免疫組織(細胞)化學(xué)培訓(xùn)課件

1、免疫組織（細胞）化學(xué)免疫組織（細胞）化學(xué)內(nèi) 容免疫組化免疫熒光顯微鏡的使用免疫組織（細胞）化學(xué)2免疫組織（細胞）化學(xué)內(nèi) 容免疫組化免疫組織（細胞）化學(xué)2免疫組織（細胞）化用標(biāo)記的特異性抗體對組織切片或細胞標(biāo)本中某些化學(xué)成分的分布和含量進行組織和細胞原位定性、定位或定量研究的技術(shù)稱為免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry，IHC）技術(shù)或免疫細胞化學(xué)（immunocytochemistry，ICC）技術(shù)。 概 念I(lǐng)HCICC3免疫組織（細胞）化學(xué)用標(biāo)記的特異性抗體對組織切片或細胞標(biāo)本中某些化學(xué)成分的分布和原 理根據(jù)抗原抗體反應(yīng)和化學(xué)顯色原理最后通過呈色反應(yīng)或熒光來顯示細胞或組織中化

2、學(xué)成分，在光學(xué)顯微鏡或熒光顯微鏡下可清晰看見細胞內(nèi)發(fā)生的抗原抗體反應(yīng)產(chǎn)物，從而能夠在細胞爬片或組織切片上原位確定某些化學(xué)成分的分布和含量 酶或熒光基團4免疫組織（細胞）化學(xué)原 理根據(jù)抗原抗體反應(yīng)和化學(xué)顯色原理酶或熒光基團4免疫組織分 類按標(biāo)記物質(zhì)的種類免疫熒光法：熒光染料放射免疫法：放射性同位素免疫酶標(biāo)法：HRP（辣根過氧化物酶）免疫金銀法：膠體金按結(jié)合方式抗原-抗體結(jié)合，如過氧化物酶-抗過氧化物酶（PAP）法；親和連接，如親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物（ABC）法、鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)（SP）法；聚合物鏈接，如即用型二步法，此方法尤其適合于內(nèi)源性生物素含量高的組織抗原檢測。

3、5免疫組織（細胞）化學(xué)分 類按標(biāo)記物質(zhì)的種類5免疫組織（細胞）化學(xué)內(nèi) 容免疫組化*免疫熒光顯微鏡的使用6免疫組織（細胞）化學(xué)內(nèi) 容免疫組化*6免疫組織（細胞）化學(xué)實 驗 步 驟石蠟切片脫蠟、水化 冰凍切片 ddH2O或PBS洗抗原修復(fù) 3%H2O2孵育10 min去除內(nèi)源性過氧化物酶即用型二步法 ABC放大法 血清封閉（試劑A）室溫2 h孵育一抗 孵一抗 孵二抗試劑137度20分鐘孵生物素偶聯(lián)二抗（試劑B）室溫2 h孵二抗試劑237度30分鐘孵ABC液（試劑C）37度40分鐘DAB顯色 復(fù)染 封片脫水、透明37度烤片二甲苯梯度酒精梯度酒精二甲苯預(yù)處理7免疫組織（細胞）化學(xué)實 驗 步 驟石蠟切片

4、脫蠟、水化 冰凍切片 ddH2O或P石蠟切片：組織切片在60恒溫箱中烘烤6-8h，浸二甲苯前應(yīng)在60烤0.5-1h。脫蠟：組織切片置于二甲苯中浸泡15分鐘,更換二甲苯后再浸泡15分鐘水化：分別過無水乙醇，95%乙醇，80%乙醇，70%乙醇，自來水，雙蒸水冰凍切片：將切片放在37烘烤1h，然后置于組化PBS或蒸餾水中浸泡預(yù)處理8免疫組織（細胞）化學(xué)石蠟切片：組織切片在60恒溫箱中烘烤6-8h，浸二甲苯前應(yīng)實 驗 步 驟石蠟切片脫蠟、水化 冰凍切片 ddH2O或PBS洗抗原修復(fù) 3%H2O2孵育10 min去除內(nèi)源性過氧化物酶即用型二步法 ABC放大法 血清封閉（試劑A）室溫2 h孵育一抗 孵一抗

5、 孵二抗試劑137度20分鐘孵生物素偶聯(lián)二抗（試劑B）室溫2 h孵二抗試劑237度30分鐘孵ABC液（試劑C）37度40分鐘DAB顯色 復(fù)染 封片脫水、透明37度烤片二甲苯梯度酒精梯度酒精二甲苯預(yù)處理9免疫組織（細胞）化學(xué)實 驗 步 驟石蠟切片脫蠟、水化 冰凍切片 ddH2O或P抗 原 修 復(fù)抗原修復(fù)(Antigen Retrieval，AR)是以高溫、高壓對常規(guī)固定的石蠟切片進行抗原修復(fù)或復(fù)原的一種非蛋白酶消化，以提高抗原抗體陽性檢測的一種方法和技術(shù)手段。修復(fù)介質(zhì)： 0.01M pH6.0檸檬酸鹽緩沖液(CB)；EDTA pH9.0。修復(fù)方式：微波9610min2；直接加溫100，15min

6、；水浴鍋100，10/20min；高壓鍋/消毒鍋120，3min；真空加熱10min；直接烤片法。10免疫組織（細胞）化學(xué)抗 原 修 復(fù)抗原修復(fù)(Antigen Retrieval，熱處理后應(yīng)注意自然冷卻（至少半小時）；熱處理液不要讓其煮干；不要任何抗原的檢測都使用該方法；同一批抗原的檢測其溫度和時間一定保持一致?？?原 修 復(fù)11免疫組織（細胞）化學(xué)熱處理后應(yīng)注意自然冷卻（至少半小時）；抗 原 修 復(fù)11免疫實 驗 步 驟石蠟切片脫蠟、水化 冰凍切片 ddH2O或PBS洗抗原修復(fù) 3%H2O2孵育10 min去除內(nèi)源性過氧化物酶即用型二步法 ABC放大法 血清封閉（試劑A）室溫2 h孵育一抗

7、 孵一抗 孵二抗試劑137度20分鐘孵生物素偶聯(lián)二抗（試劑B）室溫2 h孵二抗試劑237度30分鐘孵ABC液（試劑C）37度40分鐘DAB顯色 復(fù)染 封片脫水、透明37度烤片二甲苯梯度酒精梯度酒精二甲苯預(yù)處理12免疫組織（細胞）化學(xué)實 驗 步 驟石蠟切片脫蠟、水化 冰凍切片 ddH2O或P去除內(nèi)源性過氧化物酶尤其在含有豐富血細胞的標(biāo)本中，由于其中含有大量的具有活性的過氧化物酶，能與過氧化氫反應(yīng)，出現(xiàn)氣泡現(xiàn)象，易對組織結(jié)構(gòu)和細胞形態(tài)產(chǎn)生一些不良影響。用3%過氧化氫的方法，能夠去除大部分內(nèi)源性酶，即使有些血細胞在顯色后也出現(xiàn)棕黃色反應(yīng)，但由于其形態(tài)結(jié)構(gòu)與組織細胞不同，也易鑒別。注意過氧化氫的濃度不

8、能過高，一般為3%-5%，時間不宜過長，10-40 min。13免疫組織（細胞）化學(xué)去除內(nèi)源性過氧化物酶尤其在含有豐富血細胞的標(biāo)本中，由于其中實 驗 步 驟石蠟切片脫蠟、水化 冰凍切片 ddH2O或PBS洗抗原修復(fù) 3%H2O2孵育10 min去除內(nèi)源性過氧化物酶即用型二步法 ABC放大法 血清封閉（試劑A）室溫2 h孵育一抗 孵一抗 孵二抗試劑137度20分鐘孵生物素偶聯(lián)二抗（試劑B）室溫2 h孵二抗試劑237度30分鐘孵ABC液（試劑C）37度40分鐘DAB顯色 復(fù)染 封片脫水、透明37度烤片二甲苯梯度酒精梯度酒精二甲苯預(yù)處理14免疫組織（細胞）化學(xué)實 驗 步 驟石蠟切片脫蠟、水化 冰凍切

9、片 ddH2O或P血清封閉驢血清 10%BSA 3%triton-100 0.1%tween-20 0.05%PBS 組織中非抗原抗體反應(yīng)出現(xiàn)的陽性染色稱為非特異性背景染色，最常見的原因是蛋白吸附于高電荷的膠元和結(jié)締組織成分上。最有效方法是在用第一抗體前加制備第二抗體動物的非免疫血清(1:51:20) 封閉組織上帶電荷基團而除去與第一抗體非特異性結(jié)合。必要時可加入2%5%牛血清蛋白，可進一步減少非特異性染色。作用時間為室溫2 h，或根據(jù)說明書。封閉前 封閉后15免疫組織（細胞）化學(xué)血清封閉驢血清 10%組織中非抗原抗體反應(yīng)出現(xiàn)的實 驗 步 驟石蠟切片脫蠟、水化 冰凍切片 ddH2O或PBS洗抗

10、原修復(fù) 3%H2O2孵育10 min去除內(nèi)源性過氧化物酶即用型二步法 ABC放大法 血清封閉（試劑A）室溫2 h孵育一抗 孵一抗 孵二抗試劑137度20分鐘孵生物素偶聯(lián)二抗（試劑B）室溫2 h孵二抗試劑237度30分鐘孵ABC液（試劑C）37度40分鐘DAB顯色 復(fù)染 封片脫水、透明37度烤片二甲苯梯度酒精梯度酒精二甲苯預(yù)處理16免疫組織（細胞）化學(xué)實 驗 步 驟石蠟切片脫蠟、水化 冰凍切片 ddH2O或P一 抗首先應(yīng)選擇一家好的生產(chǎn)公司，根據(jù)文獻提供的信息，選擇所需試劑的型號購置抗體的注意事項種屬：單克隆抗體，多克隆抗體能否用于石蠟切片稀釋度特異性，交叉反應(yīng)用何種組織前處理形式（如抗原修復(fù)形

11、式等）包裝單位，價格17免疫組織（細胞）化學(xué)一 抗首先應(yīng)選擇一家好的生產(chǎn)公司，根據(jù)文獻提供的信息，孵育濃度：首先不同的稀釋度摸條件，如150、1100、1200等。選擇合適的稀釋度完成后續(xù)實驗。（選擇表達較高的組織進行此步實驗）孵育時間：可先選擇短時間如2 h，若結(jié)果不理想，則適當(dāng)延長時間。但確定后不要更改。孵育溫度：室溫為宜（25 左右），如過夜則置于4孵育，加二抗前復(fù)溫至少0.5 h。37孵育可能會使染色過強，或產(chǎn)生非特異性著色。一 抗18免疫組織（細胞）化學(xué)孵育濃度：首先不同的稀釋度摸條件，如150、1100、1對 照陽性對照一般是用肯定表達這種抗原的切片來做。用于排除方法和實驗系統(tǒng)有無

12、問題；陰性對照一般是用PBS替代一抗來進行反應(yīng)，其余步驟均一致。用于排除有無一抗外的非特異性染色。 19免疫組織（細胞）化學(xué)對 照陽性對照一般是用肯定表達這種抗原的切片來做。用于排除實 驗 步 驟石蠟切片脫蠟、水化 冰凍切片 ddH2O或PBS洗抗原修復(fù) 3%H2O2孵育10 min去除內(nèi)源性過氧化物酶即用型二步法 放大法 血清封閉（試劑A）室溫2 h孵育一抗 孵一抗 孵二抗試劑137度20分鐘孵生物素偶聯(lián)二抗（試劑B）室溫2 h孵二抗試劑237度30分鐘孵ABC液（試劑C）37度40分鐘DAB顯色 復(fù)染 封片脫水、透明37度烤片二甲苯梯度酒精梯度酒精二甲苯預(yù)處理20免疫組織（細胞）化學(xué)實 驗

13、 步 驟石蠟切片脫蠟、水化 冰凍切片 ddH2O或P二 抗PV即用型SP生物素放大PV9000：鼠、兔通用PV9003：羊來源一抗SP9000：鼠、兔通用SP9003：羊來源一抗21免疫組織（細胞）化學(xué)二 抗PV即用型SP生物素放大PV9000：鼠、兔通用21實 驗 步 驟石蠟切片脫蠟、水化 冰凍切片 ddH2O或PBS洗抗原修復(fù) 3%H2O2孵育10 min去除內(nèi)源性過氧化物酶即用型二步法 ABC放大法 血清封閉（試劑A）室溫2 h孵育一抗 孵一抗 孵二抗試劑137度20分鐘孵生物素偶聯(lián)二抗（試劑B）室溫2 h孵二抗試劑237度30分鐘孵ABC液（試劑C）37度40分鐘DAB顯色 復(fù)染 封片

14、脫水、透明37度烤片二甲苯梯度酒精梯度酒精二甲苯預(yù)處理22免疫組織（細胞）化學(xué)實 驗 步 驟石蠟切片脫蠟、水化 冰凍切片 ddH2O或PDAB顯色DAB試劑盒：濃縮液：稀釋液=1：20量取50 mL PBS 置于有毒區(qū)棕色瓶，再稱取DAB粉末0.02 g溶于PBS，振蕩混合，避光過濾到專用玻片缸中，加入200 L H2O2搖晃均勻，即可開始顯色。根據(jù)顯微鏡下觀察的結(jié)果終止染色，記錄顯色時間。注意：1.粉末DAB顯色陽性信號可能會在顯色1-2 min時才出現(xiàn)，請勿過早終止。2.DAB的有效作用時間為半小時，如果超過15 min未產(chǎn)生陽性信號，則可以提高一抗?jié)舛然蜓娱L一抗孵育時間。3.同一分子在不

15、同處理組的顯色時間要保證一致。4.DAB為一次性試劑，用后自覺將液體倒掉，并將玻片缸放于固定位置。5.DAB粉末放于有毒冰箱-20度，用后放回原處。23免疫組織（細胞）化學(xué)DAB顯色DAB試劑盒：濃縮液：稀釋液=1：2023免疫組織實 驗 步 驟石蠟切片脫蠟、水化 冰凍切片 ddH2O或PBS洗抗原修復(fù) 3%H2O2孵育10 min去除內(nèi)源性過氧化物酶即用型二步法 ABC放大法 血清封閉（試劑A）室溫2 h孵育一抗 孵一抗 孵二抗試劑137度20分鐘孵生物素偶聯(lián)二抗（試劑B）室溫2 h孵二抗試劑237度30分鐘孵ABC液（試劑C）37度40分鐘DAB顯色 復(fù)染 封片脫水、透明37度烤片二甲苯梯

16、度酒精梯度酒精二甲苯預(yù)處理24免疫組織（細胞）化學(xué)實 驗 步 驟石蠟切片脫蠟、水化 冰凍切片 ddH2O或P蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精分化，自來水沖洗5分鐘脫水、透明、封片、鏡檢。脫水：70%酒精3分鐘，80%酒精3分鐘，95%酒精5分鐘，無水乙醇5分鐘，拿出晾干。透明：二甲苯各8分鐘封片：中性樹脂鏡檢25免疫組織（細胞）化學(xué)蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精分化，自來水沖洗5分鐘25免疫組織（細胞原則必須同時設(shè)對照染色。沒有對照染色的免疫組化染色結(jié)果是不可信的。抗原表達必須在特定部位。如人白細胞共同抗原LCA和上皮膜抗原EMA應(yīng)定位在細胞膜上；肌酸激酶CK應(yīng)定位在細胞漿內(nèi)；PCNA及p53蛋白應(yīng)定位在細胞核內(nèi)，

17、等等。不在抗原所在部位的陽性著色，一概不能視為陽性。 結(jié) 果 判 定26免疫組織（細胞）化學(xué)原則結(jié) 果 判 定26免疫組織（細胞）化學(xué)盡量避開出血、壞死及切片刀痕和界面邊緣細胞的陽性表達，特別是酶免疫標(biāo)記。因為這類陽性著色多系內(nèi)源干擾，或系人為因素所致。陰性結(jié)果不能視為抗原不表達。由于檢測方法靈敏度有高低之分，有時可因染色方法靈敏度不夠，而導(dǎo)致陰性反應(yīng)，判斷時應(yīng)注意。27免疫組織（細胞）化學(xué)盡量避開出血、壞死及切片刀痕和界面邊緣細胞的陽性表達，特別是免疫顯色強度和陽性細胞密度是定性定量指標(biāo)，實際工作中常采用強度和密度結(jié)合的方法綜合計量，與抗原含量有關(guān)；陽性細胞的著色形態(tài)及組織分布特點主要是定位

18、指標(biāo)，與功能有關(guān)。28免疫組織（細胞）化學(xué)免疫顯色強度和陽性細胞密度是定性定量指標(biāo)，實際工作中常采用強一、陽性標(biāo)記免疫特征：分弱(+)、中(+)、強(+)三級。免疫酶標(biāo)記（HRP- DAB/H2O2）表現(xiàn)為淡黃色細顆粒、棕黃色顆粒和褐黃色粗顆粒，后者耀眼易見。+29免疫組織（細胞）化學(xué)一、陽性標(biāo)記免疫特征：分弱(+)、中(+)、強(+)二、陽性標(biāo)記細胞學(xué)特征（以HRP-DAB/H2O2為例） 可分為胞膜型；胞核型；胞質(zhì)(漿)型；微絨毛型和復(fù)合型（胞膜-胞質(zhì)兼有，胞核-胞質(zhì)兼有，或微絨毛-胞質(zhì)兼有）等五種陽性細胞類型。這與抗原所在部位相關(guān)聯(lián)，但應(yīng)注意排除因組織固定不好引起的抗原彌散假象，尤其是復(fù)

19、合型圖像。30免疫組織（細胞）化學(xué)二、陽性標(biāo)記細胞學(xué)特征（以HRP-DAB/H2O2為例） 可三、陽性標(biāo)記組織學(xué)特征（以HRP-DAB/H2O2為例） 免疫組化染色陽性細胞在組織中的分布排列形式可以有如下7種：局灶型；彌漫型；片塊型；網(wǎng)狀型；腺管型；腔緣型和菊團型，等。這主要取決于抗原抗體復(fù)合物在細胞內(nèi)的分布和陽性細胞在組織內(nèi)的群體分布特點。31免疫組織（細胞）化學(xué)三、陽性標(biāo)記組織學(xué)特征（以HRP-DAB/H2O2為例） 免四、陽性標(biāo)記強度特征 依照細胞陽性著色程度（抗原含量），可分為弱陽性（+）1分；中等陽性（+）2分；強陽性（+）3分。依照陽性細胞數(shù)量，可分為：弱陽性（+ ，指陽性細胞總數(shù)

20、在25%以下）；中等陽性（+,指陽性細胞總數(shù)在25%49%)；強陽性（+ ，指陽性細胞總數(shù)在50%以上)。此外，還有+ ，指陽性細胞總數(shù)在75%以上)。32免疫組織（細胞）化學(xué)四、陽性標(biāo)記強度特征 依照細胞陽性著色程度（抗原含量），可IS染色結(jié)果=染色強度陽性細胞百分比。結(jié)果為0-12分，其中0-3分為低表達組，4-12分為高表達組。只有一種評判標(biāo)準(zhǔn)，具體的可參考文獻。平均值：隨機選擇5個高倍視野，計數(shù)1 0002 000個細胞，取其平均值為該病例的細胞表達率，高于均值為高表達，低于為低表達統(tǒng)計軟件統(tǒng)計是否差異有統(tǒng)計學(xué)意義SPSS/state33免疫組織（細胞）化學(xué)IS染色結(jié)果=染色強度陽性細

21、胞百分比。結(jié)果為0-12分，其注 意 事 項二甲苯在烘箱中加熱時必須將鼓風(fēng)關(guān)掉，防止二甲苯揮發(fā)溢出。切片放入二甲苯及換缸時必須在通風(fēng)櫥中進行，然后再拿到烤箱中。夏季二甲苯可不加熱?？鞠錅囟炔灰^62度34免疫組織（細胞）化學(xué)注 意 事 項二甲苯在烘箱中加熱時必須將鼓風(fēng)關(guān)掉，防止二甲苯抗原修復(fù)后，切片不能直接放到冷水中，要在修復(fù)液中冷卻到室溫?？乖迯?fù)后一定不要干片，尤其是涂唇膏或指甲油的過程中，否則易產(chǎn)生非特異性著色。DAB顯色后直接將切片放入自來水中，以免弄到濕盒內(nèi)造成污染。做好個人防護。35免疫組織（細胞）化學(xué)抗原修復(fù)后，切片不能直接放到冷水中，要在修復(fù)液中冷卻到室溫。二甲苯更換時直接倒

22、在通風(fēng)櫥內(nèi)的空瓶子中，可用卷紙將缸內(nèi)蠟漬擦凈，然后倒入新的二甲苯。脫蠟和透明的二甲苯不能混用。通風(fēng)櫥兩側(cè)的二甲苯及梯度酒精不能混用左側(cè)脫蠟右側(cè)透明36免疫組織（細胞）化學(xué)二甲苯更換時直接倒在通風(fēng)櫥內(nèi)的空瓶子中，可用卷紙將缸內(nèi)蠟漬擦封片脫水時從無水乙醇中拿出后必須晾干，才能放入二甲苯中。而在二甲苯中浸泡到時間不要干片，滴加中性樹脂蓋蓋玻片。在通風(fēng)櫥中吹干后再拍攝，否則影響拍攝效果。拍攝時調(diào)整好合適的儀器參數(shù)。有毒區(qū)域物品勿拿到無毒區(qū)域。37免疫組織（細胞）化學(xué)封片脫水時從無水乙醇中拿出后必須晾干，才能放入二甲苯中。而在免疫組織(細胞)化學(xué)培訓(xùn)課件染色弱抗體濃度過低、孵育時間過短 提高抗體濃度、孵

23、育時間不能少于1 h試劑超過有效使用時間，應(yīng)更換試劑操作中添加試劑時緩沖液未瀝干，每步滴加試劑前瀝干切片中多余的緩沖液，防試劑稀釋（應(yīng)防止切片干燥）室溫太低，低于15度，要改放在37度孵育箱孵育30-60 min或4 度冰箱過夜蛋白封閉過度，封閉時間減少39免疫組織（細胞）化學(xué)染色弱39免疫組織（細胞）化學(xué)染色過強抗體濃度過高或孵育時間過長，降低抗體滴度、抗體孵育時間：室溫1 h或4度過夜孵育溫度過高超過37度 一般在室溫20-28度染色陰性操作步驟錯誤，應(yīng)重試，設(shè)陽性對照組織中無抗原或含量低，設(shè)陽性對照以驗證試驗結(jié)果抗原修復(fù)不全，換修復(fù)液或延長時間血清封閉時間過長一抗與二抗種屬連接錯誤，仔細

24、確定一抗二抗種屬無誤 40免疫組織（細胞）化學(xué)染色過強40免疫組織（細胞）化學(xué)內(nèi) 容免疫組化免疫熒光顯微鏡的使用41免疫組織（細胞）化學(xué)內(nèi) 容免疫組化41免疫組織（細胞）化學(xué)免疫熒光 冰凍切片 ddH2O或PBS預(yù)處理抗原修復(fù) 血清封閉（勿洗）室溫2 h 敷一抗過夜敷熒光二抗4度2 h 甘油封片：蓋玻片37度烤片取出24孔板，棄培養(yǎng)基 血清封閉2 h 敷一抗過夜敷熒光二抗4度2 h 甘油封片：載玻片4%細胞多聚固定0.5-1 h組織熒光細胞熒光敷二抗時根據(jù)個人需要選擇是否標(biāo)記細胞核，DAPI或Hoechst染色42免疫組織（細胞）化學(xué)免疫熒光 冰凍切片 ddH2O或PBS預(yù)處理抗原修復(fù) 血清熒

25、光二抗根據(jù)物種：不同來源的一抗，所用的二抗不同。小鼠、兔、山羊、綿羊、大鼠等。根據(jù)顏色：紅、綠、紫Cy2/FITC：綠色熒光Cy3：紅色熒光Alexa Fluor：紅色（568）、綠色（488）鬼筆環(huán)肽： phalloidin，標(biāo)記細胞骨架F-actin，不加一抗，本身以二抗標(biāo)記。43免疫組織（細胞）化學(xué)熒光二抗根據(jù)物種：不同來源的一抗，所用的二抗不同。小鼠、兔、熒光雙標(biāo)：兩種一抗的來源要不同，二抗選擇不同的顏色。44免疫組織（細胞）化學(xué)熒光雙標(biāo)：兩種一抗的來源要不同，二抗選擇不同的顏色。44免疫1、非特異性染色產(chǎn)生原因及其解決方案： 游離熒光素殘留在二抗中。一部分熒光素未與蛋白質(zhì)結(jié)合，形成了聚合物和衍化物，而不能被透析除去。購買高質(zhì)量、高純度的熒光素二抗。 抗體以外的血清蛋白與熒光素結(jié)合形成熒光素脲蛋白，可與組織成分結(jié)合。 組織抗原封閉不全。除去檢查的抗原以外，組織中還可能存在類屬抗原（如Forssman氏抗原），可與組織中特異性抗原以外之之相應(yīng)抗體結(jié)合。延長血清封閉時間。 從組織中難于提純抗原性物質(zhì)，所以制備的免疫血清中往往混雜一些抗其他組織成分的抗體，以致容易混淆。 抗體分子上標(biāo)記的熒光素分子太多，這種過量標(biāo)記的抗體分子帶過多的陰離子，可吸附于正常組織上而呈現(xiàn)非特異性染色。 一抗和二抗孵育條件和濃度不合適。調(diào)整一抗和二抗孵育