疊疊的，充充分溶劑劑化的，柔柔性的，在在折疊緩緩沖溶液液中，蛋蛋白質(zhì)是是折疊的的，具有有剛性的的，將蛋蛋白質(zhì)從從高變性性劑濃度度條件變變?yōu)檎郫B疊緩

25、沖溶溶液，就就會使蛋蛋白質(zhì)坍坍塌形成成緊湊的的結(jié)構(gòu)，但但蛋白的的這一過過程不總總能有效效進(jìn)行，常常常存在在錯誤折折疊和聚聚集，所所以在包包涵體的的變復(fù)性性過程中中，除了了要控制制上面所所講的參參數(shù)，還還有兩方方面的參參數(shù)需要要控制，一一是應(yīng)用用添加劑劑，來促促進(jìn)折疊疊、減少少聚集，二二是控制制溶液的的氧化還還原狀態(tài)態(tài)促進(jìn)二二硫鍵的的正確配配對。通常從包涵涵體中回回收活性性蛋白質(zhì)質(zhì)包括三三個步驟驟：包涵涵體的分分離和洗洗滌，包包涵體蛋蛋白質(zhì)的的溶解和和溶解蛋蛋白質(zhì)的的再折疊疊。前兩兩個步驟驟效率較較高，但但是再折折疊的效效率率常常常不能能令人滿滿意，折折疊的方方法和折折疊的條條件需要要通過實實驗

26、來進(jìn)進(jìn)行篩選選。2.1.11 蛋白白質(zhì)折疊疊的過程程和機理理對蛋白質(zhì)折折疊機理理的研究究，對保保留蛋白白質(zhì)活性性，維持持蛋白質(zhì)質(zhì)穩(wěn)定性性和包涵涵體蛋白白質(zhì)折疊疊復(fù)性都都具有重重要的意意義(221)。早早在上世世紀(jì)300年代，我我國生化化界先驅(qū)驅(qū)吳憲教教授就對對蛋白質(zhì)質(zhì)的變性性作用進(jìn)進(jìn)行了闡闡釋（88），300年后，AAnfiinseen通過過對核糖糖核酸酶酶A的經(jīng)典典研究表表明去折折疊的蛋蛋白質(zhì)在在體外可可以自發(fā)發(fā)的進(jìn)行行再折疊疊，僅僅僅是序列列本身已已經(jīng)包括括了蛋白白質(zhì)正確確折疊的的所有信信息（99,100），并并提出蛋蛋白質(zhì)折折疊的熱熱力學(xué)假假說，為為此Annfinnsenn獲得19972

27、年年諾貝爾爾化學(xué)獎獎。這一一理論有有兩個關(guān)關(guān)鍵點：1蛋白質(zhì)質(zhì)的狀態(tài)態(tài)處于去去折疊和和天然構(gòu)構(gòu)象的平平衡中；2 天 然構(gòu)象象的蛋白白質(zhì)處于于熱力學(xué)學(xué)最低的的能量狀狀態(tài)。盡盡管蛋白白質(zhì)的氨氨基酸序序列在蛋蛋白質(zhì)的的正確折折疊中起起著核心心的作用用，各種種各樣的的因素，包包括信號號序列，輔輔助因子子，分子子伴 侶，環(huán)環(huán)境條件件，均會會影響蛋蛋白質(zhì)的的折疊，新新生蛋白白質(zhì)折疊疊并組裝裝成有功功能的蛋蛋白質(zhì)，并并非都是是自發(fā)的的，在多多數(shù)情況況下是需需要其它它蛋白質(zhì)質(zhì)的幫助助，已經(jīng)經(jīng)鑒定了了許多參參與 蛋白質(zhì)質(zhì)折疊的的折疊酶酶和分子子伴侶（3,16,86）， 蛋白質(zhì)“自發(fā)折疊”的經(jīng)典概念發(fā)生了轉(zhuǎn)變和更新

28、，但這并不與折疊的熱力學(xué)假說相矛盾，而是在動力學(xué)上完善了熱力學(xué)觀點。在蛋白質(zhì)的折疊過程中，有許多作用 力參與，包括一些構(gòu)象的空間阻礙，范德華力，氫鍵的相互作用，疏水效應(yīng)，離子相互作用，多肽和周圍溶劑相互作用產(chǎn)生的熵驅(qū)動的折疊（12,52），但對于蛋白質(zhì)獲得天然結(jié)構(gòu)這一復(fù)雜過程的特異性，我們還知之甚少，許多實驗和理論的工作都在加深我們對折疊的認(rèn)識，但是問題仍然沒有解決。在折疊的機機制研究究上早期期的理論論認(rèn)為，折折疊是從從變性狀狀態(tài)通過過中間狀狀態(tài)到天天然狀態(tài)態(tài)的一個個逐步的的過程，并并對折疊疊中間體體進(jìn)行了了深入研研究，認(rèn)認(rèn)為折疊疊是在熱熱力學(xué)驅(qū)驅(qū)動下按按單一的的途徑進(jìn)進(jìn)行的。后后來的研研究表

29、明明折疊過過程存在在實驗可可測的多多種 HYPERLINK /industry/Special/middle/Index.shtml 中間間體，折折疊通過過有限的的路徑進(jìn)進(jìn)行。新新的理論論強調(diào)在在折疊的的初始階階段存在在多樣性性，蛋白白質(zhì)通過過許多的的途徑進(jìn)進(jìn)入折疊疊漏斗（folding funnel），從而折疊在整體上被描述成一個漏斗樣的圖像，折疊的動力學(xué)過程被認(rèn)為是部分折疊的蛋白質(zhì)整體上的進(jìn)行性裝配，并且伴隨有自由能和熵的變化，蛋白質(zhì)最終尋找到自己的正確的折疊結(jié)構(gòu)，這一理論稱為能量圖景（energy landscape），如圖3所示，漏斗下方的凹凸反映蛋白質(zhì)構(gòu)象瞬間進(jìn)入局部自由能最小區(qū)域(

30、13,14)。圖 3：能能量圖景景（Thhe eenerrgy lanndsccapee）的示示意圖，高高度代表表能量尺尺度，寬寬度代表表構(gòu)象尺尺度，在在漏斗（funnel）的下方存在別的低能量狀態(tài)，共存的不同能量狀態(tài)的蛋白質(zhì)種類也降到最小(14)。這一理論認(rèn)認(rèn)為結(jié)構(gòu)構(gòu)同源的的蛋白質(zhì)質(zhì)可以通通過不同同的折疊疊途徑形形成相似似的天然然構(gòu)象，人人酸性成成纖維生生長因子子（hFFGF-1）和和蠑螈酸酸性成纖纖維生長長因子（nFGF-1）氨基酸序列具有約80%同源性，并且具有結(jié)構(gòu)同源性（12個折疊反向平行排列形成折疊桶），在鹽酸胍誘導(dǎo)去折疊的過程中，hFGF-1可以監(jiān)測到具有熔球體樣的折疊 HYPER

31、LINK /industry/Special/middle/Index.shtml 中間體，而nFGF-1經(jīng)由兩態(tài)（天然狀態(tài)到變性狀態(tài)）去折疊，沒有檢測到 HYPERLINK /industry/Special/middle/Index.shtml 中間體的存在，折疊的動力學(xué)研究也表明兩種蛋白采用不同的折疊機制（38）。對于同一蛋白質(zhì)，采用的滲透壓調(diào)節(jié)劑（osmolytes）不同，蛋白質(zhì)折疊的途徑也不相同，說明不同的滲透壓調(diào)節(jié)劑對蛋白質(zhì)的穩(wěn)定效應(yīng)不同（11）。這兩個例子都說明折疊機制的復(fù)雜性，也與上面所介紹的理論相吻合。 2.1.22 包涵涵體的分分離和溶溶解分 離包涵涵體的第第一步是是對細(xì)菌

32、菌進(jìn)行最最大限度度的溶解解，將幾幾種細(xì)胞胞破碎技技術(shù)相結(jié)結(jié)合，如如聯(lián)合使使用溶菌菌酶處理理，高壓壓勻漿細(xì)細(xì)胞破碎碎和含表表面活性性劑的高高鹽溶液液處理，可可以使 膜碎片片和細(xì)胞胞壁碎片片最大限限度的分分解。細(xì)細(xì)胞破碎碎后，通通過離心心的方法法可以很很方便的的回收包包涵體，再再用洗滌滌液（通通常含有有低濃度度的變性性劑，表表面活性性劑，還還原劑，EDTA）對包涵體進(jìn)行清洗，就可以得到較純的包涵體（4，74）。通常要選用強的變性劑使蛋白質(zhì)完全變性溶解，如6 M的鹽酸胍和8 M 的尿素，蛋白質(zhì)濃度多采用1-10mg/ml（22）。由于鹽酸胍溶解包涵體蛋白質(zhì)能力比尿素強，而且尿素中的異氰酸酯可以使自由

33、氨基氨甲?；ㄟ@種作用在堿性條件下表現(xiàn)的更強），所以常常首選鹽酸胍作為解離劑。對含有分子間二硫鍵或非天然二硫鍵的包涵體蛋白質(zhì)，在溶解過程中需要加入還原劑，如二硫蘇糖醇，-巰基乙醇，還原型谷胱甘肽，加入螯和劑，如EDTA，可以防止金屬催化的半胱氨酸氧化。除此之外，改變pH和使用表面活性劑也被用于溶解包涵體蛋白質(zhì)（22），相對而言，這兩種方法的應(yīng)用較少，而且只有具有正確二硫鍵的包涵體蛋白質(zhì)才可以用表面活性劑進(jìn)行溶解，否則可同時形成正確的和非正確的二硫鍵，表明用尿素、鹽酸胍變性和用表面活性劑變性對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和動力學(xué)有不同的影響，Tsumoto在這方面做了詳細(xì)的論述（25）。Pandaa等在高高pH

34、 條件下下使用低低濃度的的尿素溶溶解包涵涵體蛋白白質(zhì)，用用于重組組牛生長長激素、重重組人生生長激素素和獼猴猴透明帶帶糖蛋白白的變復(fù)復(fù)性，認(rèn)認(rèn)為在變變性時蛋蛋白質(zhì)所所保留的的天然二二級結(jié)構(gòu)構(gòu)有助于于蛋白的的折疊，減減少蛋白白質(zhì)的聚聚集。但但采用的的高pHH條件可可以使氨氨基酸殘殘基發(fā)生生化學(xué)修修飾，還還需要更更多的驗驗證（773）。以上變性的的方法屬屬于化學(xué)學(xué)變性，使使用高的的靜力壓壓提供了了蛋白質(zhì)質(zhì)變性的的另外一一種物理理變性方方法，靜靜力壓促促進(jìn)蛋白白質(zhì)變性性解離，是是因為蛋蛋白質(zhì)在在變性條條件下，系系統(tǒng)整體體趨向于于更小的的體積。聯(lián)聯(lián)合使用用高壓和和低濃度度的變性性劑已用用于包涵涵體蛋白白

35、質(zhì)和蛋蛋白質(zhì)聚聚集體的的變性，是是一種有有前景的的變性方方法（331,883)。2.1.33 溶解解后包涵涵體蛋白白質(zhì)的折折疊復(fù)性性蛋白質(zhì)分子子變性后后，通過過改變折折疊的條條件使蛋蛋白質(zhì)恢恢復(fù)其天天然構(gòu)象象的過程程，稱為為復(fù)性。已已經(jīng)發(fā)展展了很多多的方法法用于包包涵體的的折疊復(fù)復(fù)性，但但是這些些方法的的結(jié)果并并不可預(yù)預(yù)測，每每一種方方法都需需要對各各種實驗驗條件，如如變性劑劑濃度、pH、溫度、蛋白質(zhì)濃度、離子強度、添加劑的濃度，進(jìn)行優(yōu)化選擇。通常包涵體在變性溶解后具有高的純度，可以直接進(jìn)行復(fù)性。但由于包涵體還含有其它的細(xì)胞成分，如膜蛋白、磷脂、核酸，可能影響蛋白質(zhì)的復(fù)性（53,54），為了進(jìn)

36、一步提高純度，有些研究工作在包涵體變性后先進(jìn)行蛋白的純化，如親和層析（47,55,57,60,63,64,65, 68）、離子交換層析（47,56）、凝膠過濾層析、反相層析（62），再進(jìn)行變性蛋白質(zhì)的復(fù)性，層析在變性條件下應(yīng)用為這一策略提供了技術(shù)支持。為了控制折折疊、錯錯誤折疊疊和聚集集的速率率，一種種方法是是降低變變性劑的的濃度，降降低的速速度和操操作的時時間都決決定折疊疊的效率率。另一一種方法法就是加加入添加加劑來減減少聚集集，促進(jìn)進(jìn)折疊，如如L-精氨氨酸，鹽鹽，有機機溶劑，一一些表面面活性劑劑，滲透透壓調(diào)節(jié)節(jié)劑（oosmoolyttes），硫硫代甜菜菜堿類物物質(zhì)（NNDSBBs），這這些

37、物質(zhì)質(zhì)或穩(wěn)定定蛋白質(zhì)質(zhì)的天然然構(gòu)象，或或使部分分折疊的的 HYPERLINK /industry/Special/middle/Index.shtml 中間體體不穩(wěn)定定，表22 列出出了這些些化合物物和它們們可能的的作用機機制，它它們在蛋蛋白質(zhì)的的折疊中中起著重重要的作作用，已已得到廣廣泛的應(yīng)應(yīng)用（113,225,332,44,744），但但對于其其中的好好些化合合物參與與折疊的的作用機機制我們們還了解解不多。表 2 增增加蛋白白質(zhì)折疊疊的添加加劑添加劑可能的作用用機制甘油對蛋白質(zhì)具具有優(yōu)先先的水合合作用/增加黏黏度L-精氨酸酸兩親分子/滲壓劑劑甘氨酰甜菜菜堿/山梨糖糖醇對蛋白質(zhì)具具有優(yōu)先先的

38、水合合作用阿拉伯聚糖糖增加黏度木糖醇增加黏度乙醇調(diào)節(jié)極性DMSO調(diào)節(jié)極性兩性離子表表面活性性劑（ZZwittterrionnic detterggentts）保護(hù)非極性性表面Tritoon XX-1000保護(hù)非極性性表面硫代甜菜堿堿類物質(zhì)質(zhì)（NDDSBss）保護(hù)非極性性表面蔗糖/海藻藻糖對蛋白質(zhì)具具有優(yōu)先先的水合合作用/增加黏黏度N-氧化三三甲胺（TMAO）對蛋白質(zhì)具具有優(yōu)先先的水合合作用/滲壓劑劑三氟乙醇（TFE）促進(jìn)二級結(jié)結(jié)構(gòu)的形形成低濃度鹽酸酸胍使部分折疊疊的 HYPERLINK /industry/Special/middle/Index.shtml 中間間體不穩(wěn)穩(wěn)定/增加天天然構(gòu)象象

39、蛋白質(zhì)質(zhì)的溶解解性低濃度尿素素使部分折疊疊的 HYPERLINK /industry/Special/middle/Index.shtml 中間間體不穩(wěn)穩(wěn)定/增加天天然構(gòu)象象蛋白質(zhì)質(zhì)的溶解解性配體穩(wěn)定天然結(jié)結(jié)構(gòu)狀態(tài)態(tài)聚乙二醇保護(hù)熔球體體（moolteen gglobbulee）/增加黏黏度在折疊過程程中另一一個關(guān)鍵鍵的問題題是正確確二硫鍵鍵的形成成，一旦旦形成了了錯誤的的二硫鍵鍵，就不不能再折折疊形成成正確的的結(jié)構(gòu)，所所以在折折疊時不不僅要氧氧化促進(jìn)進(jìn)二硫鍵鍵的形成成，還要要加入還還原劑促促進(jìn)二硫硫鍵改組組（diisullfidde-bbondd reeshuuffllingg），使使蛋白質(zhì)質(zhì)

40、最終折折疊成正正確的結(jié)結(jié)構(gòu)。常常用的方方法有：1 使用用金屬催催化的空空氣氧化化，并添添加還原原劑促進(jìn)進(jìn)二硫鍵鍵改組，由由于氧在在蛋白質(zhì)質(zhì)溶液中中溶解性性低，這這種方法法的效率率較低，改改用攪拌拌促進(jìn)氧氧的質(zhì)量量傳輸，又又會造成成蛋白質(zhì)質(zhì)的聚集集；2 使用小小分子還還原型和和氧化型型的巰基基 HYPERLINK /reagent/ 試劑對，包包括還原原型和氧氧化型的的谷胱甘甘肽（GGSH/GSSSG）、半半胱氨酸酸和胱氨氨酸（ccystteinne/ccysttinee）、半半胱胺和和胱胺（cysteamine/cystamine）、二硫蘇糖醇和氧化型谷胱甘肽（DTT/GSSG），二流赤蘚糖醇

41、和氧化型谷胱甘肽（DTE/GSSG），這一方法是目前常用的方法，通常使用的巰基 HYPERLINK /reagent/ 試劑總濃度為5-15mM，還原劑和氧化劑的比為5:11:1（4,74）。3 在復(fù)性前將巰基保護(hù)起來，有兩種方法可以選擇，一是通過谷胱甘肽和蛋白的半胱氨酸殘基形成二硫鍵來保護(hù)巰基，二是進(jìn)行半胱氨酸磺酸化，從而減少復(fù)性過程中不正確的二硫鍵的形成，復(fù)性后再加入還原劑使形成正確二硫鍵。人組織纖溶酶原激活劑（t-PA）含有35個半胱氨酸殘基，可形成17對二硫鍵，即使在天然狀態(tài)下也只具有低的溶解性，進(jìn)行原核表達(dá)時這兩種巰基保護(hù)方法都被用于該蛋白質(zhì)的折疊復(fù)性，由于在蛋白質(zhì)的巰基上引入了帶電

42、荷的殘基，增加了變性蛋白和部分折疊 HYPERLINK /industry/Special/middle/Index.shtml 中間體的溶解性，減少了復(fù)性過程中蛋白質(zhì)的聚集，可獲得較高的復(fù)性效率（25,32,33）。人絨毛膜促性腺激素亞基（hCG）含有12個半胱氨酸殘基，如果不進(jìn)行巰基保護(hù)，在折疊復(fù)性中會形成寡聚體和大量沉淀，變性蛋白質(zhì)磺酸化后再折疊復(fù)性可形成幾乎100%單體蛋白，同時提高了得率和純度（37）。此外，在前胰島素的折疊復(fù)性中也應(yīng)用了磺酸化保護(hù)（44,47,48），所以這一方法在進(jìn)行復(fù)雜蛋白的變復(fù)性時可以采用。 稀釋復(fù)復(fù)性和透透析復(fù)性性用折疊緩沖沖液快速速稀釋溶溶解的包包涵體蛋蛋

43、白質(zhì)溶溶液，達(dá)達(dá)到降低低變性劑劑濃度的的目的，使使去折疊疊的蛋白白質(zhì)進(jìn)行行再折疊疊，就是是稀釋復(fù)復(fù)性。為為了很快快避開低低溶解性性變性劑劑區(qū)（如如圖2中c區(qū) 段所示示），減減少蛋白白的聚集集，在進(jìn)進(jìn)行稀釋釋時一定定要快速速。折疊疊進(jìn)行時時的蛋白白質(zhì)濃度度是體外外折疊成成功的關(guān)關(guān)鍵，理理想的情情況是希希望折疊疊在高濃濃度的條條件下進(jìn)進(jìn)行，但但是在高高 濃度的的條件下下變性劑劑的稀釋釋常常造造成去折折疊和部部分折疊疊蛋白質(zhì)質(zhì)的聚集集。對于于折疊，是是一個一一級的反反應(yīng)過程程，而聚聚集是一一個高級級的反應(yīng)應(yīng)過程，依依賴蛋白白質(zhì)的濃濃度，所所以 需要小小心的選選擇蛋白白質(zhì)的濃濃度，一一般的蛋蛋白質(zhì)的的

44、終濃度度保持在在20-50g/mmL。透析的方法法不顯著著的改變變?nèi)芤旱牡捏w積，但但時間較較長，而而且易形形成蛋白白質(zhì)沉淀淀，所以以透析起起始的蛋蛋白質(zhì)濃濃度非常常關(guān)鍵，而而且僅對對一些蛋蛋白質(zhì)有有效。變變性劑濃濃度的降降低也可可以分階階段的進(jìn)進(jìn)行，或或先經(jīng)過過稀釋，再再透析去去除剩余余的變性性劑，由由于變性性劑的濃濃度在開開始時先先降到一一定的水水平，增增加了部部分折疊疊 HYPERLINK /industry/Special/middle/Index.shtml 中間體體的溶解解性，常常?？梢砸蕴岣哒壅郫B的效效率，但但是必須須通過實實驗選擇擇在不同同階段使使用的變變性劑濃濃度，避避開圖22

45、 所示示的c區(qū)段。除除了要考考慮降低低變性劑劑的濃度度，還要要考慮每每一階段段的氧化化還原狀狀態(tài)，以以及溫度度、添加加劑等因因素。在胰凝乳蛋蛋白酶原原的折疊疊復(fù)性中中，如果果鹽酸胍胍稀釋的的濃度低低于0.5 MM或高于于3 MM都會造造成大量量的沉淀淀，在22.5 M濃度度時有一一半的蛋蛋白質(zhì)沒沒有正確確折疊，而而在1 M時則則完全折折疊，說說明折疊疊時的變變性劑并并不是越越低越好好，而是是存在一一個最佳佳濃度（13）。Tsumoto等通過分階段透析進(jìn)行了單鏈 HYPERLINK /antibody/ 抗體Fv段包涵體的折疊復(fù)性，在1M鹽酸胍透析時加入氧化型谷胱甘肽和L-精氨酸可以使正確折疊蛋

46、白的得率達(dá)到95% 以上（40），進(jìn)一步研究表明在1M鹽酸胍條件下蛋白質(zhì)所具有的結(jié)構(gòu)使得自由巰基容易形成正確的二硫鍵，加入氧化型谷胱甘肽的作用是加速了蛋白質(zhì)的正確折疊、抑制蛋白質(zhì)的聚集，而L-精氨酸起的作用是穩(wěn)定部分折疊的 HYPERLINK /industry/Special/middle/Index.shtml 中間體使其不發(fā)生聚集，所以同時加入氧化型谷胱甘肽和L-精氨酸可以將蛋白質(zhì)的聚集降到最低的程度（41）。這個研究小組用相同的方法進(jìn)行白介素-12包涵體的折疊復(fù)性，僅加入氧化型谷胱甘肽而沒有還原型谷胱甘肽只有約57%的折疊效率，當(dāng)兩者同時加入后則可達(dá)到90%（42），這些結(jié)果表明前一種

47、蛋白比較容易形成正確的二硫鍵，而白介素-12折疊復(fù)性需要加入還原型的谷胱甘肽促進(jìn)二硫鍵重組，使蛋白質(zhì)最終選擇天然的二硫鍵，并促進(jìn)折疊。另一種策略略是將變變性蛋白白分成幾幾份按一一定的時時間間隔隔逐步加加入折疊疊緩沖液液中，可可以減少少處理的的體積、改改善折疊疊的效率率（355）。Arroraa等將這這一方法法用于人人干擾素素的復(fù)性性，當(dāng)添添加0.5M的的L-精氨氨酸可以以使產(chǎn)率率提高十十倍，產(chǎn)產(chǎn)品的得得率和比比活比文文獻(xiàn)報道道的都要要高（772）。在 已經(jīng)發(fā)發(fā)展的復(fù)復(fù)性方法法中，稀稀釋復(fù)性性仍然是是應(yīng)用最最多的方方法，但但在放大大時會因因為處理理體積太太大造成成成本太太高。溶溶解復(fù)性性獲得的的

48、蛋白質(zhì)質(zhì)，需要要通過離離心和過過濾的方方法去除除 不溶性性的物質(zhì)質(zhì)，再按按可溶性性蛋白質(zhì)質(zhì)的處理理方法進(jìn)進(jìn)行下游游的分離離純化。擴擴張床吸吸附技術(shù)術(shù)可以處處理大量量的樣品品，而且且分離的的效能不不受聚集集蛋白質(zhì)質(zhì)的影響響，F(xiàn)eerree等將蛋蛋白質(zhì)的的稀釋折折疊和擴擴張床吸吸附捕獲獲技術(shù)相相偶聯(lián)，使使用STTREAAMLIINETTM DDEAEE陰離子子交換介介質(zhì)，用用于包涵涵體蛋白白質(zhì)HAAT-hh2m的分離離純化，可可以得到到48%回收率率和944%純度度的復(fù)性性蛋白（23）。2.1.3.22 色譜譜復(fù)性色 譜方法法不僅在在蛋白質(zhì)質(zhì)的純化化中得到到廣泛應(yīng)應(yīng)用，也也成為包包涵體蛋蛋白質(zhì)復(fù)復(fù)

49、性的主主要手段段之一。色色譜復(fù)性性的方法法的優(yōu)點點是可以以顯著的的減少處處理的時時間，減減少變復(fù)復(fù)性過程程中分 子的聚聚集，使使復(fù)性的的同時也也達(dá)到了了純化的的效果。第第一類型型的色譜譜復(fù)性就就是凝膠膠過濾色色譜復(fù)性性，這一一方法的的原理在在于通過過分子篩篩效應(yīng)可可將蛋白白質(zhì)和小小分子的的變性劑劑分 離，實實現(xiàn)溶液液交換和和蛋白質(zhì)質(zhì)的折疊疊。復(fù)性性折疊中中存在的的一個問問題就是是蛋白質(zhì)質(zhì)的聚集集，為了了減少導(dǎo)導(dǎo)致蛋白白質(zhì)聚集集的分子子間相互互作用，可可將蛋白白質(zhì)結(jié)合合在分離離介質(zhì)上上，達(dá) 到溶液液中變性性劑濃度度的稀釋釋和蛋白白質(zhì)的折折疊，這這一類型型的復(fù)性性為吸附附型色譜譜復(fù)性，包包括親和和

50、色譜復(fù)復(fù)性，疏疏水相互互作用色色譜復(fù)性性，離子子交換色色譜復(fù)性性。對于于一些稀稀釋法 難于折折疊的蛋蛋白質(zhì)，這這一方法法具有更更好的效效果，如如一些膜膜蛋白（24,50,71）。在折疊中，吸附的位點會影響到折疊，所以要優(yōu)化折疊的條件，才能得到好的折疊效果。另一種方法是在介質(zhì)上固定化伴侶分子或折疊酶，使層析柱成為一個折疊反應(yīng)器，固定化的優(yōu)點是能夠回收使用，不會引入新的雜蛋白。A. 凝膠膠過濾色色譜復(fù)性性凝膠過濾復(fù)復(fù)性時，變變性蛋白白質(zhì)加樣樣于折疊疊緩沖液液平衡好好的凝膠膠過濾柱柱上，然然后用折折疊緩沖沖液進(jìn)行行洗脫，凝凝膠過濾濾層析有有不同的的分子量量分級范范圍，有有助于聚聚集蛋白白質(zhì)和正正確折

51、疊疊蛋白質(zhì)質(zhì)的分離離。血小小板衍生生的生長長因子（PDGF）由兩個亞基組成，Mller等用雙順反子表達(dá)載體同時表達(dá)等摩爾的A鏈和B鏈，但以包涵體的形式存在，為了得到活性的異源二聚體PDGF-AB，包涵體用鹽酸胍變性后，先在變性條件下用凝膠過濾層析進(jìn)行純化，使用稀釋復(fù)性，蛋白質(zhì)嚴(yán)重聚集，即使在10g/ml蛋白質(zhì)濃度條件下，也只能得到45%可溶性蛋白，而用凝膠過濾復(fù)性，同時洗脫的A亞基和B亞基可以緩慢二聚化產(chǎn)生異源二聚體，蛋白質(zhì)以2.5mg/ml濃度上樣,最終異源二聚體得率可達(dá)75%（26）。在 凝膠過過濾復(fù)性性中，發(fā)發(fā)展了一一種梯度度復(fù)性的的方法，這這一方法法的原理理基于復(fù)復(fù)性過程程中，變變性條

52、件件的快速速改變加加速了部部分折疊疊蛋白質(zhì)質(zhì)的聚集集，導(dǎo)致致沉淀形形成和非非特異性性的吸 附，通通過梯度度洗脫逐逐步降低低變性劑劑的濃度度，使蛋蛋白質(zhì)處處于一個個梯度改改變的變變性劑條條件下，控控制蛋白白質(zhì)的折折疊和聚聚集速度度，使蛋蛋白質(zhì)在在離開層層析柱時時，處于于折疊緩緩沖液 中，從從而改善善活性蛋蛋白的回回收率。通通常選擇擇線性的的梯度用用于折疊疊復(fù)性，對對于不同同的蛋白白質(zhì)還有有其它的的模式，如如一些蛋蛋白在特特定的變變性劑濃濃度范圍圍里不穩(wěn)穩(wěn)定，在在此變性性 劑濃度度范圍里里就需要要快速降降低變性性劑濃度度。這一一復(fù)性過過程中，梯梯度在上上樣前就就在層析析柱中已已經(jīng)形成成，上樣樣后使

53、用用變性緩緩沖液進(jìn)進(jìn)行洗脫脫，由于于蛋白質(zhì)質(zhì)受到的的分子排排阻比 變性劑劑大，蛋蛋白質(zhì)移移動的速速度比變變性劑梯梯度移動動的速度度快，最最終蛋白白質(zhì)通過過整個變變性劑區(qū)區(qū)，離開開層析柱柱時處于于折疊緩緩沖液中中。通過過尿素線線性梯度度復(fù)性，變變性溶菌菌酶以 高蛋白白濃度上上樣（117mgg/mll）可以以獲得990%的的活性回回收率，與與稀釋復(fù)復(fù)性和非非梯度凝凝膠過濾濾復(fù)性相相比較，顯顯著的改改善了活活性回收收率（227）。對對單鏈FFv片段段包涵體體蛋白，使使用梯度度同時改改變變性性劑濃度度和pHH，比單單改變變變性劑濃濃度的梯梯度復(fù)性性或不使使用梯度度的凝膠膠過濾復(fù)復(fù)性具有有更高的的活性得

54、得率（228）。另另外應(yīng)用用連續(xù)環(huán)環(huán)形色譜譜，蛋白白樣品連連續(xù)上樣樣于旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)的色譜譜柱上，在在提高折折疊效率率的同時時，也提提高了色色譜復(fù)性性處理的的能力（29,30）。B. 吸附附型色譜譜復(fù)性吸 附型色色譜復(fù)性性是在變變性條件件下，利利用變性性蛋白質(zhì)質(zhì)可瞬間間結(jié)合在在特定層層析介質(zhì)質(zhì)上的特特性，進(jìn)進(jìn)行緩沖沖液的交交換，降降低變性性劑的濃濃度，可可先改變變變性劑劑濃度使使吸附的的蛋白質(zhì)質(zhì) 逐漸的的折疊復(fù)復(fù)性，在在柱中的的變性劑劑溶液完完全被置置換成折折疊緩沖沖液后，再再通過在在折疊緩緩沖液中中加入鹽鹽或其它它添加劑劑進(jìn)行原原位純化化洗脫，為為了獲得得好的折折疊效率率和純化化效 率，常常采用梯梯

55、度洗脫脫或階段段洗脫的的方法。由由于蛋白白質(zhì)結(jié)合合在固相相介質(zhì)上上，減少少了折疊疊過程中中由于分分子間相相互作用用所造成成的聚集集，所以以這一方方法可提提高折疊疊的效率率。在 變性條條件下，蛋蛋白質(zhì)能能否進(jìn)行行離子交交換色譜譜復(fù)性和和疏水色色譜復(fù)性性，與蛋蛋白質(zhì)的的理化性性質(zhì)密切切相關(guān)，僅僅有有限限的報道道（366），而而給蛋白白質(zhì)加上上一個親親和標(biāo)簽簽，表達(dá)達(dá)得到的的包涵體體再用親親和色譜譜復(fù)性對對不同的的蛋白質(zhì)質(zhì)有一定定的通用用性，應(yīng)應(yīng)用也更更為廣泛泛，尤其其是金屬屬螯合親親和色譜譜復(fù)性。多肽通過在在N端或C端加上上一個親親和標(biāo)簽簽，在包包涵體的的純化上上有兩個個方面的的用途，其其一是包包

56、涵體變變性溶解解后，利利用親和和色譜直直接進(jìn)行行包涵體體溶液的的純化，再再用稀釋釋或透析析的方法法進(jìn)行復(fù)復(fù)性(555,557,660,664,665,668)，其其二就是是用于親親和色譜譜復(fù)性(61,66,67,69,70)。由于于蛋白質(zhì)質(zhì)或肽類類標(biāo)簽在在變性條條件大多多失去了了與親和和介質(zhì)結(jié)結(jié)合的特特性，目目前這一一技術(shù)用用的最多多的是組組氨酸標(biāo)標(biāo)簽。ZZahnn等在鎳鎳親和層層析柱（Ni-NTA argrose）上通過鹽酸胍/谷胱甘肽梯度進(jìn)行帶有組氨酸標(biāo)簽的人朊病毒蛋白多肽片段的氧化再折疊，抑制了蛋白質(zhì)聚集和分子間二硫鍵的形成，再用咪唑緩沖液對目標(biāo)蛋白進(jìn)行洗脫，純化的流程圖如圖4所示(20

57、)。Stempfer等在-葡萄糖苷酶的N端或C端加上多聚精氨酸標(biāo)簽，研究了變性蛋白在肝素親和介質(zhì)上的折疊復(fù)性，通過優(yōu)化實驗條件，蛋白質(zhì)可以在5mg/ml濃度條件下高效復(fù)性(59)。圖4：利用用金屬螯螯合色譜譜復(fù)性純純化人朊朊病毒蛋蛋白多肽肽片段的的流程圖圖除了以上的的應(yīng)用，更更令人鼓鼓舞的是是這一技技術(shù)已成成功用于于膜蛋白白的復(fù)性性（244,500,711）。酮酮戊二酸酸載體蛋蛋白是線線粒體內(nèi)內(nèi)膜上的的一種轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)運蛋白白，Smmithh先采用用E.ccolii C441（DE33）作為為宿主菌菌使C端帶有有組氨酸酸標(biāo)簽的的目標(biāo)蛋蛋白形成成包涵體體獲得大大量表達(dá)達(dá)，再用用鎳柱親親和色譜譜進(jìn)行復(fù)復(fù)性

58、和純純化，獲獲得的融融合蛋白白具有和和天然蛋蛋白一樣樣的轉(zhuǎn)運運活性，每每升的細(xì)細(xì)菌培養(yǎng)養(yǎng)液可獲獲得155mg的的活性蛋蛋白（550）。C. 由固固定化伴伴侶分子子和/或折疊疊酶介導(dǎo)導(dǎo)的色譜譜復(fù)性分子伴侶和和折疊酶酶在蛋白白質(zhì)的正正確折疊疊中起著著重要的的作用，是是近年來來的一個個研究熱熱點，它它們和蛋蛋白質(zhì)在在體內(nèi)共共表達(dá)已已經(jīng)成為為促進(jìn)蛋蛋白質(zhì)可可溶性表表達(dá)的重重要方法法。分子子伴侶和和折疊酶酶在體外外有兩個個方面的的應(yīng)用，其其一是在在溶液中中加入伴伴侶分子子和/或折疊疊酶促進(jìn)進(jìn)包涵體體蛋白質(zhì)質(zhì)的折疊疊和裝配配（399），另另一方面面就是通通過固定定化的伴伴侶分子子和/或折疊疊酶來介介導(dǎo)蛋白

59、白質(zhì)的折折疊復(fù)性性。Alltammiraano等等通過固固定化伴伴侶分子子GrooEL的的活性小小片段、脯脯胺酰異異構(gòu)酶和和大腸桿桿菌氧化化還原酶酶DsbbA將蝎蝎子毒素素蛋白CCn5的的折疊得得率從55%提高高到877%（18）。在在單鏈 HYPERLINK /antibody/ 抗抗體Fvv段的透透析復(fù)性性中，加加入固定定化的氧氧化還原原酶DsbAA和DsbbC可以以顯著提提高折疊疊的效率率，得到到的單鏈鏈 HYPERLINK /antibody/ 抗體Fvv段和天天然 HYPERLINK /antibody/ 抗體體Fv段具具有相同同的功能能（466）。 其它的的復(fù)性方方法近年，還有有一

60、些其其它的方方法用于于蛋白質(zhì)質(zhì)的折疊疊復(fù)性，如如雙水相相萃取復(fù)復(fù)性（776,777,778,779），反反向膠束束復(fù)性（33,75,80），高靜力壓復(fù)性（31,81,82,83），這些方法對特定的蛋白質(zhì)可獲得高的復(fù)性效率，大多還停留在研究階段，相信隨著方法的成熟和普及，將會為包涵體蛋白質(zhì)的折疊復(fù)性提供更多的選擇手段。2.2可溶溶重組分分子的分分離純化化重 組蛋白白在大腸腸桿菌中中得到表表達(dá)以后后，首先先必須從從細(xì)菌釋釋放才能能進(jìn)行下下游的分分離純化化過程。蛋蛋白質(zhì)釋釋放的方方法依賴賴于蛋白白質(zhì)最終終在細(xì)胞胞中的定定位。大大部分的的可溶性性重組 蛋白在在細(xì)胞質(zhì)質(zhì)中表達(dá)達(dá)，而一一些膜蛋蛋白常常常表