克隆操作中使用工具酶

1、關(guān)于克隆操作中使用的工具酶第1頁，共52頁，2022年，5月20日，9點45分，星期四第一節(jié) 基因操作工具酶第2頁，共52頁，2022年，5月20日，9點45分，星期四酶酶限制性核酸內(nèi)切酶逆轉(zhuǎn)錄酶DNA連接酶末端轉(zhuǎn)移酶大腸桿菌DNA聚合酶 S1核酸酶Klenow酶DNA酶 Taq DNA 聚合酶RNA酶A多核苷酸激酶堿性磷酸酶基因工程操作中最常用的工具酶第3頁，共52頁，2022年，5月20日，9點45分，星期四主要內(nèi)容1 限制性核酸內(nèi)切酶2 DNA連接酶3 DNA聚合酶4 修 飾 酶5 小 結(jié)第4頁，共52頁，2022年，5月20日，9點45分，星期四酶主要用途限制性核酸內(nèi)切酶識別DNA特定

2、序列，切割DNA分子DNA連接酶連接兩個DNA分子或片段大腸桿菌DNA聚合酶 或Klenow酶1 制作DNA探針；2 合成cDNA第二鏈；3 填補雙鏈DNA 3凹端；4 DNA測序。Taq DNA 聚合酶聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）多核苷酸激酶多核苷酸5-OH磷酸化，制末端標記探針末端轉(zhuǎn)移酶使3-末端加同聚物尾S1核酸酶降解單鏈DNA或RNADNA酶在雙鏈DNA上產(chǎn)生隨機切口RNA酶A降解RNA逆轉(zhuǎn)錄酶補平反應(yīng)，合成cDNA或制探針堿性磷酸酶切除核酸末端磷酸基SUMMARYHome第5頁，共52頁，2022年，5月20日，9點45分，星期四1 限制性核酸內(nèi)切酶1.1 引 言1.2 命 名1.3 分

3、 類1.4 活性及影響因素Home第6頁，共52頁，2022年，5月20日，9點45分，星期四核酸酶（Nuclease）： 通過切割相鄰兩個核苷酸殘基間磷酸二酯鍵，導(dǎo)致核酸分子多核苷酸鏈水解斷裂的蛋白酶。（1）按作用對象分: DNAase & RNAase（2）按斷裂核酸分子不同方式分： Endonuclease & Exonuclease 1.1 引言兩個概念第7頁，共52頁，2022年，5月20日，9點45分，星期四限制性內(nèi)切核酸酶（restriction endonuclease): 指一類能識別雙鏈DNA分子中特定核苷酸序列，并在識別序列內(nèi)或附近特異切割雙鏈DNA的核酸內(nèi)切酶。 限制酶

4、與甲基化酶共同構(gòu)成細菌的限制-修飾系統(tǒng)（Restriction-Modification System)。Back第8頁，共52頁，2022年，5月20日，9點45分，星期四1.2 命 名命名原則：第一個字母（大寫, 斜體）： 該酶來源的微生物屬名；第二、三個字母（小寫、斜體）：微生物種名；若該微生物有不同的變種和品系，再加上該變種和品系的第一個字母（大寫）若從同一微生物發(fā)現(xiàn)多種限制性內(nèi)切酶，則依照發(fā)現(xiàn)和分離的先后順序用羅馬字母表示。例如：EcoR 從大腸桿菌R株分離的第一種限制酶命名為EcoR， 其中E 代表屬名（Escherichia)，co 代表種名（coli)，R 代表株系（RY13）

5、， 代表該菌株中首次分離到。Back第9頁，共52頁，2022年，5月20日，9點45分，星期四1.3 分 類1.3.1 型限制性內(nèi)切酶1.3.2 型限制性內(nèi)切酶1.3.3 型限制性內(nèi)切酶Back第10頁，共52頁，2022年，5月20日，9點45分，星期四1.3.1 型限制性內(nèi)切酶（1）功能：限制、修飾（2）特點：需輔助因子Mg2+、ATP和S-腺苷蛋氨酸為；隨機切割，切割位點識別位點和不一致，無固定切割位點；（3）應(yīng)用：不常用。Back第11頁，共52頁，2022年，5月20日，9點45分，星期四1.3.3 型限制性內(nèi)切酶（1）功能：限制、修飾（2）特點：需輔助因子Mg2+、ATP和S-腺

6、苷蛋氨酸為；特異切割，切割位點在距識別位點3端24-26 bp處。（3）應(yīng)用：數(shù)量很少，無實際作用。Back第12頁，共52頁，2022年，5月20日，9點45分，星期四1.3.2 型限制性內(nèi)切酶（1）功能：識別并特異切割DNA分子。 即通常所指DNA限制性核酸內(nèi)切酶；（2）特點：僅需輔助因子Mg2+ 作催化反應(yīng)；特異切割，能識別雙鏈DNA特殊序列，并產(chǎn)生特異片段；（3）應(yīng)用：種類繁多，分子克隆中最為常用第13頁，共52頁，2022年，5月20日，9點45分，星期四1.3.2.1 基本特性識別序列：長度：為4-8個核苷酸的特異序列；結(jié)構(gòu)：且許多識別序列具回文結(jié)構(gòu)，如Hind 的識別序列： 5

7、AAGCTT 3 3 TTCGAA 5切割產(chǎn)生的末端有粘端 (cohesive/sticky end) 如BamH I (GGATCC) 和平端 (blunt end) 如Sma I (CCC GGG)第14頁，共52頁，2022年，5月20日，9點45分，星期四EnzymeRecognition seuqenceEnzymeRecognition seuqenceBamH IGGATCCPst ICTGCA GBgl II A GATCTSal IG TCGACEcoR IG AATTCSau3A IGATCHind IIGTPy PuACSfi IGGCCNNNN NGGCCHind II

8、IA AGCTTSma ICCC GGGKpn IGGTAC CXba IT CTAGANot IGC GGCCGCXho IC TCGAGRecognition Sequences and Cutting sites of Restriction Endonucleases 第15頁，共52頁，2022年，5月20日，9點45分，星期四1.3.2.2 同功異源酶(isoschizomer) 定義：來源不同但能識別和切割同一位點的酶。又稱同裂酶。如：BamH I 和Bst I (G GATCC)注：有一些同功異源酶對于切割位點上的甲基化堿基的敏感度有所不同。第16頁，共52頁，2022年，5月

9、20日，9點45分，星期四1.3.2.3 同尾酶（isocaudamer) 定義：識別序列不同，但產(chǎn)生相同粘性末端的限制酶。 如：BamH I : GGATCC Bgl II : AGATCTBack第17頁，共52頁，2022年，5月20日，9點45分，星期四1.4 活性及影響因素(1) 活性大?。好笇NA水解程度不同。(2) 酶的活性單位： 指1g 純的指定DNA在指定緩沖液中，于37（最適溫度更準確）1 h完全酶解DNA中所有該限制酶識別位點所需的酶量。第18頁，共52頁，2022年，5月20日，9點45分，星期四(3) 影響因素 DNA模板的純度 DNA的甲基化程度 酶切反應(yīng)溫度 D

10、NA的分子結(jié)構(gòu) 緩沖液Back第19頁，共52頁，2022年，5月20日，9點45分，星期四2 DNA連接酶2.1 定義2.2 種類及作用機理2.3 使用時的注意事項Home第20頁，共52頁，2022年，5月20日，9點45分，星期四2.1 定義及功能 定義：可使一段DNA 3-OH末端和5-P 末端形成3,5-磷酸二酯鍵，把兩DNA片段連在一起封閉雙鏈上形成的切口的酶（DNA ligase） 。第21頁，共52頁，2022年，5月20日，9點45分，星期四OH P53355335DNA ligaseDNA ligase 連接缺刻(nick)Back第22頁，共52頁，2022年，5月20日

11、，9點45分，星期四（1）種類: T4 DNA連接酶(ATP提供能量） 大腸桿菌DNA連接酶（NAD+提供能量）2.2 種類及作用機理第23頁，共52頁，2022年，5月20日，9點45分，星期四（2）作用機理：T4 DNA ligaseBack第24頁，共52頁，2022年，5月20日，9點45分，星期四（1)不能催化兩單鏈DNA分子連接；（2)只能連雙鏈DNA分子的單鏈缺刻(nick)；不能連接雙鏈中一個或多個核苷酸缺失所致缺口(gap)。2.3 使用注意第25頁，共52頁，2022年，5月20日，9點45分，星期四DNA ligase 的活性Back第26頁，共52頁，2022年，5月2

12、0日，9點45分，星期四3 DNA聚合酶（DNA polymerase）3.1 DNA聚合酶 I3.2 Klenow聚合酶3.3 Taq DNA聚合酶3.4 逆轉(zhuǎn)錄酶3.5 T4 DNA聚合酶3.6 T7 DNA聚合酶Home第27頁，共52頁，2022年，5月20日，9點45分，星期四3.1 DNA聚合酶 活性：53聚合活性，53外切和35 外切活性。發(fā)揮生物學(xué)活性的條件：（1）DNA模板（可以是單鏈或雙鏈）（2）帶有3-端游離羥基的引物鏈（3）底物和激活劑注：對雙鏈DNA，當有dNTP存在時， 35降解活性會被53方向的聚合活性所抑制。應(yīng)用：缺口平移法制備DNA分子雜交探針第28頁，共52

13、頁，2022年，5月20日，9點45分，星期四缺口DNase IDNA聚合酶 IDNA聚合酶 IdNTP*缺口缺口平移法制備DNA分子探針Back第29頁，共52頁，2022年，5月20日，9點45分，星期四活性： 53聚合活性，35 外切酶活性。無53 外切酶活性。用途： （1）填補或標記DNA的3隱蔽末端； （2）催化合成cDNA第二鏈； （3）DNA序列測定3.2 Klenow聚合酶第30頁，共52頁，2022年，5月20日，9點45分，星期四EcoR I 酶切末端同位素標記的EcoR I 酶切末端- 32P-dATPBack第31頁，共52頁，2022年，5月20日，9點45分，星期四

14、（1）顯著特點：熱穩(wěn)定性。70反應(yīng)2h殘留活性90 %； 93 反應(yīng) 2 h殘留活性60% ；94 反應(yīng) 2 h殘留活性40%。（2）應(yīng)用： 特定DNA片段的體外擴增； DNA測序。3.3 Taq DNA聚合酶Back第32頁，共52頁，2022年，5月20日，9點45分，星期四（1）定義：RNA指導(dǎo)下的DNA聚合酶(reverse transcriptase) 。（2）活性：53聚合酶活性和RNaseH活性。聚合作用所需模板可以是RNA或DNA，引物是帶3-OH的RNA或DNA。3.4 逆轉(zhuǎn)錄酶第33頁，共52頁，2022年，5月20日，9點45分，星期四逆轉(zhuǎn)錄酶的活性第34頁，共52頁，2

15、022年，5月20日，9點45分，星期四 （3）用途在體外以mRNA為模板合成cDNA；對有5突出末端的DNA片段作末端標記或補平；雙脫氧法測序；以DNA或RNA為模板合成核酸探針。Back第35頁，共52頁，2022年，5月20日，9點45分，星期四（1）活性： 53聚合酶活性和35外切酶活性。注意：35外切酶活性對單鏈DNA的作用比對雙鏈DNA強；高濃度dNTP 環(huán)竟下前者活性更強。（2）應(yīng)用：標記DNA平末端或隱蔽3末端3.5 T4 DNA聚合酶Back第36頁，共52頁，2022年，5月20日，9點45分，星期四（1）活性：53聚合酶活性；有單鏈及雙鏈的35外切酶活性。但無53外切酶活

16、性；（2）特點：極佳的連續(xù)合成能力（3）應(yīng)用：長DNA片段體外擴增；通過單純延伸或取代合成途徑標記DNA 3末端；補平：使雙鏈DNA 5或3突出末端變平末端。3.6 T7 DNA聚合酶Back第37頁，共52頁，2022年，5月20日，9點45分，星期四4 修飾酶4.1 堿性磷酸酶4.2 末端轉(zhuǎn)移酶4.3 T4多核苷酸激酶4.4 S1核酸酶 Home第38頁，共52頁，2022年，5月20日，9點45分，星期四4.1 堿性磷酸酶（1）功能：催化核酸脫5-磷酸基團，使DNA或RNA片段5-P末端轉(zhuǎn)換成5-OH末端。（2）來源：大腸桿菌： bacterial alkaline phosphatas

17、e (BAP); 小牛腸道: calf intestinal alkaline phosphatase (CIP)。第39頁，共52頁，2022年，5月20日，9點45分，星期四堿性磷酸酶的活性第40頁，共52頁，2022年，5月20日，9點45分，星期四 注意：CIP的比活性比BAP高出10-20倍，且CIP在SDS中68就可完全失活，而BAP卻是熱抗性酶。Back第41頁，共52頁，2022年，5月20日，9點45分，星期四（1）來源: 前淋巴細胞和分化早期的類淋巴細胞。（2）功能：催化DNA進行53方向的聚合作用, 逐個將dNTP分子加到線性DNA分子3-OH端。4.2 末端轉(zhuǎn)移酶 (t

18、erminal transferase)第42頁，共52頁，2022年，5月20日，9點45分，星期四末端轉(zhuǎn)移酶的催化作用第43頁，共52頁，2022年，5月20日，9點45分，星期四 （3）用途： 給外源DNA片段和及載體加互補同聚物尾巴； 標記DNA片段的3末端。Back第44頁，共52頁，2022年，5月20日，9點45分，星期四4.3 T4多核苷酸激酶T4 polynucleotide kinase (PNK) （1）來源: T4噬菌體感染的大腸桿菌細胞。 （2）功能：催化-磷酸從ATP分子轉(zhuǎn)移給DNA或RNA的5-OH末端（圖）。第45頁，共52頁，2022年，5月20日，9點45分，星期四T4 多核苷酸激酶的活性（正向反應(yīng)）第46頁，共52頁，2022年，5月20日，9點45分，星期四DNA/RNA（單鏈或雙鏈）T4多核苷酸激酶的交換活性過量第47頁，共52頁，2022年，5月20日，9點45分，星期四 （3）用途： 使缺失5-P末端的DNA發(fā)生磷酸化作用； 標記DNA的5-末端。Back第48頁，共52頁，2022年，5月20日，9點45分，星期四4.4 S1核酸酶（