分子生物學(xué)分子克隆的技術(shù)

1、關(guān)于分子生物學(xué)分子克隆技術(shù)1第1頁，共83頁，2022年，5月20日，14點(diǎn)24分，星期四第2頁，共83頁，2022年，5月20日，14點(diǎn)24分，星期四基因工程是指在微觀領(lǐng)域（分子水平）中，根據(jù)分子生物學(xué)和遺傳學(xué)原理，設(shè)計(jì)并實(shí)施一項(xiàng)把一個(gè)生物體中有用的目的DNA(遺傳信息)轉(zhuǎn)入另一個(gè)生物體中，使后者獲得新的需要的遺傳性狀或表達(dá)所需要的產(chǎn)物，最終實(shí)現(xiàn)該技術(shù)的商業(yè)價(jià)值。基因工程的基本特點(diǎn)是，分子水平操作，細(xì)胞水平表達(dá)?；蚬こ袒蚬こ膛c建筑工程第3頁，共83頁，2022年，5月20日，14點(diǎn)24分，星期四重組DNA技術(shù)的重大突破帶動(dòng)了現(xiàn)代生物技術(shù)的興起，并很快產(chǎn)生了許多生命科學(xué)的高技術(shù)產(chǎn)業(yè)。重組D

2、NA技術(shù)，又稱為基因或分子克隆技術(shù)，是基因工程的核心技術(shù)。該技術(shù)包括了一系列的分子生物學(xué)操作步驟?；蚬こ痰暮诵募夹g(shù)是DNA重組技術(shù)第4頁，共83頁，2022年，5月20日，14點(diǎn)24分，星期四分子克隆技術(shù) 又稱為重組DNA技術(shù)，是指將一種生物體（供體）的基因與載體在體外進(jìn)行拼接重組，然后轉(zhuǎn)入另一種生物體（受體）內(nèi)，使之按照人們的意愿穩(wěn)定遺傳并表達(dá)出新產(chǎn)物或新性狀的DNA體外操作程序。 供體、受體、載體是重組DNA技術(shù)的三大基本元件。第5頁，共83頁，2022年，5月20日，14點(diǎn)24分，星期四重組DNA操作一般步驟：（1）獲得目的基因；（2）與克隆載體連接，形成新的重組DNA分子；（3）用重

3、組DNA分子轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞，并能在受體細(xì)胞中復(fù)制和遺傳；（4）對(duì)轉(zhuǎn)化子篩選和鑒定；（5）對(duì)獲得外源基因的細(xì)胞或生物體通過培養(yǎng)，獲得所需的遺傳性狀或表達(dá)出所需要的產(chǎn)物。第6頁，共83頁，2022年，5月20日，14點(diǎn)24分，星期四獲得需要的目的基因（外源基因）獲得需要的目的基因常用的方法：（1）直接從生物體中提取總DNA，構(gòu)建基因文庫(kù)(gene library)，從中調(diào)用目的基因；（2）以mRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成互補(bǔ)的DNA片段；（3）利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）特異性地?cái)U(kuò)增所需要的目的基因片段，等等。第7頁，共83頁，2022年，5月20日，14點(diǎn)24分，星期四細(xì)胞內(nèi)總DNA的提取分離與基因文

4、庫(kù)的構(gòu)建細(xì)胞內(nèi)總DNA的提取分離程序第8頁，共83頁，2022年，5月20日，14點(diǎn)24分，星期四 紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA溶液的純度和濃度。第9頁，共83頁，2022年，5月20日，14點(diǎn)24分，星期四基因工程的工具酶“手術(shù)刀” 專司切割之職，內(nèi)切酶“縫紉針” 具有連接之功，連接酶“復(fù)印機(jī)” 行使復(fù)制之責(zé)，DNA聚合酶第10頁，共83頁，2022年，5月20日，14點(diǎn)24分，星期四(“交通工具車子”)載體有了切割與縫合（ligase）基因DNA的工具，還得有一個(gè)“車子”將重組DNA送到宿主細(xì)胞中去。 第11頁，共83頁，2022年，5月20日，14點(diǎn)24分，星期四逆轉(zhuǎn)錄酶使真核基因的制備成為

5、可能。 （1）真核基因組龐大而復(fù)雜，不易制得基因圖譜。 （2）即使有了基因圖譜，因?yàn)檎婧嘶蛴袃?nèi)含子，不能在原核表達(dá)系統(tǒng)剪接出mRNA，沒有成熟的mRNA就不能得到相應(yīng)得產(chǎn)物。 （3）經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄mRNAcDNA (complementory DNA)得到的cDNA文庫(kù)要比基因組文庫(kù)小得多，所以篩選陽性克隆就方便得多。 第12頁，共83頁，2022年，5月20日，14點(diǎn)24分，星期四四、分子克隆的技術(shù)支撐核酸凝膠電泳技術(shù)核酸分子連接技術(shù)細(xì)菌轉(zhuǎn)化技術(shù)DNA序列分析技術(shù)寡核苷酸合成技術(shù)基因定點(diǎn)突變技術(shù)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)DNA序列測(cè)定技術(shù)第13頁，共83頁，2022年，5月20日，14點(diǎn)24分

6、，星期四核酸凝膠電泳第14頁，共83頁，2022年，5月20日，14點(diǎn)24分，星期四細(xì)菌轉(zhuǎn)化技術(shù)（包括感受態(tài)細(xì)胞制備）第15頁，共83頁，2022年，5月20日，14點(diǎn)24分，星期四聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)第16頁，共83頁，2022年，5月20日，14點(diǎn)24分，星期四大規(guī)模生產(chǎn)生物活性物質(zhì)野生細(xì)胞野生細(xì)胞分離工程酶分離工程基因工程蛋白質(zhì)工程途徑工程工程細(xì)胞發(fā)酵工程酶工程細(xì)胞工程生物活性物質(zhì)第17頁，共83頁，2022年，5月20日，14點(diǎn)24分，星期四第18頁，共83頁，2022年，5月20日，14點(diǎn)24分，星期四 用攜帶了外源基因的農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化植物原生質(zhì)體，發(fā)育成具有新性狀的完整植

7、株轉(zhuǎn)基因植物。 第19頁，共83頁，2022年，5月20日，14點(diǎn)24分，星期四基因工程的工具酶“手術(shù)刀” 專司切割之職“縫紉針” 具有連接之功“復(fù)印機(jī)” 行使復(fù)制之責(zé)內(nèi)切酶連接酶聚合酶第20頁，共83頁，2022年，5月20日，14點(diǎn)24分，星期四內(nèi)切酶“手術(shù)刀” 專司切割之職“縫紉針” 具有連接之功“復(fù)印機(jī)” 行使復(fù)制之責(zé)內(nèi)切酶連接酶聚合酶第21頁，共83頁，2022年，5月20日，14點(diǎn)24分，星期四內(nèi)切酶第22頁，共83頁，2022年，5月20日，14點(diǎn)24分，星期四同裂酶(Isoschizomers）第23頁，共83頁，2022年，5月20日，14點(diǎn)24分，星期四同尾酶第24頁，共8

8、3頁，2022年，5月20日，14點(diǎn)24分，星期四星活性*所謂星活性又稱Star活性。是指由于反應(yīng)條件不同而產(chǎn)生的切斷與原來認(rèn)識(shí)序列不同的位點(diǎn)的現(xiàn)象，也就是說產(chǎn)生Star活性后，不但可以切斷特異性的識(shí)別位點(diǎn)，還可以切斷非特異性的位點(diǎn)。產(chǎn)生Star活性的結(jié)果是酶切條帶增多。 Differences which can lead to star activity include low ionic strength, high pH, and high ( 5% v/v) glycerol concentrations.High Fidelity (HF) Restriction Enzymes

9、can be used to reduce star activity.第25頁，共83頁，2022年，5月20日，14點(diǎn)24分，星期四第26頁，共83頁，2022年，5月20日，14點(diǎn)24分，星期四DNA聚合酶Taq酶用Taq酶擴(kuò)增DNA時(shí)常使片段3端凸出一個(gè)A。Pfu酶產(chǎn)生平末端產(chǎn)物。第27頁，共83頁，2022年，5月20日，14點(diǎn)24分，星期四連接酶T4 DNA Ligase (invitrogen)16C過夜或者室溫1-2個(gè)小時(shí)了連接即可。第28頁，共83頁，2022年，5月20日，14點(diǎn)24分，星期四基因工程的載體-用于擴(kuò)增第29頁，共83頁，2022年，5月20日，14點(diǎn)24分，

10、星期四克隆載體必備條件（1）具有復(fù)制起點(diǎn)（2）具有抗菌素抗性基因（3）具有若干限制酶單一識(shí)別位點(diǎn)（4）具有較小的相對(duì)分子質(zhì)量和較高的拷貝數(shù)。第30頁，共83頁，2022年，5月20日，14點(diǎn)24分，星期四表達(dá)型基因工程的載體-以PET32為例第31頁，共83頁，2022年，5月20日，14點(diǎn)24分，星期四多克隆位點(diǎn)第32頁，共83頁，2022年，5月20日，14點(diǎn)24分，星期四宿主要考慮宿主菌對(duì)密碼子的偏愛性 大腸桿菌不同密碼子的偏愛性問題，將64組密碼子分為強(qiáng)、中、弱密碼子第33頁，共83頁，2022年，5月20日，14點(diǎn)24分，星期四目的產(chǎn)物目的基因不溶性的高效表達(dá)過程：目的基因編碼的真核

11、蛋白質(zhì)與宿主基因編碼的原核多肽或或其它基因編碼的具有其它功能的多肽和結(jié)合在一起，這種結(jié)合在一起的形成的不溶性無活性的包涵體，又叫為融合蛋白。舉例：胰島素與-半乳糖苷酶形成包涵體優(yōu)點(diǎn)：避免細(xì)菌蛋白酶破壞，提高目的基因表達(dá)產(chǎn)物產(chǎn)量。缺點(diǎn)：需要經(jīng)過溶解和復(fù)性才能獲得有活性的適合：不需要翻譯后修飾的蛋白質(zhì)產(chǎn)物第34頁，共83頁，2022年，5月20日，14點(diǎn)24分，星期四目的基因的高效分泌表達(dá)概念：目的蛋白分泌到細(xì)胞周質(zhì)和目的蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞周質(zhì)后再分泌到細(xì)胞外優(yōu)點(diǎn)： 防止宿主菌對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的降解；有利于蛋白質(zhì)正確折疊，形成天然構(gòu)象減輕宿主細(xì)胞代謝負(fù)荷有利于分離需要在質(zhì)粒設(shè)計(jì)時(shí)加入一段信號(hào)肽基因第35頁，

12、共83頁，2022年，5月20日，14點(diǎn)24分，星期四基因克隆操作過程第36頁，共83頁，2022年，5月20日，14點(diǎn)24分，星期四克隆示意圖第37頁，共83頁，2022年，5月20日，14點(diǎn)24分，星期四克隆示意圖第38頁，共83頁，2022年，5月20日，14點(diǎn)24分，星期四克隆技術(shù)流程分切連轉(zhuǎn)篩第39頁，共83頁，2022年，5月20日，14點(diǎn)24分，星期四分分離（來自生物組織）、擴(kuò)增（設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增）mRNA-DNA-擴(kuò)增第40頁，共83頁，2022年，5月20日，14點(diǎn)24分，星期四引物設(shè)計(jì)與訂購(gòu)酶切位點(diǎn)雙酶切、保護(hù)堿基、最合適的緩沖液。引物訂購(gòu)第41頁，共83頁，2022年

13、，5月20日，14點(diǎn)24分，星期四保護(hù)堿基第42頁，共83頁，2022年，5月20日，14點(diǎn)24分，星期四1.用限制性酶消化 DNA 樣品第43頁，共83頁，2022年，5月20日，14點(diǎn)24分，星期四單酶切第44頁，共83頁，2022年，5月20日，14點(diǎn)24分，星期四雙酶切第45頁，共83頁，2022年，5月20日，14點(diǎn)24分，星期四選擇合適的雙酶切緩沖液第46頁，共83頁，2022年，5月20日，14點(diǎn)24分，星期四2.用限制性內(nèi)切酶消化質(zhì)粒DNA 第47頁，共83頁，2022年，5月20日，14點(diǎn)24分，星期四3.連接樣品DNA和質(zhì)粒DNA的消化產(chǎn)物第48頁，共83頁，2022年，5

14、月20日，14點(diǎn)24分，星期四連接前最好要定量連接比例摩爾比例為：插入片度：質(zhì)粒=10:1-5:1為佳。質(zhì)粒幾十個(gè)ng為佳。第49頁，共83頁，2022年，5月20日，14點(diǎn)24分，星期四雙酶切Eco R切割位點(diǎn)Bg l切割位點(diǎn)+EcoR+ Bg l雙酶切Eco R+ Bg l雙酶切T4 DNA連接酶15C重組體配伍末端的連接情況和同一限制酶切位點(diǎn)連接相似。第50頁，共83頁，2022年，5月20日，14點(diǎn)24分，星期四冷循環(huán)器第51頁，共83頁，2022年，5月20日，14點(diǎn)24分，星期四4.用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化細(xì)菌有兩個(gè)基本方法。一是 化學(xué)法，即用CaCl2 處理并加熱激以

15、促進(jìn)DNA進(jìn)入菌體；二是電激法，即 施加短脈沖的電荷以促進(jìn)DNA 吸收。第52頁，共83頁，2022年，5月20日，14點(diǎn)24分，星期四用氯化鈣化學(xué)轉(zhuǎn)化第53頁，共83頁，2022年，5月20日，14點(diǎn)24分，星期四用氯化鈣化學(xué)轉(zhuǎn)化第54頁，共83頁，2022年，5月20日，14點(diǎn)24分，星期四電激轉(zhuǎn)化第55頁，共83頁，2022年，5月20日，14點(diǎn)24分，星期四一個(gè)電激轉(zhuǎn)化程序加 50-200ng DNA 到 40ul 電激感受態(tài)細(xì)菌中將混合物放入一個(gè)預(yù)冷的電激杯中施以脈沖電處理，脈沖長(zhǎng)度預(yù)期值為 8 to 12ms立即加1ml LB 培養(yǎng)液，在室溫下振蕩 2-4 小時(shí)。分別取10ul 和

16、 100ul 涂布在到兩個(gè)加有抗菌素的LB 瓊脂平板上， 保溫培養(yǎng)1天。 第56頁，共83頁，2022年，5月20日，14點(diǎn)24分，星期四5. 細(xì)菌在加有Amp+X-Gal的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)以進(jìn)行篩選連接會(huì)有三種結(jié)果，一是要插入的序列自連；二是切開的質(zhì)粒重連；三是要插入的序列與質(zhì)粒相連。第一種連接結(jié)果沒有菌落形成。第二種連接結(jié)果表現(xiàn)為藍(lán)色菌落。只有后一種結(jié)果是符合需要的，產(chǎn)生白色的抗氨芐青霉素菌落。 第57頁，共83頁，2022年，5月20日，14點(diǎn)24分，星期四滅菌器第58頁，共83頁，2022年，5月20日，14點(diǎn)24分，星期四加IPTG和X-GAL第59頁，共83頁，2022年，5月20日，

17、14點(diǎn)24分，星期四倒平板第60頁，共83頁，2022年，5月20日，14點(diǎn)24分，星期四 互補(bǔ)利用互補(bǔ)原理篩選重組體pUC18 第61頁，共83頁，2022年，5月20日，14點(diǎn)24分，星期四篩選結(jié)果藍(lán)菌落代表含有質(zhì)粒的耐藥菌，表達(dá)出由完好的 LacZ序列編碼的功能性的 片段。白菌落代表含有質(zhì)粒的耐氨芐青霉素菌，質(zhì)粒上 LacZ序列上有插入片段。第62頁，共83頁，2022年，5月20日，14點(diǎn)24分，星期四乳糖和誘導(dǎo)物IPTG的化學(xué)結(jié)構(gòu) isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside第63頁，共83頁，2022年，5月20日，14點(diǎn)24分，星期四X-galX-

18、Gal是-半乳糖苷酶(-galactosidase)的顯色底物，在-半乳糖苷酶的催化下會(huì)產(chǎn)生藍(lán)色產(chǎn)物。常用于-半乳糖苷酶的原位染色檢測(cè)以及藍(lán)白斑篩選。第64頁，共83頁，2022年，5月20日，14點(diǎn)24分，星期四X-gal水解第65頁，共83頁，2022年，5月20日，14點(diǎn)24分，星期四篩選結(jié)果模式圖第66頁，共83頁，2022年，5月20日，14點(diǎn)24分，星期四藍(lán)菌落建議用DH5做宿主菌。 第67頁，共83頁，2022年，5月20日，14點(diǎn)24分，星期四藍(lán)白菌落第68頁，共83頁，2022年，5月20日，14點(diǎn)24分，星期四電泳儀第69頁，共83頁，2022年，5月20日，14點(diǎn)24分，

19、星期四經(jīng)過雙酶切、PCR等鑒定，送陽性克隆測(cè)序。提取正確的克隆菌中的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入表達(dá)型的菌株，如BL21等。誘導(dǎo)表達(dá)蛋白第70頁，共83頁，2022年，5月20日，14點(diǎn)24分，星期四鑒定方法第71頁，共83頁，2022年，5月20日，14點(diǎn)24分，星期四 PCR鑒定第72頁，共83頁，2022年，5月20日，14點(diǎn)24分，星期四 原位雜交第73頁，共83頁，2022年，5月20日，14點(diǎn)24分，星期四雞的肌球蛋白的克隆和檢出免疫學(xué)方法 第74頁，共83頁，2022年，5月20日，14點(diǎn)24分，星期四蛋白質(zhì)的純化第75頁，共83頁，2022年，5月20日，14點(diǎn)24分，星期四謝謝！第76頁，共83頁，2022年，5月20日，14點(diǎn)24分，星期四多利誕生的過程 為什么震驚和驚呼，我們先了解一下多利誕生的過程以及胚胎細(xì)胞克隆和體細(xì)胞克隆的區(qū)別這兩個(gè)基本問題，對(duì)我們學(xué)習(xí)后面內(nèi)容或許有所幫助和啟發(fā)。 多利誕生的過程： 1.取出第一只成年母羊乳腺的普通細(xì)胞，分離基因備用。 2.取出第二只母羊未受精的卵細(xì)胞，取出基因換上第一只羊乳腺細(xì)胞基因（“掉包”），放電激活該卵細(xì)胞，使之象正常受精卵一樣進(jìn)行細(xì)胞分裂