臨床免疫測定技術課件

1、臨床免疫測定技術（各論）臨床免疫測定技術課件1臨床免疫測定技術（各論）臨床免疫測定技術課件1凝集試驗Widal reactionWeil-felix reactionWright test:布魯菌病交叉配血試驗臨床免疫測定技術課件凝集試驗Widal reaction臨床免疫測定技術課件相關幫助需要相關抗體試劑的可以訪問Fantibody全球抗體搜索引擎fantibody全球抗體搜索引擎是一個供公共檢索的抗體數據庫，其抗體信息數據來源于全球范圍的研究機構與商業(yè)公司。該引擎由商品化抗體數據庫與抗體應用評價數據庫兩部分組成，以幫助研究者更高效的尋找并評估該抗體的性能。全球抗體搜索引擎是繼基因與蛋白數

2、據庫之后更為復雜的應用型檢索平臺需要相關的實驗室儀器設備、生物試劑、醫(yī)療器械、制藥設備、醫(yī)藥原料、體外診斷試劑及耗材與技術服務信息的，可以訪問探生網biomean進行咨詢，期待您的加入臨床免疫測定技術課件相關幫助需要相關抗體試劑的可以訪問Fantibody全球抗體Widal reaction（試管內凝集反應）?。海?：10）待檢血清3.0ml 生理鹽水 3.0ml/管 釋度1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 臨床免疫測定技術課件Widal reaction（試管內凝集反應）?。?待測血清的抗體效價（滴度）： 即出現“+”凝集的最終血清稀釋度臨床免疫測定技術課件 待

3、測血清的抗體效價（滴度）：臨床免疫測定血型鑒定（玻片凝集反應）（直接）YYY+抗A標準血清YYY+抗B標準血清 待測RBC待測RBCA型 B型臨床免疫測定技術課件血型鑒定（玻片凝集反應）（直接）YYY+抗A標準血清YYY 乳膠凝集試驗(間接)帶現象Zone phenomenon前帶prezone后帶postzone臨床免疫測定技術課件 乳膠凝集試驗(間接)帶現象臨床免疫測定技術課件臨床免疫測定技術課件臨床免疫測定技術課件 1）正向間接凝集試驗 (用抗原致敏載體-檢測Ab) 2）反向間接凝集試驗間接凝集(用抗體致敏載體-檢測Ag） 3）間接凝集抑制試驗 4) 協(xié)同凝集試驗 (SPA抗體致敏-測抗

4、原)臨床免疫測定技術課件 1）正向間接凝集試驗臨床免疫測定技 反向間接血凝試驗(測Ag)1/21/41/81/161/321/641/1281/2561/5121/1024Pos.Neg.Titer648512232128324Patient12345678臨床免疫測定技術課件 反向間接血凝試驗(測Ag)1/21/41/8抗球蛋白抗體試驗- commbs （抗RBC不完全抗體）A（間接法游離）B（直接法結合）：臨床免疫測定技術課件抗球蛋白抗體試驗- commbsA（間接法游離）B（直(In fluid phase )絮狀沉淀試驗：AgAb環(huán)狀沉淀試驗臨床免疫測定技術課件(In fluid ph

5、ase )絮狀沉淀試驗：AgAb(In gel phase )single gel diffusion test 抗原濃度的標準曲線操作：抗體混于凝膠中 抗原加入孔內 抗原自由擴散 測定沉淀環(huán)直徑 在標準曲線上查找 相應抗原濃度臨床免疫測定技術課件(In gel phase )single gel dif影響因素:1.抗原分子量：與擴散速度、沉淀環(huán)反相關2.抗體種類：兔抗血清優(yōu)于馬、羊3.抗體稀釋度：抗體濃度大沉淀環(huán)小4.擴散時間：抗原含量高，擴散時間長5.擴散溫度：437內溫度與擴散速度正相關6.瓊脂板厚度：與沉淀環(huán)反相關臨床免疫測定技術課件影響因素:1.抗原分子量：與擴散速度、沉淀環(huán)反相關

6、臨床免疫測double gel diffusion test原理:將可溶性抗原和抗體置于瓊脂凝膠板的對應孔中，兩者各自在凝膠中向四周自由擴散，當抗原與抗體相遇，在比例合適時形成沉淀線。臨床免疫測定技術課件double gel diffusion test原理:臨床瓊脂雙向擴散試驗的應用1.檢測未知抗原或抗體2.抗原性質分析 3.抗體效價滴定4.抗原或抗體純度鑒定臨床免疫測定技術課件瓊脂雙向擴散試驗的應用1.檢測未知抗原或抗體臨床免疫測定技術1.檢測未知抗原或抗體臨床免疫測定技術課件1.檢測未知抗原或抗體臨床免疫測定技術課件A: 濃度Ag、Ab及擴散率近似；B：濃度Ag、Ab近似，擴散率AgAb

7、 ；C：濃度Ag、Ab近似，擴散率AgAbD：濃度AgAb，擴散率近似；E：濃度AgAb，擴散率AgAb ；F：濃度AgAb，擴散率AgAb ；臨床免疫測定技術課件A: 濃度Ag、Ab及擴散率近似；臨床免疫測定技術課件2.抗原性質分析臨床免疫測定技術課件2.抗原性質分析臨床免疫測定技術課件3.抗體效價滴定臨床免疫測定技術課件3.抗體效價滴定臨床免疫測定技術課件4.抗原或抗體純度鑒定臨床免疫測定技術課件4.抗原或抗體純度鑒定臨床免疫測定技術課件免疫濁度試驗(略)免疫球蛋白的檢測（簡）臨床免疫測定技術課件免疫濁度試驗(略)臨床免疫測定技術課件年 齡 IgG IgA IgM臍血 6.516.0 0.

8、010.04 0.251月 2.59.0 0.020.5 0.200.829月 2.09.0 0.040.8 0.251.01012月 2.910.7 0.150.9 0.351.515歲 3.412.4 0.151.6 0.452.0612歲 6.516.0 0.352.5 0.502.51260歲 6.516.0 0.403.5 0.503.0 健康人血清Ig含量（g/L）臨床免疫測定技術課件年 齡 IgG 免疫固定電泳（測M蛋白）臨床免疫測定技術課件 免疫固定電泳（測M蛋白）臨床免疫測定技術課件CH50(complement hemolysis 50%).原理：組分和功能完整的補體系統(tǒng)能

9、使抗體致敏的羊紅細胞（SRBC）發(fā)生溶血反應。在一定范圍內，SRBC溶血程度與補體總活性成正相關。以溶血百分率作縱坐標，相應的血清量為橫坐標繪圖，在一個適當的、穩(wěn)定的反應體系中，溶血程度與補體劑量依賴呈一個S形曲線 臨床免疫測定技術課件CH50(complement hemolysis 5Enzyme linked immunosorbent assay （ELISA）原理（Principle）：將抗原或抗體結合到某固相載體表面，保持其免疫活性，測定時,把被測sample和conjugate按不同的步驟與固相載體上的immunosorbent反應。用洗滌的方法使與固相載體上形成的immunoc

10、omplex與其他物質分開，再加入酶反應substrate，經酶的催化作用后substrate變?yōu)橛猩a物。產物的量與標本中被檢物的量直接相關。臨床免疫測定技術課件Enzyme linked immunosorbent asELISA操作的基本步驟：標本的收集、運送和保存試劑準備加樣溫育洗板顯色比色結果判斷結果報告及解釋臨床免疫測定技術課件ELISA操作的基本步驟：標本的收集、運送和保存臨床免疫測定1、標本的收集、運送和保存ELISA檢測分析用標本 血清（漿） 特殊項目用： 唾液、腦脊液、尿液、糞便等ELISA檢測分析的對象 病原體抗原/抗體 Tumor mark、hormone、cytoki

11、ne et al采集、運送與保存的注意點： 采集時間、運送條件、暫存點溫度臨床免疫測定技術課件1、標本的收集、運送和保存ELISA檢測分析用標本 血可能影響測定結果的標本因素一、內源性（標本內） 類風濕因子（rheumatoid factor） 補體（complement） 異嗜性抗體（heterophilic antibody） 治療或診斷用鼠抗體（抗鼠抗體） 自身抗體或溶菌酶等二、外源性（操作） 溶血、反復凍融 細菌污染 儲存時間過長 標本凝固不全臨床免疫測定技術課件可能影響測定結果的標本因素臨床免疫測定技術課件對策： 1、稀釋標本 2、改變選用的酶標抗體 3、預封閉（變性IgG） 4、加

12、入某些還原劑 5、血清標本的補體滅活（5630min） 6、選擇包被或標記抗體如F(ab)2片段 7、用理化方法解離自身抗體 8、標本中添加Cu2+離子或卵白蛋白 等等臨床免疫測定技術課件對策：臨床免疫測定技術課件 2、試劑準備1、實驗開始前，將試劑盒從冰箱取出置室溫放置20min以上啟用，謂平衡（balance）目的： 1）保證反應溫度的一致性 2）去濕化，保證試劑濃度2、稀釋液的質量和特殊試劑配制的要求臨床免疫測定技術課件 2、試劑準備1、實驗開始前，將試劑盒從冰箱取出置室臨床3、加樣原則：量準 操作規(guī)范量準移液槍的狀態(tài)與正確使用操作規(guī)范 正確使用加樣器臨床免疫測定技術課件3、加樣原則：量

13、準臨床免疫測定技術課件3、加樣操作規(guī)范 掌握操作要領 吸頭與加樣器上吸頭套密閉 吸頭進入液體的深度要適宜 放送液體注意角度（1040） 位置（下1/3） 速度（不宜太快） 關注加樣器的狀態(tài)臨床免疫測定技術課件3、加樣操作規(guī)范 掌握操作要領臨床免疫測定技術課件臨床免疫測定技術課件臨床免疫測定技術課件4、溫育（incubation）溫育是ELISA檢測反應中可能影響其檢測結果的最為關鍵的一個因素。液相的待測抗原/抗體與固相的抗體/抗原反應需要一定的溫度與時間，以保證結合反應充分。溫育所需要的時間與反應溫度成反比。溫育溫度：37、室溫、43和28避免“邊緣效應”。臨床免疫測定技術課件4、溫育（inc

14、ubation）溫育是ELISA檢測反應中可5、洗板（washing）通過洗滌將特異性結合與固相的抗原或抗體與反應溫育過程中可能非特異吸附及游離的成分分離，完成固相免疫檢測程序保證測定的特異性。洗滌液 :0.05% tween-phosphate-buffer saline pH7.4吐溫-20(山梨醇-20)一種非離子去垢劑含親水/疏水基團臨床免疫測定技術課件5、洗板（washing）通過洗滌將特異性結合與固相的抗原或在洗滌中的作用是通過其疏水基團與被動吸附于固相載體上蛋白的疏水鍵相互作用以削弱之；同時通過其親水基團結合液相中水分子的作用，促使非特異的蛋白質吸脫。吐溫-20的濃度（2%）洗滌

15、用量與次數臨床免疫測定技術課件在洗滌中的作用是通過其疏水基團與被動吸附于固相載體上蛋白的疏例：選擇4條8孔的已包被抗原（HBsAg）ELISA板條每2條分別加同一份弱陽性和陰性樣本然后按試劑盒的操作說明加conjugate、溫育洗滌：1排4孔洗1次 4排4孔洗4次 2排4孔洗2次 3排4孔洗3次 8排4孔洗8次加底物，顯色，比色評判原則- 陽性/陰性值保持最大不變的次數臨床免疫測定技術課件例：臨床免疫測定技術課件6、顯色(Color is appeared)添加酶特異性底物(HRP- TMB/OPD)保證底物溶液的有效性(無色、避光、顯色)反應溫度（37、室溫）反應時間（2530min）終止反

16、應（酸溶液-2mol/L sulfate acid）及時比色臨床免疫測定技術課件6、顯色(Color is appeared)添加酶特異7、比色 (By the plate reader)加酸終止顯色反應后，比色測定前應振蕩混勻測定時，要注意酶標儀的波長是否已調至合適比較好的酶標儀可選擇單波長或雙波長比色測定 所謂雙波長比色，即在敏感波長（此時對所顯色 具最大光吸收）如450 nm和非敏感波長（所測得 的光吸收為微孔板上的劃痕、污跡以及指紋等所 致），最后從儀器得到的讀數為在敏感波長測得 的吸光度與非敏感波長測得的吸光度之差。臨床免疫測定技術課件7、比色 (By the plate reade

17、r)臨床免8、結果判斷臨床ELISA檢測的結果報告形式 定性（陰/陽） 定量（量值） ELISA定性測定的“陰性”和“陽性”的判斷依據是試劑盒所確定的陽性判斷值（cut-off）。ELISA定量測定的“量值”依據是試劑盒中所帶標準品同時測定出的劑量反應曲線（標準曲線）。cut-off的建立(略)S/CO1時判為陽性S/N或P/N2.1陽性為臨床免疫測定技術課件8、結果判斷臨床ELISA檢測的結果報告形式 定性（陰/陽“灰區(qū)”（例-HBsAg）臨床免疫測定技術課件臨床免疫測定技術課件9、結果報告及解釋結果報告根據測定性質，定性-陰性/陽性 定量-具體數值結果解釋結合所測項目的相關知識（臨床意義）

18、，考慮各種可能影響的因素（關注測定操作中的各環(huán)節(jié)，尤其是加樣、溫育和洗滌）臨床免疫測定技術課件9、結果報告及解釋結果報告根據測定性質，定性-陰性/陽例舉：臨床可能出現的問題及原因現象：1、相同的標本兩次測定的結果不一致原因：加樣/試劑量不準，板孔間有差異 加樣過快，孔間發(fā)生污染 加錯樣本 加樣/試劑時，落在非包被區(qū) 不同批號的試劑混用 溫育、洗滌及反應時間不一致 孔內污染雜物 酶標儀濾光片不正確 血清分離不充分，纖維蛋白原或血細胞入孔 臨床免疫測定技術課件例舉：臨床可能出現的問題及原因現象：1、相同的標本兩次測定的現象：2、弱陽性質控樣本檢測不出原因：溫育時間或溫度不夠，顯色反應時間過短， 配

19、置緩沖液（洗滌液）的蒸餾水有問題現象：3、陽性對照不顯色原因：漏加酶結合物 洗滌液配置？（含有酶抑制物-NaN3） 漏加顯色劑，錯加（將終止液誤為顯色液）現象：4、全部孔都有顯色原因：洗滌不夠 顯色液變質 底物或洗滌液被酶污染臨床免疫測定技術課件現象：2、弱陽性質控樣本檢測不出臨床免疫測定技術課件 臨床ELISA測定的常用模式一、雙抗體夾心檢測抗原二、競爭法檢測抗原三、間接法檢測抗體四、競爭法檢測抗體五、固相捕獲法檢測抗體六、雙抗原夾心檢測抗體七、ABS- ELISA及其他臨床免疫測定技術課件 臨床ELISA測定的常用模式一、雙抗體夾心檢測抗原臨床免一、雙抗體夾心檢測抗原例：ELISA雙抗體夾

20、心法定性檢測乙型肝炎表面抗原原理：臨床免疫測定技術課件一、雙抗體夾心檢測抗原例：ELISA雙抗體夾心法定性檢測乙型AbAgAb* Ab Ag Ab* Ab Ag Ag Ab*Ab* Ag Ab* a b c d臨床免疫測定技術課件AbAgAb* Ab Ag Ab* Ab Ab Ag Ab Ag （b復合物） (1) Ab AgAb* Ab Ag Ab* （a復合物） (2)臨床免疫測定技術課件Ab Ag Ab Ag （b復合物） HooKS效應（鉤狀效應）臨床免疫測定技術課件HooKS效應（鉤狀效應）臨床免疫測定技術課件評價： 被檢測的抗原具有兩個以上抗原決定族（全抗原） 標本中RF會充當抗原

21、分子（干擾） 一步法簡便、快捷；存潛在缺陷(hooks effect) 其他- 判斷時OD值落在“灰色區(qū)”？ 假陰性？（ hooks effect /變異） 假陽性? 臨床免疫測定技術課件評價：臨床免疫測定技術課件二、競爭法檢測抗原 例:T3、T4等激素或地高辛、茶堿等藥物濃度檢測臨床免疫測定技術課件二、競爭法檢測抗原 例:T3、T4等激素或地高辛、茶堿等藥物評價： 結合于固相的酶標記抗原量與被測抗原量呈反比 檢測對象為小分子蛋白（半抗原） 檢測中需獲得酶標記的小分子半抗原（制備難） 運用于儀器的自動化檢測 臨床免疫測定技術課件評價：臨床免疫測定技術課件三、間接法檢測抗體例:ELISA間接法檢

22、測各類病原體特異性抗體（IgG）臨床免疫測定技術課件三、間接法檢測抗體例:ELISA間接法檢測各類病原體特異性抗評價： 通用性大。只要更換固相抗原，同一種酶標記體 體（IgG/IgA、M）可用以各種與抗原相應的抗體檢 測。 標本高濃度時易受非特異IgG的干擾（稀釋） 易受其他因素的影響（包被抗原的純度） 臨床免疫測定技術課件評價：臨床免疫測定技術課件四、競爭法檢測抗體抗體的檢測一般不選用競爭法。當已知抗原難以純化或抗原/抗體的結合特異性不穩(wěn)定時 實例-ELISA競爭法檢測乙型肝炎病毒核心抗體 （基因工程表達的HBcAg） 固相板（包被HBcAg ）+ 待測標本 + 酶標記抗-HBc 待測標本中抗- HBc /酶標記抗-HBc （競爭）固相板（包被HBcAg ） |酶標記抗-HBc與固相板