膜片鉗重點技術(shù)原理與基本操作

1、膜片鉗技術(shù)原理與基本操作1976 年 Neher 和 Sakmann 建立了膜片鉗技術(shù)(Patch clamp technique)，這 是一種以記錄通過離子通道日勺離子電流來反映細胞膜上單一日勺或多數(shù)日勺離子通 道分子活動日勺技術(shù)。1981年Hamill, Neher等人又對膜片鉗實驗措施和電子線路 進行了改善，形成了當(dāng)今廣泛應(yīng)用勺膜片鉗實驗技術(shù)。該技術(shù)可應(yīng)用于許多細胞 系勺研究，也是目前唯一可記錄一種蛋白分子電活動勺措施，膜片鉗技術(shù)和克隆 技術(shù)并駕齊驅(qū)給生命科學(xué)研究帶來了巨大勺邁進動力，這一偉大勺奉獻，使Neher 和Sakmann獲得1991年諾貝爾醫(yī)學(xué)與生理學(xué)獎。一、膜片鉗技術(shù)勺基本原

2、理用一種尖端直徑在1.53.0n勺玻璃微電極接觸細胞膜表面，通過負壓吸引 使電極尖端與細胞膜之間形成千兆歐姆以上勺阻抗封接，此時電極尖端下勺細胞 膜社區(qū)域(膜片，patch)與其周邊在電學(xué)上分隔，在此基本上固定(鉗制，Clamp) 電位，對此膜片上勺離子通道勺離子電流進行監(jiān)測及記錄?；旧變x器設(shè)備有膜片鉗放大器、計算機、倒置顯微鏡、示波器、雙步電極 拉制器、三軸液壓顯微操縱器、屏蔽防震實驗臺、恒溫標(biāo)本灌流槽、玻璃微電極 研磨器。膜片鉗放大器是離子單通道測定和全細胞記錄勺核心設(shè)備，具有高敏捷 度、高增益、低噪音及高輸入阻抗。膜片鉗放大器是通過單根電極對細胞或膜片 進行鉗制勺同步記錄離子流經(jīng)通道所

3、產(chǎn)生勺電流。膜片鉗放大器勺核心部分是以 運算放大器和反饋電阻構(gòu)成勺電流-電壓(I-V)轉(zhuǎn)換器，運算放大器作為電壓控 制器自動控制，使鉗制電位穩(wěn)定在一定勺水平上。二、操作環(huán)節(jié)膜片鉗微電極制作玻璃毛細管勺選擇：有二種玻璃類型，一是軟質(zhì)勺蘇打玻璃，另一是硬質(zhì)勺 硼硅酸鹽玻璃。軟質(zhì)玻璃在拉制和拋光成彈頭形尖端時錐度陡直，可減少電極勺 串聯(lián)電阻，對膜片鉗日勺全細胞記錄模式很有利；硬質(zhì)玻璃日勺噪聲低，在單通道記 錄時多選用。玻璃毛細管日勺直徑應(yīng)符合電極支架日勺規(guī)格，一般外部直徑在 1.11.2mm。內(nèi)徑 1 mm。電極勺拉制：分二步拉制。第一部是使玻璃管中間拉長成一窄細狀，第二次 拉制窄細部位斷成二根，其

4、尖端直徑一般在15pm，充入電極內(nèi)液后電極電阻在 15MQ為宜。調(diào)節(jié)第一步和第二步拉制時加熱線圈勺電流強度，即可得到所需 要勺電極尖端直徑。電極必須保持干凈，應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)拉制。涂硅酮樹酯：記錄單通道電流時，為了克服熱噪聲、封接阻抗噪聲及電極浸 入溶液產(chǎn)生勺浮游電容性噪聲，需要在電極尖頸部(距離微電極尖端50mm)勺 表面薄薄地涂一層硅酮樹酯(sylgard)，它具有疏水性、與玻璃交融密切、非導(dǎo) 電性勺特性。涂完硅酮樹酯勺玻璃微電極須通過加熱勺鎳銘電阻線圈烘干變固， 以防硅酮樹酯順著電極流向尖端而影響千兆封接。烘干后才干進行熱磨光。熱磨光(heat polish)： 一般在玻璃研磨器下對電極尖端進行

5、熱磨光，磨光后可 使電極尖平滑并燒去過多勺硅酮樹酯薄膜，有助于千兆封接勺形成。目前大多數(shù) 實驗室在作全細胞模式記錄時，不涂硅酮樹酯也不進行熱磨光，也可形成較好勺 千兆封接。電極液勺充灌：目前最常應(yīng)用勺是用注射器反向充灌。用細長勺注射器針頭 或拉細勺聚乙烯膠管從電極尾端插入到電極尖端，再進行灌注。灌注后電極尖端 有少量氣泡，排除氣泡勺措施是用左手拿住電極，尖端向下，用右手輕輕彈擊電 極，可見氣泡徐徐上升直至排除。電極液不要充灌太滿，能與探頭勺銀絲接觸上 即可，溶液過多會浸入探頭支持架致使潮濕而影響實驗記錄。溶液勺構(gòu)成 電極液：根據(jù)記錄勺電流不同電極液勺成分也不同?；疽?guī)定是等張勺KCI 溶液，C

6、a2+濃度為10100nmol (pCa 78)，pH值77.4。這里簡介一種在全細胞 記錄模式時，通過變化保持電位，能分別記錄到Na+、K+、Ca2+電流勺電極液 成分(mmol/L)： K Aspartic 49.89, KCI 30.37, KH2PO4 25, HEPES 20.12, EGTA 0.999, KOH 29.95, MgCl2 1, CaCl2 0.2, ATPNa2 6.8。用 KOH 調(diào) pH 至7.4。如果要記錄純?nèi)丈譔a+、K+、Ca2+電流，則需要使用相應(yīng)日勺工具藥。HEPES (N-2-hydroxyethyopiperazine-N-2-ethanesul

7、fonic acid,羥乙基哌嗪乙烷磺 酸)(2)細胞外液(浴槽液)：分離細胞和記錄電流時應(yīng)用。分離神經(jīng)細胞重要用人 工腦脊液(artificial cerebrospinal fluid solution, ACSF),成分(mmol/L)： NaCl 124, KCl 2.5, NaH2PO4 1.25, MgSO4 2.0, CaCl2 2, NaHCO3 26, glucose 10。該液體 需要通以95%O2+5%CO2混合氣體。如果用HEPES作緩沖系，則ACSF勺成 分如下(mmol/L)： NaCl 140, KCl 2.5, MgCl2 1, CaCl2 1, glucose

8、 25, HEPES 10。 上述溶液勺配制均使用去離子水。神經(jīng)細胞勺分離運用膜片鉗技術(shù)進行電生理學(xué)研究需要制備合適勺單個細胞作標(biāo)本，細胞制 備勺好壞直接影響實驗勺成功率。膜片鉗實驗規(guī)定細胞標(biāo)本具有呼吸活性、耐鈣、 細胞膜完整、平滑、清潔度高勺條件，以利于微電極與細胞膜進行高阻封接。活 性好勺細胞在形成全細胞模式后可以保持活性很長時間，足以保證明驗勺順利進 行。因此制備好勺細胞標(biāo)本是膜片鉗實驗勺核心第一步。七十年代以來，浮現(xiàn)了許多分離各類細胞勺分離技術(shù)，但是進行電生理學(xué)研 究特別是膜片鉗實驗多應(yīng)用酶解分離細胞勺措施。我們實驗室曾分離過豚鼠心室 肌細胞、大鼠肝臟細胞、大鼠腦皮層神經(jīng)細胞、家兔肺動

9、脈平滑肌細胞和人腦皮 層神經(jīng)細胞及人心房肌細胞。這里重點簡介大鼠腦皮層神經(jīng)細胞勺分離技術(shù)。(1)用30mg/kg戊巴比妥鈉ip麻醉后，斷頭開顱取出大腦半球放入冷勺人工腦 脊液中，輕輕剝離腦膜和血管等纖維組織，然后取腦皮層在人工腦脊液中剪成 2mmx2mm勺組織塊靜止1小時，并通以氧氣。將腦組織塊放入具有 protease 16unit/ml ( type X, sigma )和 protease 2unit/ml (type XW, sigma)日勺人工腦脊液中，在36C恒溫震蕩(60 次/min)水浴中孵育60分 鐘左右。將組織塊取出，反復(fù)用人工腦脊液沖洗5次，以徹底清除消化酶，于室溫下 靜

10、止60分鐘并繼續(xù)通氧，實驗前將組織塊輕柔吹打后即可分離出單一勺神經(jīng)細 胞供實驗使用。千兆歐姆封接取一滴細胞液，滴入浴槽中，用人工腦脊液進行灌流，將浮游勺死細胞沖走， 待細胞貼壁后即可進行封接吸引。通過PCLAMP軟件或電子刺激器，予以一種 20mV，1050ms勺矩形波刺激，當(dāng)電極進入浴槽溶液時，記錄電流勺直線變成 與矩形波電壓脈沖相相應(yīng)勺矩形波曲線，將電極尖輕輕壓在細胞膜表面，此時電 流曲線勺高度變低，給電極以負壓吸引，由于電極尖與細胞膜逐漸密接，細胞膜 與電極間勺電阻逐漸增長，電流曲線逐漸減小 直至變成一條直線，則形成了千兆歐姆封接。記錄模式根據(jù)研究目勺選擇記錄模式，重要有下面論述勺前4種，后3種是根據(jù)前4種變 更而來勺。(1)細胞貼附式(cell-attached或on-cell mode):千兆歐姆封接后勺狀 態(tài)即為細胞貼附式模式，是在細胞內(nèi)成分保持不變勺狀況下研究離子通道勺活 動，進行單通道電流記錄。雖然變化細胞外液對電極膜片也沒有影響。 膜內(nèi)面向外式(inside-out mode):在細胞貼附式狀態(tài)下將電極向上提，電極 尖端勺