普通微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)之二微生物染色技術(shù)2012課件

1、實(shí)驗(yàn)二微生物染色技術(shù)普通微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)普通微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)主講：鄭海濤一、目的和要求1、掌握細(xì)菌涂片和染色的基本技術(shù)2、了解革蘭氏染色的機(jī)理、掌握革蘭氏染 色的方法3、掌握細(xì)菌芽孢的染色方法4、掌握無菌操作技術(shù)5、學(xué)會使用普通生物顯微鏡 二、實(shí)驗(yàn)原理1、細(xì)菌細(xì)胞微小且無色透明，在普通光學(xué)顯微鏡下不易識別，必須借助染色劑使菌體著色，增加與背景的反差，才能在顯微鏡下觀察菌體的個體形態(tài)和部分結(jié)構(gòu)。 因此，微生物染色是微生物學(xué)中的一項(xiàng)基本技術(shù)。染料能使細(xì)菌著色，并且因細(xì)菌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和化學(xué)成分不同，而會有不同的染色反應(yīng)。在一般情況下細(xì)菌菌體多帶負(fù)電荷，所以常用堿性染料進(jìn)行染色。堿性染料并不是堿，和其它染料一樣

2、是一種鹽，電離后染料離子帶正電，易與帶負(fù)電的細(xì)菌結(jié)合而使細(xì)菌著色。生物染色常用的堿性染料有結(jié)晶紫、美藍(lán)、石炭酸復(fù)紅、番紅等。 （1）簡單染色實(shí)驗(yàn)原理2、簡單染色法：是只用一種染色劑對細(xì)胞進(jìn)行染色。此法操作簡便，適用于菌體的一般形態(tài)觀察，但通常不能顯示細(xì)胞構(gòu)造，也不能鑒別細(xì)菌類別。染色前必須將菌體涂布于載玻片上并進(jìn)行固定，其目的是殺死細(xì)菌，并使菌體粘附在載玻片上，防止菌體被染色劑沖掉。此外還可增加菌體對染料的親和力。（2）革蘭氏染色實(shí)驗(yàn)原理 3、革蘭氏染色法(Gram stdn)是丹麥醫(yī)生Gram于1884年創(chuàng)立的。通過這一染色，可把幾乎所有細(xì)菌分成革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌(簡寫為G+、G-)

3、兩大類。因此它是細(xì)菌分類鑒定時(shí)的重要指標(biāo)。又由于這兩大類細(xì)菌在細(xì)胞結(jié)構(gòu)、成分、生理、生化、遺傳、免疫、生態(tài)及藥物敏感性方面都呈現(xiàn)出明顯的差異，因此任何細(xì)菌只要先通過簡單的革蘭氏染色，即可提供不少其它重要的生物學(xué)特征方面的信息。 （3）芽孢染色原理 4、芽孢壁比營養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)復(fù)雜而且致密，透性低，著色和脫色較營養(yǎng)細(xì)胞難。采用堿性染料并在微火上加熱，或延長染色時(shí)間，使菌體和芽孢同時(shí)染色后，用蒸餾水沖洗，脫去菌體顏色，保留芽孢的顏色。并用另一種對比鮮明的染料使菌體著色。三、實(shí)驗(yàn)材料及儀器 (一)菌種 枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) 大腸埃希氏菌(Escherichia co

4、li) 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(二)試劑 革蘭氏染色液、（草酸銨結(jié)晶紫染色液、路哥氏碘液、95乙醇、番紅染色液）、孔雀石綠染液。(三)其它 顯微鏡，載玻片，接種環(huán)，酒精燈，香柏油，二甲苯，擦鏡紙等。(二)染色1、革蘭氏染色(1)初染：在涂片菌膜處滴加草酸銨結(jié)晶紫染液，染色約11.5min，然后用細(xì)小的水流從標(biāo)本上端沖凈殘余染液(注意勿使水流直接沖洗涂菌處)，至流下的水無色為止。(2)媒染：滴加路哥氏碘液覆蓋菌膜，媒染約11.5min，然后用流水沖洗掉多余的碘液。用吸水紙吸干載片上的水分。(3)脫色：傾斜玻片并襯以白色背景，流滴95乙醇沖洗涂片，同時(shí)輕輕搖動

5、載片使乙醇分布均勻，至流出的乙醇剛剛不出現(xiàn)紫色時(shí)即停止脫色(或靜止30-40秒)，并立即用水沖凈乙醇。 (4)復(fù)染：滴加番紅染液，染色3min，水洗后用濾紙吸干水分。(5)待干燥后油鏡觀察革蘭氏染色法1.涂片固定2.單染結(jié)晶紫染液第一次染色 1-1.5min 3.媒染碘-碘化鉀溶液浸濕1min4. 脫色95%乙醇溶液進(jìn)行顏色洗脫30-40S5.復(fù)染番紅染液第二次染色1.5min2、芽孢染色(1)用培養(yǎng)24h左右的斜面菌種作涂片、干燥、固定、加濾紙(2)滴加35滴孔雀石綠染液于固定好的涂片上至濾紙飽和。(3)用試管夾夾住載玻片，在火焰上方徐徐加熱，保持染液冒蒸汽而不沸騰，切勿使染液蒸干，必要時(shí)應(yīng)

6、添加少許染液。從染液蒸汽開始計(jì)時(shí)，加熱45min。 (4)傾去染液，待玻片冷卻后水洗至孔雀綠不再退色為止(5)用番紅水溶液復(fù)染3min，水洗。 (6)待干燥后，置油鏡下觀察，芽孢呈綠色，菌體呈紅色芽孢染色（二）、光學(xué)生物顯微鏡的使用一、目的和要求 由于微生物的個體小，必須借助于顯微鏡將其放大才能看清楚它們的形態(tài)，所以顯微鏡的使用是微生物學(xué)的基本操作，必須認(rèn)真掌握。1了解普通生物顯微鏡的構(gòu)造和性能 2正確掌握顯微鏡的使用技術(shù)和保養(yǎng)方法二、實(shí)驗(yàn)材料及儀器 (一)標(biāo)本片 自己制作的細(xì)菌涂片(二)儀器和藥品 普通光學(xué)生物顯微鏡、鏡頭紙、香柏油、二甲苯等三、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 顯微鏡的構(gòu)造 普通光學(xué)生物顯微鏡由機(jī)械系統(tǒng)和光學(xué)系統(tǒng)組成。 接目鏡鏡筒物鏡轉(zhuǎn)換器接物鏡載物臺聚光器鏡臂粗調(diào)螺旋細(xì)調(diào)螺旋鏡座光源電源開關(guān)光源調(diào)節(jié)器玻片推進(jìn)器慮光片虹彩光圈四、顯微鏡的保養(yǎng) 顯微鏡是精密貴重的儀器，須很好地保養(yǎng)。使用時(shí)應(yīng)注意下列事項(xiàng)。(1)顯微鏡不能隨便拆卸，各透鏡應(yīng)用鏡頭紙擦拭不得以手沾抹或用其它紙、布等擦拭，以免破壞鏡頭，沾上手印。(2)勿將顯微鏡與酸、堿及揮發(fā)性藥品放在一起。 (3)避免陽光暴曬，以免在高溫下柏膠溶解或變形，使透鏡脫落。 (4)顯微鏡應(yīng)存放在干燥地點(diǎn)，雨季應(yīng)在箱內(nèi)放置硅膠以吸收水分。五、作業(yè)1、按照顯微鏡的使用方法，觀察自己制作的細(xì)菌染色涂片。2、