乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥檢測課件

1、乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測一、HBV耐藥的有關定義二、各種耐藥檢測技術的評價三、需要重視的幾個問題乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐一、HBV耐藥的有關定義二、各種耐藥檢測技術的評價三、需要重視的幾個問題乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥檢測課件一、HBV耐藥的有關定義 病毒學突破（virologic breakthrough） 病毒反跳（viral rebound） 生化學突破（biochemical breakthrough） HBV基因型耐藥（genotypic resistance） HBV

2、表型耐藥（phenotypic resistance） 臨床耐藥（clinical resistance） 一、HBV耐藥的有關定義 HBV耐藥的有關定義 病毒學突破（virologic breakthrough）指在核苷類藥物治療過程中，患者的血清HBV DNA水平一度被抑制，但在繼續(xù)治療中血清HBV DNA水平與最低值相比上升或超過1個log10（10倍）。HBV耐藥的有關定義HBV耐藥的有關定義 病毒反跳（viral rebound）指核苷類藥物治療過程中患者的血清HBV DNA水平一度被抑制，但在繼續(xù)治療中血清HBV DNA升高至2104IU/mL或高于治療前水平。 HBV耐藥的有關定

3、義HBV耐藥的有關定義 生化學突破（biochemical breakthrough）指在核苷類藥物治療過程中血清丙氨酸氨基轉移酶（ALT）水平一度復常，但在繼續(xù)治療中血清ALT水平又再次升高。肝臟生活指標很多，但是在此僅指ALT。HBV耐藥的有關定義 HBV耐藥的有關定義 HBV基因型耐藥（genotypic resistance）指HBV基因組中的某些位點發(fā)生改變，導致這種藥物對HBV的抑制作用下降或消失。這種HBV基因變異與HBV的耐藥性有直接因果關系，通過這些變異位點的檢測可判斷HBV有無耐藥性。 HBV耐藥的有關定義HBV耐藥的有關定義 HBV表型耐藥（phenotypic resi

4、stance）通過體外細胞培養(yǎng)方法，直接測定HBV對某種藥物的敏感性，或者在體外直接測定HBV聚合酶的活性，敏感性的降低或酶活性的下降均表明有耐藥，即表型耐藥。通常以IC50來評估 IC505倍:敏感 IC50在510倍:部分耐藥 IC50 10倍:耐藥HBV耐藥的有關定義 HBV表型耐藥（phenotyHBV耐藥的有關定義 臨床耐藥（clinical resistance）指臨床出現(xiàn)病毒復制不能被抑制，或HBV復制一度被抑制后又出現(xiàn)HBV DNA反跳，同時伴有ALT升高，或肝炎復發(fā)的其他臨床證據(jù)。 HBV耐藥的有關定義二、各種耐藥檢測技術及評價病毒學反跳或突破的監(jiān)測HBV基因型耐藥監(jiān)測HBV

5、表型耐藥檢測臨床耐藥監(jiān)測二、各種耐藥檢測技術及評價病毒學反跳或突破的監(jiān)測基于對血清HBV DNA載量的動態(tài)監(jiān)測需重視以下三點： 1. HBV DNA載量檢測手段的敏感性 2.檢測技術的可靠性和穩(wěn)定性 3.監(jiān)測的間隔時間病毒學反跳或突破的監(jiān)測HBV基因型耐藥監(jiān)測時機非必須不主張常規(guī)、廣泛應用HBV基因型耐藥監(jiān)測基因型耐藥相關變異的命名基因型耐藥相關變異的命名基因型耐藥相關變異在HBV多聚酶序列中的位置基因型耐藥相關變異在HBV多聚酶序列中的位置HBV基因型耐藥的主要技術堿基序列分析法 直接測序 克隆測序聚合酶鏈式反應及限制性片段長度多態(tài)性技術(PCR-RFLP)反向雜交分析技術（INNOLiPA

6、）基因芯片技術 實時熒光定量PCR技術 探針定點突變PCR技術 引物末端堿基定點突變擴增技術 熔解曲線法 基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)HBV基因型耐藥的主要技術堿基序列分析法直接測序法末端終止法化學裂解法DNA測序自動化使用特異性引物與單鏈模板DNA退火，在DNA聚合酶作用下進行延伸反應，用ddNTP終止，用PAGE區(qū)分長度僅相差1個核苷酸的ssDNA，從而完成測序的方法。用化學試劑在A、G、C、T處特定的裂解DNA片段，產(chǎn)生一簇各種長度的短鏈，經(jīng)過PAGE放射自顯影可直讀DNA順序。類似末端終止法，所不同的是用熒光染料標記，計算機自動讀出。優(yōu)點簡便、迅速、應用

7、廣泛。不需酶促反應，可以對寡核苷酸測序。簡便、快速、準確可靠。安全、無放射性污染。模板用量大大減少。測序能力增強。 直接測序法末端終止法化學裂解法DNA測序自動化使用特異性引物HBV YMDD變異直接測序結果圖譜HBV YMDD變異直接測序結果圖譜直接DNA測序的局限性1. 設備貴、技術高、耗材、費時。2.必須有充足目的基因片段。3.突變株比例小于20%時，由于競爭抑制作用不能被擴增。直接測序法檢測HBV YMDD變異1.JPG直接DNA測序的局限性1. 設備貴、技術高、耗材、費時。克隆測序法克隆測序法克隆測序法優(yōu)點： 1.有助于發(fā)現(xiàn)混合株并可大致確定不同序列毒株 之間的相對比。 2.提高了檢

8、測的靈敏度。局限性： 1.技術難度較高。 2.檢測周期更長。 3.檢測的費用大大增加?？寺y序法優(yōu)點： 堿基變異可能導致： 原有位點消失 產(chǎn)生新的位點 識別位點移位 利用錯配引物使 PCR產(chǎn)物中產(chǎn)生 特異的酶切位點結果: 酶切片段長、短變化和多、少變化聚合酶鏈式反應及限制性片段長度多態(tài)性技術(PCR-RFLP) 堿基變異可能導致：結果: 酶切片段長、短變化和多限制性內切核酸酶的作用它們能識別DNA的特異序列，并在識別序列內或其旁切割雙鏈DNA。如：Nde I限制酶的識別序列和切割位點：CA TATGGTAT ACNla Ill限制酶的識別序列和切割位點：CATG NNNGTAC NNN限制性內

9、切核酸酶的作用它們能識別DNA的特異序列，并在識別序PCR-RFLP檢測HBV YMDD變異PCR錯配引物設計PCR-RFLP檢測HBV YMDD變異PCR錯配引物設計PCR-RFLP檢測HBV YMDD變異PCR-RFLP檢測HBV YMDD變異PCR-RFLP檢測HBV YMDD變異PCR-RFLP檢測HBV YMDD變異PCR-RFLP技術的評價優(yōu)點： 簡單、廣泛易開展。缺點： 1.限制性內切酶種類有限。 2.錯配引物將導致退火溫度降低、非特異條帶增多。 3.引物非完全匹配，可能導致擴增效率降低、檢測 敏感的下降。 PCR-RFLP技術的評價優(yōu)點：反向雜交分析技術（INNOLiPA）反向

10、雜交分析技術（INNOLiPA）INNOLiPA診斷HBV YMDD變異INNOLiPA診斷HBV YMDD變異DNA芯片技術BiologicalSampleAnalyze dataScannermicroarray“Hybridize”arrayerMicroarray fabricationSample preparationMolecular hybridizationDetection and analysisDNA芯片技術BiologicalAnalyze dataSDNA芯片技術診斷HBV YMDD變異Detection of YMDD Motif Mutants by Oligo

11、nucleotide Chips in Lamivudine-Untreated Patients with Chronic Hepatitis B Virus Infection。J Korean Med Sci 2004; 19: 541-546.DNA芯片技術診斷HBV YMDD變異Detection oDNA芯片技術 優(yōu)點 局限性 大通量 技術和設備的要求高 快速 檢測成本高 靈敏度高 可平行檢測 DNA芯片技術 優(yōu)點 局實時熒光定量PCR在基因變異中的應用探針定點突變PCR技術Taqman-MGB探針引物末端堿基定點突變擴增技術高分辨熔解曲線法實時熒光定量PCR在基因變異中的應用探針

12、定點突變PCR技術-Taqman-MGB探針定點突變PCR技術Taqman-MGB探針定點突變PCR技術Taqman-MGB探針技術檢測YMDD變異HBV DNA105copies/mlW:M=1:1HBV DNA105copies/mlW:M=10:1HBV DNA探針定點突變PCR技術 優(yōu)點 不足 靈敏度高 需要相對較貴的熒光PCR儀 特異性好 需要多條熒光探針，成本高 費時短 影響因素多，存在一定誤判探針定點突變PCR技術引物末端堿基定點突變擴增技術引物末端堿基定點突變擴增技術引物末端堿基定點突變擴增技術檢測YMDD變異引物末端堿基定點突變擴增技術檢測YMDD變異熔解曲線法檢測YMDD變

13、異特異性探針，其Tm值不同溶解曲線分析熔解曲線法檢測YMDD變異特異性探針，其Tm值不同溶解曲線分基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)原理基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)MALDI-TOF MS檢測HBV YMDD變異的原理酶切分子量.JPGMALDI-TOF MS檢測HBV YMDD變異的原理酶切基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALD I-TOF MS)優(yōu)點： 高靈敏度、準確度、分辨率 能發(fā)現(xiàn)相對比例小于1%的變異株。局限性： 設備昂貴，目前國內難以用于臨床檢測。基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALD I-TOF MSHBV耐藥不同

14、檢測技術的比較Advances in Molecular Diagnosis of HBV Infection and Drug Resistance。Int. J. Med. Sci. 2005 2(1)：8-161Sensitivity here refers to the lowest level (%) at which an assay can detect mixtures of mutant and wild-type virus. 2Information content is considered as a measure of a tests ability to prov

15、ide broad, relevant information about possible new mutations. 3Updateability assesses the ease at which a test can be dapted to incorporate the detection of a new mutation. na, not applicable. nd, not determined.HBV耐藥不同檢測技術的比較Advances in MoleHBV表型耐藥檢測有兩種途徑：1.細胞外HBV聚合酶活性分析。2.細胞藥物敏感性實驗。HBV表型耐藥檢測有兩種途徑：

16、細胞外HBV聚合酶活性分析目前常用的研究HBV聚合酶活性模型是將HBV基因組插入桿狀病毒載體，繼而轉染昆蟲細胞而表達HBV顆粒，應用親和層析法純化HBV顆粒后，在細胞外評價藥物對聚合酶活性的影響。細胞外HBV聚合酶活性分析目前常用的研究HBV聚合酶活性模型細胞外HBV聚合酶活性分析細胞外HBV聚合酶活性分析細胞藥物敏感性實驗該方法類似于細菌藥物敏感試驗。目前多采用病毒載體將含有被檢測的含HBV變異位點的全基因組導入肝細胞源性細胞株，然后將各種濃度的核苷類藥物加入培養(yǎng)液，經(jīng)過一定時間培養(yǎng)后檢測細胞上清中的HBV DNA含量。 細胞藥物敏感性實驗該方法類似于細菌藥物敏感試驗。目前多采用病細胞藥物敏

17、感性實驗細胞藥物敏感性實驗細胞藥物敏感性實驗該技術在操作上非常繁瑣，目前僅限于研究之需，主要用于藥物開發(fā)研究，尚不能用于常規(guī)臨床分析。 細胞藥物敏感性實驗該技術在操作上非常繁瑣，目前僅限于研究之需臨床耐藥監(jiān)測YMDD變異前后病毒載量和ALT的變化臨床耐藥監(jiān)測YMDD變異前后病毒載量和ALT的變化HBV MDD變異與病毒學突破HBV MDD變異與病毒學突破判斷臨床耐藥時的建議1. 結合核苷類藥物的應用史、起始病毒載量、是否合并其他肝病等。2.注意甄別依從性不良。3.結合基因變異位點。 判斷臨床耐藥時的建議1. 結合核苷類藥物的應用史、起始病毒載三、需要重視的幾個問題慎重對待天然耐藥的結論。不要過

18、分依基因型耐藥檢測技術。正確對待基因分型技術。 三、需要重視的幾個問題慎重對待天然耐藥的結論。YMDD自然變異的幾組數(shù)據(jù)Akarsu M等采用InnoLipa 法檢測71例未經(jīng)抗病毒的成年慢性乙肝攜帶者，結果有13例檢測到YMDD變異株。Lee CZ等采用引物末端堿基定點突變擴增技術對28例拉米夫定治療前的CHB患者血清進行了YMDD變異毒株檢測，發(fā)現(xiàn)有16例（57.1%）存在YMDD自然變異毒株。日本Kobayashi等檢測18例無癥狀HBV攜帶者,發(fā)現(xiàn)5例YMDD變異,占27.78%。YMDD自然變異的幾組數(shù)據(jù)Akarsu M等采用InnoLi本實驗室關于YMDD自然變異的2組數(shù)據(jù)196例CHB患者中，檢出存在YMDD變異毒株者共21例，檢出率為10.7%。其中YVDD陽性20例，YIDD陽性1例，YVDD和YIDD同時陽性者0例。183例CHB患者中，檢出存在YMDD突變毒株者共40例，檢出率為21.86%。其中YVDD陽性36例，YIDD陽性