幾種重要病毒簡(jiǎn)介

1、關(guān)于幾種重要病毒的簡(jiǎn)介第1頁(yè)，共271頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)22分，星期四本章重點(diǎn)1.腺病毒復(fù)制的特點(diǎn)以及逃避宿主免疫監(jiān)控的機(jī)制2.何為自主型和缺陷型細(xì)小病毒3.輪狀病毒基因組結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、編碼蛋白的功能及逃避宿主免疫監(jiān)控的機(jī)制4.流感病毒的變異特點(diǎn)5. SARS的起源流6.艾滋病毒的致病特點(diǎn)7. 乙肝病毒復(fù)制的特點(diǎn)第2頁(yè)，共271頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)22分，星期四第一節(jié) 類(lèi)病毒腺病毒 腺病毒（Adenovirus）最初于1953年從人的增殖腺分離出來(lái)，它是一群分布十分廣泛的DNA病毒。能引起人類(lèi)呼吸道、胃腸道、泌尿系統(tǒng)及眼的疾病，少數(shù)對(duì)動(dòng)物有致癌作用。腺病毒科（Aden

2、oviridae）病毒分四個(gè)屬： 哺乳動(dòng)物腺病毒屬（Mastadenovirus） 禽腺病毒屬（Aviadenovirus） 富AT腺病毒屬（Atadenovirus） 唾液酸酶病毒屬（Siadenovirus）第3頁(yè)，共271頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)22分，星期四一、生物學(xué)性狀 腺病毒無(wú)囊膜，直徑80110nm，呈二十面體對(duì)稱，線狀的雙股DNA與核心蛋白形成直徑6065nm的髓芯，被包裹于衣殼內(nèi)。衣殼由252個(gè)直徑810nm的殼粒組成，殼粒排列在三角形的面上，每邊6個(gè)，其中240個(gè)為六鄰體(Hexon)，另12個(gè)為五鄰體基底(Penton，頂點(diǎn)殼粒)。每個(gè)五鄰體基底上結(jié)合著1根(哺

3、乳動(dòng)物腺病毒)或2根(禽腺病毒)長(zhǎng)977.5nm的纖維突起，這些纖維以五鄰體蛋白為基底由衣殼面伸出，纖維頂端形成頭節(jié)區(qū)。第4頁(yè)，共271頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)22分，星期四第5頁(yè)，共271頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)22分，星期四第6頁(yè)，共271頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)22分，星期四第7頁(yè)，共271頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)22分，星期四 衣殼蛋白解離后，具有三種抗原。其中組成六鄰體的衣殼蛋白具有組特異性抗原；組成五鄰體的基底具有同組共有的抗原；而組成五鄰體的纖維是型特異性抗原所在。 自上個(gè)世紀(jì)50年代發(fā)現(xiàn)并成功分離腺病毒以來(lái)，已陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了100余個(gè)血清型，

4、其中人腺病毒有47種，分為A、B、C、D、E和F六個(gè)亞群。 第8頁(yè)，共271頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)22分，星期四 腺病毒耐酸，故能通過(guò)胃腸道而繼續(xù)保持活性，這為口服腺病毒載體的研制提供了方便，許多腺病毒就是從人和動(dòng)物的糞便中獲得的。無(wú)囊膜，對(duì)有機(jī)溶劑不敏感，但在丙酮中不穩(wěn)定。腺病毒在-20時(shí)可長(zhǎng)期存活，56加熱可滅活。適宜pH為56，pH值在2以下或10以上均不穩(wěn)定。第9頁(yè)，共271頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)22分，星期四二、病毒的復(fù)制1、基因組的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)： 反向末端重復(fù)序列（inverted terminal repeat, ITR）：每股核酸末端都有長(zhǎng)約100bp的反向

5、末端重復(fù)序列，是復(fù)制的起始位點(diǎn)。 末端蛋白（TP）：每股DNA的5端通過(guò)脫氧胞苷共價(jià)結(jié)合一個(gè)小蛋白質(zhì)（55ku）即末端蛋白（TP）。對(duì)DNA復(fù)制的起始非常重要。 蛋白VII和一種稱為mu的小蛋白緊密地環(huán)繞在DNA周?chē)鸬筋?lèi)組蛋白樣的作用。另一種蛋白V將這種DNA-蛋白復(fù)合物連接起來(lái)，并通過(guò)蛋白VI與病毒衣殼連接在一起。在左端ITR的3側(cè)有一段長(zhǎng)約300bp的包裝信號(hào)（）介導(dǎo)腺病毒基因組包裝入病毒衣殼。第10頁(yè)，共271頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)22分，星期四 ITRITR E1A E1B L1 L2 L3 L4 E3 L5 E2B E2A E4第11頁(yè)，共271頁(yè)，2022年，5月2

6、0日，14點(diǎn)22分，星期四2、病毒的復(fù)制 粘附和進(jìn)入細(xì)胞 腺病毒感染細(xì)胞的過(guò)程是從腺病毒纖毛的頭節(jié)區(qū)粘附到細(xì)胞表面的特異性受體開(kāi)始的。因?yàn)槿讼俨《局饕c柯薩奇B病毒共用一種受體，因此這種受體被稱為柯薩奇/腺病毒受體即CAR（coxsackie/adenovirus receptor）。第12頁(yè)，共271頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)22分，星期四 轉(zhuǎn)錄與復(fù)制腺病毒基因早期產(chǎn)物的主要功能： E1區(qū)基因表達(dá)產(chǎn)物（調(diào)控宿主細(xì)胞，與病毒致癌相關(guān)） E1區(qū)基因進(jìn)一步分為E1A和E1B： E1A蛋白的主要功能是調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝，將感染細(xì)胞帶入DNA復(fù)制周期，細(xì)胞開(kāi)始儲(chǔ)存病毒DNA復(fù)制所需的原料。E1A蛋白

7、還可以激活其他早期基因（E1B、E2A、E2B、E3和E4）的啟動(dòng)子，也可以拮抗干擾素的作用。 第13頁(yè)，共271頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)22分，星期四 E1B蛋白的主要功能是防止細(xì)胞凋亡，調(diào)控晚期基因的表達(dá)。 19K與細(xì)胞Bcl-2基因（抑制細(xì)胞凋亡）的表達(dá)產(chǎn)物同源，可以通過(guò)滅活和清除Bax家族成員來(lái)防止細(xì)胞發(fā)生凋亡或壞死。 E1B 55K基因產(chǎn)物可以下調(diào)p53基因（刺激細(xì)胞凋亡）的轉(zhuǎn)錄水平，當(dāng)然這種調(diào)節(jié)功能不是絕對(duì)的，其他一些腺病毒基因（如E4 orf6）也參與了這一過(guò)程。另外，E1B 55K基因產(chǎn)物干擾細(xì)胞mRNA從細(xì)胞核釋放。第14頁(yè)，共271頁(yè)，2022年，5月20日，14

8、點(diǎn)22分，星期四 E2區(qū)基因表達(dá)產(chǎn)物（復(fù)制相關(guān)蛋白） 可分為E2A和E2B。其中E2A即單鏈DNA結(jié)合蛋白（ssDBP, single-stranded DNA binding proteins）；E2B主要產(chǎn)物有兩種，分別是末端蛋白前體（pTP, precursor terminal protein）和病毒DNA聚合酶（pol）。三種蛋白與至少三種細(xì)胞內(nèi)的因子相互作用，啟動(dòng)腺病毒DNA復(fù)制以及病毒晚期基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程。第15頁(yè)，共271頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)22分，星期四 E3區(qū)基因表達(dá)產(chǎn)物（逃避免疫攻擊） 主要功能是破壞宿主的免疫防御機(jī)制，而與病毒基因組的復(fù)制無(wú)關(guān)。E3基因

9、的產(chǎn)物之一11.6Kd，由于可以在病毒感染的晚期裂解細(xì)胞并釋放病毒顆粒而被稱為腺病毒死亡蛋白（ADP，adenovirus death protein）。gp 19K蛋白可以在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上與MHC-I類(lèi)分子的重鏈結(jié)合阻止其轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞表面，并且可以延緩MHC-I的表達(dá)。RID（receptor internalization and degradation）&以及14.7Kd蛋白可以抑制由TNF（腫瘤壞死因子）誘發(fā)的細(xì)胞凋亡，促進(jìn)Fas（凋亡通道中的一種死亡受體）降解，下調(diào)TNF受體水平。第16頁(yè)，共271頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)22分，星期四 E4區(qū)基因表達(dá)產(chǎn)物 E4區(qū)的基因產(chǎn)物通常被稱

10、為orf 16/7，主要與病毒信使RNA的代謝有關(guān)，還有促進(jìn)病毒DNA復(fù)制以及關(guān)閉宿主蛋白合成的功能。研究發(fā)現(xiàn)，一些E4產(chǎn)物可以誘導(dǎo)一些蛋白酶活性，降解宿主的某些DNA修飾酶，防止病毒DNA發(fā)生串聯(lián)。E4 orf3 VA RNA是一些由腺病毒轉(zhuǎn)錄的非翻譯RNA，為“誘捕”RNA分子，結(jié)合PKR（宿主蛋白激酶），使該蛋白失活，關(guān)閉干擾素的產(chǎn)生。第17頁(yè)，共271頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)22分，星期四 一般而言，DNA的復(fù)制是由RNA啟動(dòng)的，而在腺病毒卻是所謂的蛋白啟動(dòng)。不存在岡崎片段，其DNA復(fù)制可以從任何一端開(kāi)始，甚至兩端同時(shí)進(jìn)行。第18頁(yè)，共271頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)

11、22分，星期四復(fù)制過(guò)程中形成ssDNA的中間形式。53535335535335第19頁(yè)，共271頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)22分，星期四 裝配與釋放 病毒基因組復(fù)制通常在感染后數(shù)小時(shí)開(kāi)始表達(dá)。同時(shí)早期基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯被關(guān)閉，晚期基因開(kāi)始表達(dá)。大部分的晚期基因的轉(zhuǎn)錄是以一個(gè)共同的主要晚期啟動(dòng)子（MLP, Major Late Promoter）調(diào)控的。實(shí)際上MLP的活性與病毒基因組復(fù)制密切相關(guān)，有研究表明一旦腺病毒基因組開(kāi)始復(fù)制，MLP的活性將明顯增強(qiáng)。晚期基因主要編碼腺病毒的結(jié)構(gòu)蛋白。病毒結(jié)構(gòu)蛋白在細(xì)胞核內(nèi)聚集形成病毒衣殼，病毒的基因組被包裝進(jìn)去，形成有感染能力的病毒顆粒。 病毒水解細(xì)

12、胞骨架蛋白K18，使之不能聚合形成中間絲結(jié)構(gòu)，并最終裂解宿主細(xì)胞被釋放出去，完成腺病毒的生活周期。第20頁(yè)，共271頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)22分，星期四三、對(duì)宿主的防衛(wèi)逃逸 從病毒入侵到釋放出新病毒需要2天，較慢，容易受到宿主免疫攻擊。腺病毒1/4基因用于對(duì)付宿主免疫系統(tǒng)。1、防止細(xì)胞凋亡： E1B19K與細(xì)胞Bcl-2基因（抑制細(xì)胞凋亡）的表達(dá)產(chǎn)物同源，可以通過(guò)滅活和清除Bax家族成員來(lái)防止細(xì)胞發(fā)生凋亡或壞死。E1B 55K基因產(chǎn)物可以下調(diào)p53基因（刺激細(xì)胞凋亡）的轉(zhuǎn)錄水平。2、加速病毒釋放： E3基因的產(chǎn)物之一11.6Kd，由于可以在病毒感染的晚期裂解細(xì)胞并釋放病毒顆粒而被稱

13、為腺病毒死亡蛋白（ADP，adenovirus death protein）。第21頁(yè)，共271頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)22分，星期四3、破壞干擾素系統(tǒng)：沒(méi)有囊膜，不刺激干擾素產(chǎn)生；E4 orf3 VA RNA是一些由腺病毒轉(zhuǎn)錄的非翻譯RNA，為“誘捕”RNA分子，結(jié)合PKR（宿主蛋白激酶），使該蛋白失活，關(guān)閉干擾素的產(chǎn)生。（病毒利用DNA基因組的雙鏈進(jìn)行mRNA轉(zhuǎn)錄，會(huì)出現(xiàn)dsRNA）4、躲避殺傷性T細(xì)胞： E3-19K蛋白可以在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上與MHC-I類(lèi)分子的重鏈結(jié)合阻止其轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞表面，并且可以延緩MHC-I的表達(dá)。第22頁(yè)，共271頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)22分，星期四

14、5、躲避天然殺傷細(xì)胞：E3基因編碼的RID蛋白結(jié)合腺病毒感染細(xì)胞的死亡受體（ Fas ），將其從細(xì)胞表面移走，并監(jiān)督其被破壞。作為彌補(bǔ)，E3-14.7K蛋白可以干擾來(lái)自死亡受體的信號(hào)以防RID蛋白出現(xiàn)遺漏。 天然殺傷細(xì)胞和殺傷性T細(xì)胞都有兩種方式殺傷細(xì)胞：通過(guò)其表面的蛋白插入靶細(xì)胞表面的死亡受體，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，殺死靶細(xì)胞； 將顆粒酶注入靶細(xì)胞（還沒(méi)有任何病毒進(jìn)化出對(duì)付顆粒酶的方法）6、利用自己的DNA聚合酶，腺病毒可以產(chǎn)生抗原漂變。第23頁(yè)，共271頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)22分，星期四四、致病性與免疫性 人腺病毒經(jīng)呼吸道和糞口途徑傳播，也可通過(guò)呼吸道或污染物品傳播。病毒在咽、結(jié)膜尤

15、其是小腸上皮細(xì)胞內(nèi)增殖，偶爾波及其他臟器，隱性感染常見(jiàn)。疾病一般為自限性，感染后可獲得長(zhǎng)期持續(xù)的型特異性免疫力，中和抗體損傷作用重要。第24頁(yè)，共271頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)22分，星期四 在病毒性疾病中，有些為自限性感染，即感染后病程較短，隨體內(nèi)病毒被迅速清除而痊愈。如甲型肝炎、戊型肝炎、流行性感冒、流行性腮腺炎、病毒性胃腸炎等等。 有些則為慢性感染，感染后病程長(zhǎng)，病毒能在體內(nèi)較長(zhǎng)期存在，病情呈慢性進(jìn)行性發(fā)展，如慢性乙型肝炎，艾滋病等。 病毒性疾病的病癥與病毒的侵入途徑密切相關(guān)；而與病毒有無(wú)包膜及病毒結(jié)構(gòu)無(wú)明顯關(guān)系。 由口咽途徑侵入的病毒無(wú)論屬RNA或DNA還是有無(wú)包膜，大多為自

16、限性疾病；經(jīng)體液和血液傳播的人類(lèi)病毒性疾病，易形成持續(xù)感染。即使同種病毒由于侵入途徑不同，其病毒感染狀態(tài)也不相同 。第25頁(yè)，共271頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)22分，星期四五、微生物學(xué)檢查 1、病毒分離 自急性期病人咽、直腸、結(jié)膜等處采取標(biāo)本，迅速接種敏感細(xì)胞，根據(jù)特征性細(xì)胞突變及抗原性鑒定病毒。 2、血清學(xué)檢查 取急性期和恢復(fù)期血清進(jìn)行補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)，抗體升高4倍或以上，可判斷為近期感染。六、防治原則 因存在許多健康帶毒者，隔離病人對(duì)防止腺病毒傳播幾乎無(wú)效。疫苗要保證無(wú)致癌危險(xiǎn)。因此，研制高純度的亞單位疫苗是今后的主要任務(wù)。第26頁(yè)，共271頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)22分，

17、星期四第二節(jié) 類(lèi)病毒細(xì)小病毒 細(xì)小病毒科(Parvoviridae)是迄今所知道的最小的一類(lèi)動(dòng)物病毒，只發(fā)現(xiàn)其中少數(shù)病毒能導(dǎo)致有明顯臨床癥狀的傳染病，而大多數(shù)呈潛伏或持續(xù)感染狀態(tài)。該科含有兩個(gè)亞科：細(xì)小病毒亞科（Parvovirinae）和濃病毒亞科（Densovirinae）。其中濃病毒亞科的寄主僅限于無(wú)脊椎動(dòng)物。 第27頁(yè)，共271頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)22分，星期四一、生物學(xué)性狀 細(xì)小病毒粒子為立體對(duì)稱的二十面體，有三種衣殼蛋白，無(wú)包膜，直徑18-25nm。其線狀ssDNA約占整個(gè)病毒粒子重量的2534，分子量為1.41061.7106，沉淀系數(shù)為2327s。細(xì)小病毒對(duì)外界理

18、化因素的抵抗力非常強(qiáng)，在pH3和pH9、56處理60min仍保持穩(wěn)定，卻能被甲醛、羥胺和一些氧化劑所鈍化。細(xì)小病毒幾乎都有凝集紅細(xì)胞的特性，血凝和血凝抑制試驗(yàn)是鑒定本病毒和診斷本病的方法。 第28頁(yè)，共271頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)22分，星期四 這類(lèi)病毒的核酸由于在病毒包裝時(shí)包裝了雙鏈中的一條，因此，不同病毒粒子中的ssDNA極性可能不同?？偟膩?lái)說(shuō)，自主型的病毒中，其核酸傾向于一種類(lèi)型，即與mRNA互補(bǔ)的一類(lèi)；而依賴型的病毒中，兩種極性的核酸各占一定的比例。 第29頁(yè)，共271頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)22分，星期四二、病毒的復(fù)制 這類(lèi)病毒的核酸分子小，信息量極少，復(fù)制時(shí)不

19、得不依賴于細(xì)胞或“輔助病毒”的幫助。據(jù)此可將細(xì)小病毒分為兩類(lèi)： 自主型（autonomous） 缺陷型（defective） 第30頁(yè)，共271頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)22分，星期四 自主型：這類(lèi)病毒只有當(dāng)寄主細(xì)胞處于核酸合成期（S期）才能復(fù)制，因?yàn)榇藭r(shí)細(xì)胞內(nèi)存在有許多細(xì)胞分裂所需的酶可被病毒利用，病毒本身僅僅提供一個(gè)模板核酸。這類(lèi)病毒獨(dú)立地侵入寄主細(xì)胞，不需要輔助病毒，僅憑寄主細(xì)胞的酶即可以復(fù)制，故稱之為自主型。 第31頁(yè)，共271頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)22分，星期四 缺陷型：依賴性病毒屬屬于此類(lèi)。這類(lèi)病毒侵入寄主細(xì)胞后，即使寄主細(xì)胞處于S期也不能復(fù)制，因?yàn)樗鼈內(nèi)鄙倌撤N

20、特異的酶，必須依靠另一種病毒，即輔助病毒（如腺病毒）來(lái)提供，因而成為缺陷型。第32頁(yè)，共271頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)22分，星期四 現(xiàn)以小鼠細(xì)小病毒（Mice minute virus, MMV）代表自主型，腺聯(lián)病毒2型（Adeno-associated virus type2,AAV2）代表缺陷型分述其復(fù)制過(guò)程。 1、基因組的結(jié)構(gòu)特點(diǎn) MMV核酸為5084bp，AAV2核酸為4679bp，在所有細(xì)小病毒ssDNA的3端或5端都有多余100bp甚至300bp的核酸回文序列（palindromic），這些片段可以回折，與自身互補(bǔ)序列形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。MMV的5端和3端序列差異較大，而AA

21、V2的5端和3端序列相互反向重復(fù)，可形成鍋柄樣結(jié)構(gòu)。MMV與AAV2都有兩個(gè)較大的閱讀框（ORF），每個(gè)ORF約占基因組的一半。左側(cè)ORF涉及調(diào)節(jié)功能，右側(cè)ORF涉及編碼結(jié)構(gòu)蛋白。第33頁(yè)，共271頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)22分，星期四2、病毒的復(fù)制 MMV基因組都含有兩個(gè)大的ORF: 第一個(gè)從mp6-mp42（基因圖譜位置，map position, mp），為repORF，編碼兩個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白NS1和NS2。 第二個(gè)從mp45-mp90，為capORF，編碼外殼蛋白。 MMV兩個(gè)ORF各有一個(gè)啟動(dòng)子，分別位于mp4和mp38，均含有TATA盒。在末端mp95-mp96位置為聚腺苷酸

22、信號(hào)（AATAAA）。mp46-mp48是小的內(nèi)含子，mp8-mp38為大的內(nèi)含子。第34頁(yè)，共271頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)22分，星期四ITR 20 40 60 80 ITR rep capNS14.8kbNS23.3kbcap3.0kbP4P38圖8-7 MMV基因組轉(zhuǎn)錄模式細(xì)線中的突出部分代表內(nèi)含子第35頁(yè)，共271頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)22分，星期四 由P4啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的兩個(gè)轉(zhuǎn)錄體分別編碼NS1和NS2，第三個(gè)轉(zhuǎn)錄體由P38啟動(dòng)編碼外殼蛋白。其中NS1和NS2首先合成，它們調(diào)控其他基因的表達(dá)。這兩種蛋白都是磷酸化的，NS1作為反式激活蛋白可激活P4和P38，其功能

23、基團(tuán)位于C端的129為氨基酸殘基。有效的DNA復(fù)制和mRNA翻譯都需要NS2的參與。capORF編碼外殼蛋白Vp1和Vp2，蛋白酶降解Vp2產(chǎn)生主要外殼蛋白Vp3。第36頁(yè)，共271頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)22分，星期四 AAV2基因組也含有兩個(gè)大的閱讀框，有三個(gè)啟動(dòng)子，分別位于mp5、mp19和mp40。轉(zhuǎn)錄出3個(gè)轉(zhuǎn)錄體，進(jìn)一步剪切，編碼4種非結(jié)構(gòu)蛋白和三種外殼蛋白。其中rep78和rep68為位點(diǎn)特異的核酸內(nèi)切酶，參與病毒基因組的復(fù)制及病毒基因組插入寄主細(xì)胞基因組的過(guò)程。rep52和rep40并非病毒基因組復(fù)制所必須，它們主要介導(dǎo)病毒顆粒的組裝。第37頁(yè)，共271頁(yè)，2022年，

24、5月20日，14點(diǎn)22分，星期四 圖8-8 AAV2基因組轉(zhuǎn)錄模式 細(xì)線中的突出部分代表內(nèi)含子 ITR 20 40 60 80 ITR rep caprep 78KD4.2kb rep 68KD3.9kbcap3.6kbP5P40P19 rep 52KD3.3kb rep 40KD2.3kb第38頁(yè)，共271頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)22分，星期四 AAV2在寄主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制需要一些不相關(guān)的輔助病毒，如腺病毒、皰疹病毒等。以腺病毒為例，發(fā)現(xiàn)起輔助作用的腺病毒的早期功能蛋白。腺病毒蛋白E1A對(duì)AAV2基因表達(dá)起反式活化作用；35KDa的E4協(xié)同55KDa的E1B參與調(diào)控AAV2轉(zhuǎn)錄體的運(yùn)輸

25、，E1B在AAV2DNA復(fù)制時(shí)也起重要作用；72KDa的E2A是ssDNA結(jié)合蛋白，可刺激AAV2啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄本向細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)。 第39頁(yè)，共271頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)22分，星期四 MMV和AAV2均在寄主細(xì)胞核內(nèi)復(fù)制，并在細(xì)胞核內(nèi)組裝成病毒粒子。兩者復(fù)制過(guò)程基本類(lèi)似，DNA復(fù)制時(shí)均不需要RNA引物，也不環(huán)化，由于3端形成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生了對(duì)DNA多聚酶作用必須的引物OH。由于病毒基因組是單鏈，復(fù)制過(guò)程中存在RF。AAV2復(fù)制過(guò)程如下：其3端ITR形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)為DNA的復(fù)制提供起始引物，復(fù)制沿著親本鏈一直延伸到5端，完全復(fù)制親本鏈需要產(chǎn)生一個(gè)新的3OH，此時(shí)病毒編碼的點(diǎn)位點(diǎn)

26、特異的核酸內(nèi)切酶Rep78和Rep68在箭頭所示處，即末端分解位（terminal resolution site）切開(kāi)親本鏈，由此處繼續(xù)延伸，合成復(fù)制中間體。此時(shí)親本鏈的 3端為新合成的鏈，這樣親本鏈的ITR與開(kāi)始不同，但互補(bǔ)。新合成的3端又可以形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)引導(dǎo)新一輪的DNA 復(fù)制，這樣可以產(chǎn)生一個(gè)新的基因組DNA和一個(gè)沒(méi)有復(fù)制完的含雙鏈信息的DNA，再經(jīng)過(guò)位點(diǎn)特異的核酸內(nèi)切酶作用，可繼續(xù)復(fù)制。 第40頁(yè)，共271頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)22分，星期四 三、AAV的潛伏感染 在沒(méi)有輔助病毒共同侵染的條件下，AAV DNA可以整合到寄主細(xì)胞染色體中，建立潛伏感染，以后又可被輔助病毒的

27、侵染所活化，進(jìn)入復(fù)制循環(huán)。AAV的潛伏感染相當(dāng)普遍，在20%的非洲綠猴腎和1%-2%的人胚胎細(xì)胞中可檢測(cè)到。AAV2的ssDNA進(jìn)入寄主細(xì)胞后，必須復(fù)制成雙鏈形式才可以整合至染色體。這需要P5啟動(dòng)子啟動(dòng)少量的基因轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生rep78和rep68，它們一方面參與基因整合，另一方面也抑制了AAV2三個(gè)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。盡管整合沒(méi)有嚴(yán)格的特異性，但70%-100%的整合都發(fā)生在人染色體19q13.3-qter，且一般是幾個(gè)病毒基因組首尾相連。第41頁(yè)，共271頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)22分，星期四第三節(jié) 類(lèi)病毒呼腸孤病毒 呼腸孤病毒科，Reoviridae的命名，是由respiratory e

28、nteric orphan virus各取其第一個(gè)字母而來(lái)。20世紀(jì)60年代初，曾從人和動(dòng)物的呼吸道或腸道中分離出這類(lèi)病毒，當(dāng)時(shí)對(duì)它的致病作用不清楚，所以稱它為呼吸道(R)、腸道(E)，孤兒(O)病毒，簡(jiǎn)稱呼腸孤病毒?，F(xiàn)在這一命名已失去其本來(lái)涵義，因?yàn)楹髞?lái)發(fā)現(xiàn)有些病毒雖與它有共同的基本特點(diǎn)，但與呼吸道或腸道無(wú)關(guān)。本科病毒分布極廣，包括能感染人、脊椎動(dòng)物、昆蟲(chóng)、植物、真菌的12個(gè)屬。其中能使人、畜致病的主要成員有：輪狀病毒、雞傳染性法氏囊病病毒、羊藍(lán)舌病病毒、非洲馬瘟病病毒等。第42頁(yè)，共271頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)22分，星期四 一、生物學(xué)性狀 本科病毒的病毒粒呈球形，大小在608

29、0nm之間，根據(jù)形態(tài)學(xué)分析它是一個(gè)二十面體的結(jié)構(gòu)，有多層衣殼，如人輪狀病毒有三層，都沒(méi)有囊膜。氯化銫中浮力密度為1.311.38g/mL；具有線性分節(jié)段的雙鏈RNA基因組，可分為10條、11條和12條，因?qū)俣?。dsRNA的正鏈5端有“帽子”結(jié)構(gòu)，負(fù)鏈5端為磷酸化結(jié)構(gòu)，其3均沒(méi)有polyA結(jié)構(gòu)。病毒中含有依賴于RNA的多聚酶。第43頁(yè)，共271頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)22分，星期四 利用血清學(xué)方法，輪狀病毒被分為7個(gè)不同的組A-G （ Vp6 ），A、B、C三組常見(jiàn)于人和動(dòng)物，引起嬰幼兒腹瀉的為A組，感染青壯年的為B組，散發(fā)病例為C組，其中B組僅在中國(guó)引起爆發(fā)流行。D、E、F、G目前

30、僅見(jiàn)于動(dòng)物。每組內(nèi)又有不同的血清型，針對(duì)外殼蛋白Vp7已鑒定出至少14種Vp7血清型。在同一組中，可發(fā)生基因重配，不同組之間不可能發(fā)生。 輪狀病毒對(duì)理化因子的作用有較強(qiáng)的抵抗力。病毒經(jīng)乙醚、氯仿、反復(fù)凍融、超聲、371小時(shí)或室溫（25）24小時(shí)等處理，仍具有感染性。該病毒耐酸、堿、在pH3.510.0之間都具有感染性。95%的乙醇是最有效的病毒滅活劑，56加熱30分鐘也可滅活病毒。第44頁(yè)，共271頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)22分，星期四 1、病毒顆粒 電鏡下可見(jiàn)到三種類(lèi)型的輪狀病毒顆粒結(jié)構(gòu)。第一類(lèi)為有感染性，具三層衣殼的病毒顆粒，含衣殼蛋白Vp1、Vp2、Vp3、Vp4、Vp6和Vp

31、7；第二類(lèi)為沒(méi)有外殼的雙層顆粒，直徑70nm，無(wú)感染性，表面粗糙，不含Vp4和Vp7；第三類(lèi)僅有內(nèi)殼，直徑50-50.5nm，無(wú)感染性，含有Vp1、Vp2和Vp3。完整的病毒顆粒直徑約75nm，具有輻條狀結(jié)構(gòu)和一個(gè)非常清晰的平滑周邊，酷似車(chē)輪，輪狀病毒因此而得名。 Vp7是三聚體，構(gòu)成毒粒的外衣殼。Vp4是二聚體，形成長(zhǎng)20nm、末端為叉狀嘴唇形的突起，從中衣殼通過(guò)外衣殼的孔洞伸出粒子表面。Vp6三聚體構(gòu)成中衣殼，又與構(gòu)成內(nèi)衣殼的Vp2相互作用。第45頁(yè)，共271頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)22分，星期四 核心中含有11條dsRNA，按分子量從大到小進(jìn)行排列，分別編碼12種蛋白質(zhì)，6種結(jié)

32、構(gòu)蛋白和6種非結(jié)構(gòu)蛋白。去除蛋白質(zhì)的dsRNA無(wú)侵染性，在5端和3端都有一段非翻譯區(qū)，兩端都有呼腸孤病毒科病毒特有的保守序列。第46頁(yè)，共271頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)22分，星期四第47頁(yè)，共271頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)22分，星期四2、病毒編碼蛋白質(zhì)的特性及其功能基因片 段蛋 白產(chǎn) 物分子量KDa顆粒中的位置修飾加工顆粒中的分子數(shù)功能1Vp1125內(nèi)衣殼RNA聚合酶2Vp294-102內(nèi)衣殼裂解120與RNA結(jié)合3Vp388內(nèi)衣殼鳥(niǎo)苷轉(zhuǎn)移酶4Vp4Vp5Vp8886028外衣殼Vp4裂解120（二聚體）血凝素、中和抗原、細(xì)胞附著、毒力、蛋白質(zhì)分解可強(qiáng)化侵染性、強(qiáng)化穿入

33、細(xì)胞5NSP1(NS53)53非結(jié)構(gòu)蛋 白鋅指結(jié)構(gòu)、微堿性、結(jié)合RNA6Vp641中衣殼780（260殼粒）疏水性、三聚體、組抗原7NSP2(NS34)34非結(jié)構(gòu)蛋白結(jié)合RNA、微酸8NSP3(NS35)35非結(jié)構(gòu)蛋白堿性、與RNA結(jié)合9Vp738外衣殼有裂解信號(hào)序列、高甘露糖、糖基化780（260殼粒）三聚體、插入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、中和抗原、N端有兩個(gè)疏水區(qū)10NSP4(NS28)28-29非結(jié)構(gòu)蛋白無(wú)裂解信號(hào)序列、高甘露糖、糖基化插入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、N端有三個(gè)疏水區(qū)、病毒顆粒裝配中起作用11NSP5(NS26)26非結(jié)構(gòu)蛋白磷酸化O-連接糖基化微堿性、富含絲氨酸和蘇氨酸、結(jié)合RNA第48頁(yè)，共271頁(yè)，

34、2022年，5月20日，14點(diǎn)22分，星期四 Vp4-第四條dsRNA編碼，組成外衣殼蛋白，非糖基化。其主要功能有： 有凝集素活性； 與寄主細(xì)胞受體結(jié)合； 可裂解為分子量分別為60KDa的Vp5和28KDa 的Vp8，強(qiáng)化病毒的侵染力； 可誘導(dǎo)體內(nèi)中和抗體； 在小鼠和小豬體內(nèi)，Vp4是病毒毒力的決定簇。動(dòng)物輪狀病毒的Vp4有776個(gè)氨基酸組成，而人類(lèi)的為775個(gè)。建立了依賴Vp4的病毒血清型（P血清型），其型特異性位點(diǎn)位于第84-180位氨基酸之間。第49頁(yè)，共271頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)22分，星期四 Vp6主要結(jié)構(gòu)蛋白之一，組成中衣殼，占病毒顆粒的51%，由第六條dsRNA編碼

35、?？赏瑫r(shí)與外衣殼的Vp7、Vp4和內(nèi)衣殼的Vp2相互作用，因此，對(duì)維持顆粒形態(tài)起重要作用。Vp6為三聚體，非常穩(wěn)定，且大多數(shù)的輪狀病毒株系的Vp6有保守的抗原決定簇，是檢測(cè)的主要靶抗原。Vp6與病毒內(nèi)依賴RNA的聚合酶活性相關(guān)，但本身并不具備酶活性，除去Vp6則聚合酶失活。Vp6為疏水蛋白，有高度的免疫原性，但并不知道它是否象Vp4那樣可誘導(dǎo)體內(nèi)的保護(hù)免疫反應(yīng)。Vp6含有一個(gè)共同的（交叉反應(yīng)性的）表位，稱為組抗原（A-G），定位于第48-75位氨基酸之間。第50頁(yè)，共271頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)22分，星期四 Vp7外衣殼的主要構(gòu)成蛋白，占病毒顆粒的30%，富含N-連接甘露寡糖的糖

36、蛋白，由第九條dsRNA編碼。Vp7有326個(gè)氨基酸，N端有可裂解的信號(hào)序列。正是這個(gè)信號(hào)序列引導(dǎo)Vp7插入細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜。裂解點(diǎn)在N端第51位的Gln(谷氨酸)。插入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜靠?jī)蓚€(gè)疏水序列，分別位于51-61和61-110的氨基酸。Vp7一旦插入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，既被保護(hù)不受內(nèi)切酶降解，Vp7(glycoprotein)也是重要的中和作用抗原，并依此決定病毒的血清型（G1-G14血清型）。第51頁(yè)，共271頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)22分，星期四 NSP4成熟的、帶寡糖的糖基化的NSP4分子量為28KDa，N-連接甘露寡糖，第十條dsRNA編碼。在N端有三個(gè)疏水功能域，可以穿過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，N端保

37、留在膜內(nèi)，而親水的C端伸到細(xì)胞質(zhì)中，是與亞病毒顆粒（Vp6）結(jié)合的受體，從而使亞病毒顆粒在裝配過(guò)程中能通過(guò)芽生進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，NSP4的受體結(jié)合位點(diǎn)在161-175位氨基酸之間。NSP4蛋白是一個(gè)十分保守的蛋白，比較不同來(lái)源輪狀病毒毒株的NSP4，發(fā)現(xiàn)它們的同源性在87.3%-96.6%。第52頁(yè)，共271頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)22分，星期四 二、病毒的復(fù)制 有關(guān)輪狀病毒復(fù)制的研究主要在猴腎傳代細(xì)胞中進(jìn)行，病毒的復(fù)制過(guò)程全部在包漿內(nèi)進(jìn)行。 病毒通過(guò)與細(xì)胞表面特異的受體結(jié)合（可能存在兩種不同的受體），再以胞飲或直接的方式進(jìn)入細(xì)胞，在溶酶體內(nèi)完成外衣殼的降解，形成亞病毒顆粒，具有中層和內(nèi)

38、層，此時(shí)既開(kāi)始轉(zhuǎn)錄。 第53頁(yè)，共271頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)22分，星期四 在細(xì)胞質(zhì)液體中解開(kāi)dsRNA很困難，而亞病毒顆粒內(nèi)并非液體，dsRNA很容易解開(kāi)，轉(zhuǎn)錄的mRNA通過(guò)雙層衣殼上的小孔進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。第54頁(yè)，共271頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)22分，星期四 病毒轉(zhuǎn)錄子的合成是在一種病毒攜帶的依賴RNA的RNA多聚酶催化下進(jìn)行，轉(zhuǎn)錄為非對(duì)稱，所有的轉(zhuǎn)錄子都是從負(fù)鏈脫下的全長(zhǎng)正鏈RNA。該正鏈RNA一方面作為蛋白翻譯的模板，另一方面也是合成子代負(fù)鏈RNA的模板。 負(fù)鏈RNA的合成也是在亞病毒顆粒中進(jìn)行，細(xì)胞中沒(méi)有游離的病毒dsRNA存在。這些亞病毒顆粒在細(xì)胞內(nèi)或無(wú)細(xì)胞系

39、統(tǒng)中均是雙鏈RNA的合成產(chǎn)所，是由Vp1和 Vp2、以及少量的Vp6、大量的非結(jié)構(gòu)蛋白NSP3和較小量的NSP1和NSP2等蛋白質(zhì)組成的復(fù)制酶的復(fù)合物。第55頁(yè)，共271頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)22分，星期四第56頁(yè)，共271頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)22分，星期四 大部分的輪狀病毒蛋白是在游離的核糖體上合成，而Vp7 和Vp4是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的核糖體合成，合成后嵌入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜。輪狀病毒形態(tài)發(fā)生過(guò)程中最顯著的特征是在細(xì)胞漿病毒質(zhì)中裝配的亞病毒顆粒（含兩層衣殼）向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜芽生，在成熟過(guò)程中，病毒顆粒獲得一過(guò)性的包膜。當(dāng)病毒向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)部移動(dòng)時(shí)，輪狀病毒失去這種一過(guò)性獲得的包膜，取而代之

40、的是一層薄的蛋白層，這層蛋白層最后組裝成病毒顆粒的外衣殼，含Vp7 和Vp4。第57頁(yè)，共271頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)22分，星期四三、對(duì)宿主防衛(wèi)的逃逸1、這種“躲在衣殼中復(fù)制”的方法幫組輪狀病毒逃避宿主細(xì)胞的干擾素防疫系統(tǒng)，為病毒的繁殖和傳播贏得時(shí)間。2、輪狀病毒復(fù)制快，“打了就跑”，在獲得性免疫系統(tǒng)發(fā)揮作用前，大量病毒已通過(guò)糞便排除。3、輪狀病毒感染后通常不會(huì)對(duì)后續(xù)感染產(chǎn)生完全的免疫力，免疫系統(tǒng)僅僅對(duì)輪狀病毒“掃了一眼”。即便有記憶力，輪狀病毒可通過(guò)無(wú)癥狀患者糞便排除，擴(kuò)大感染。第58頁(yè)，共271頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)22分，星期四 四、致病性與免疫性 人類(lèi)輪狀病毒

41、感染常見(jiàn)于6個(gè)月2歲的嬰幼兒，主要在冬季流行，一般通過(guò)糞-口途徑傳播。病毒侵犯小腸細(xì)胞的絨毛，潛伏期24天。病毒在胞漿內(nèi)增殖，受損細(xì)胞可脫落至腸腔而釋放大量病毒，并隨糞便排出。病人最主要的癥狀是腹瀉，其原因可能是病毒增殖影響了細(xì)胞的搬運(yùn)功能，妨礙鈉和葡萄糖的吸收，也可以是刺激了小腸內(nèi)的腸道神經(jīng)系統(tǒng)受體。嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致脫水和電解質(zhì)平衡紊亂，如不及時(shí)治療，可能危及生命。感染后血液中很快出現(xiàn)特異性lgM、lgG抗體，腸道局部出現(xiàn)分泌型lgA，可中和病毒，對(duì)同型病毒感染有作用。一般病例病程35天，可完全恢復(fù)。隱性感染產(chǎn)生特異性抗體。第59頁(yè)，共271頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)22分，星期四 五、

42、微生物學(xué)診斷 傳統(tǒng)的方法是對(duì)腹瀉糞便液直接作電鏡或免疫電鏡檢查，但耗時(shí)較長(zhǎng)，且由于設(shè)備上的限制，較難普遍應(yīng)用。世界衛(wèi)生組織已將ELISA雙抗體夾心法（檢測(cè)病毒抗 ）列為診斷輪狀病毒感染的標(biāo)準(zhǔn)方法，目前國(guó)內(nèi)外均有相應(yīng)試劑盒出售。此外核酸電泳和核酸雜交已漸成常規(guī)技術(shù)，在診斷、鑒別診斷及分子流行病學(xué)研究中發(fā)揮重要作用。第60頁(yè)，共271頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)22分，星期四 六、防治原則 重視飲用水衛(wèi)生，并注意防止醫(yī)源性傳播，醫(yī)院內(nèi)應(yīng)嚴(yán)格做好嬰兒病區(qū)及產(chǎn)房的嬰兒室消毒工作。目前尚無(wú)特異有效治療藥物，主要是補(bǔ)液，維持機(jī)體電解質(zhì)平衡。國(guó)外曾有報(bào)道輪狀病毒活疫苗可使兒童獲得保護(hù)，國(guó)內(nèi)活疫苗正在研

43、制之中。第61頁(yè)，共271頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)22分，星期四第四節(jié) 類(lèi)病毒冠狀病毒 冠狀病毒科（Coronaviridae）包括： 冠狀病毒屬（Coronavirus）和環(huán)形病毒屬（Torovirus）。 冠狀病毒屬依據(jù)其基因組和抗原性的特點(diǎn)，分為三組：第1組和第2組為哺乳動(dòng)物的病毒，第3組為鳥(niǎo)的病毒。冠狀病毒科成員具有囊膜，大多數(shù)病毒的宿主范圍較窄，只能感染一種或幾種親緣關(guān)系較近的動(dòng)物細(xì)胞，冠狀病毒的宿主范圍與病毒特異的細(xì)胞受體有關(guān)。第62頁(yè)，共271頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)22分，星期四 SARS（Severe Acute Respiratory Syndrome，

44、SARS）又稱嚴(yán)重急性呼吸綜合癥，是一種新的威脅人類(lèi)健康的呼吸系統(tǒng)烈性傳染病，2002年11月在中國(guó)廣東發(fā)現(xiàn)首例SARS病人，此后疫情蔓延30多個(gè)國(guó)家和地區(qū)，有8000多人感染，800多人死亡，引起全球關(guān)注。世界衛(wèi)生組織(WHO)確認(rèn)引起該病的是嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARSCoV，SCoV)，冠狀病毒屬的一個(gè)新成員，是第一個(gè)可以引起人類(lèi)嚴(yán)重疾病的冠狀病毒。第63頁(yè)，共271頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)22分，星期四一、生物學(xué)性狀 成熟的冠狀病毒顆粒直徑60-220nm不等，其形態(tài)學(xué)上最顯著

45、的 特征是病毒被膜處有明顯的棒狀膜外粒子，酷似中世紀(jì)歐洲帝王的王冠。病毒粒子中不包含RNA聚合酶，但存在少量蛋白激酶，這種蛋白激酶究竟是由病毒還是宿主編碼，目前尚不清楚。第64頁(yè)，共271頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)22分，星期四 病毒有囊膜，膜上有三種結(jié)構(gòu)糖蛋白： 刺突蛋白S（spike glycoprotein）； 膜蛋白M（membrane glyprotein）； 小分子外膜蛋白E（small envelope glycoprotein）。在部分病毒囊膜上還能找到血凝素酯酶HE（hemagglutinin acetylesterase glycoprotein）。 第65頁(yè)，共2

46、71頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)22分，星期四 核酸為無(wú)節(jié)段（+）ssRNA，長(zhǎng)約2731kb，在所有的RNA病毒中，冠狀病毒的基因組最大。為多順?lè)醋咏Y(jié)構(gòu)，其基因組5端有帽子結(jié)構(gòu)，3端有poly(A)尾，可以作為翻譯模板，具傳染性。緊接帽子結(jié)構(gòu)之后是60-80個(gè)堿基的先導(dǎo)RNA序列和200-500個(gè)堿基的非編碼區(qū)。病毒基因組包含6-12個(gè)ORFs，在各個(gè)ORF之間有基因重疊區(qū)或基因間隔序列(intergenic sequence)。 冠狀病毒的復(fù)制酶（依賴RNA的RNA聚合酶，解旋酶，蛋白酶）由基因組5端的占2/3-3/4的兩個(gè)大閱讀框（ORF1a和1b）（即基因1）編碼。通過(guò)核糖體翻譯

47、移框的機(jī)制，產(chǎn)生兩個(gè)多肽前體：pp1ab和pp1a。其它結(jié)構(gòu)蛋白主要位于基因組3端。第66頁(yè)，共271頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)22分，星期四 在所有冠狀病毒基因組中，聚合酶基因和3種結(jié)構(gòu)蛋白基因的排列次序均相同，即5-Pol-S-M-N-3，其他非結(jié)構(gòu)蛋白的排列次序依不同的冠狀病毒種類(lèi)而有明顯的差異。第67頁(yè)，共271頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)22分，星期四 冠狀病毒轉(zhuǎn)錄的亞基因組mRNA間具有套式（nested）的結(jié)構(gòu)特征和一段共同的3端列。除最小的亞基因組mRNA外，其余mRNA均含有兩部分內(nèi) 容，即自身基因和3下游其它蛋白基因，但僅翻譯自身蛋白基因。這些亞基因組mRNA

48、的5端均帶有一段來(lái)自于基因組5最前端的保守引導(dǎo)序列，該引導(dǎo)序列對(duì)病毒基因的表達(dá)有很強(qiáng)的順式作用。 在SARS-CoV中，每個(gè)基因之間均有一段轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列（TRS）：5-UCUAAAC-3。通過(guò)該段序列與轉(zhuǎn)錄酶和細(xì)胞因子的相互作用，將一段72nt的基因組5最前端的保守引導(dǎo)序列與每個(gè)ORF相連。第68頁(yè)，共271頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)22分，星期四第69頁(yè)，共271頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)22分，星期四 結(jié)構(gòu)蛋白中，S蛋白為伸出被膜外的棒球形糖蛋白，在病毒表面以三聚體形式存在。其主要功能為： 結(jié)合細(xì)胞受體； 觸發(fā)病毒被膜與細(xì)胞質(zhì)膜或內(nèi)吞體膜融合； 可誘導(dǎo)細(xì)胞間的融合； 誘發(fā)機(jī)

49、體產(chǎn)生中和抗體。 第70頁(yè)，共271頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)22分，星期四 M蛋白主要負(fù)責(zé)病毒顆粒的組裝，功能為： 決定病毒的形態(tài)發(fā)生； 病毒裝配時(shí)選擇S蛋白； 結(jié)合N（核衣殼磷蛋白）蛋白； 病毒裝配時(shí)專一地選擇病毒基因組RNA。 第71頁(yè)，共271頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)22分，星期四 E蛋白也是病毒表面的一種糖蛋白，數(shù)量相對(duì)較少，它與M蛋白相互作用，決定病毒粒子的出芽位點(diǎn)。 HE僅存在與少數(shù)冠狀病毒表面，以二硫鍵連接的同源二聚體形式存在，可能與病毒引起的病理相關(guān)。 N蛋白（核衣殼磷蛋白）位于囊膜內(nèi)，與RNA結(jié)合形成核衣殼，其功能為： 包裹基因組RNA形成螺旋對(duì)稱的核衣殼

50、； 在裝配過(guò)程中結(jié)合M蛋白； 病毒mRNA翻譯的增強(qiáng)子。第72頁(yè)，共271頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)22分，星期四 三種非結(jié)構(gòu)蛋白為病毒復(fù)制所必需：1、依賴RNA的RNA聚合酶（RDRP）功能為： 轉(zhuǎn)錄病毒負(fù)鏈基因組RNA； 轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)蛋白mRNA； 復(fù)制病毒基因組RNA。2、解旋酶打開(kāi)RNA的雙螺旋。3、3CLpro蛋白酶負(fù)責(zé)上述兩種酶的加工成熟。第73頁(yè)，共271頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)22分，星期四 SARS冠狀病毒基因組全長(zhǎng)29.7kb，有14個(gè)開(kāi)放閱讀框架，缺乏HE蛋白。其基因組的2/3區(qū)域編碼病毒復(fù)制相關(guān)酶（5端），1/3區(qū)域依次編碼S蛋白、E蛋白、M蛋白和N蛋白等

51、4個(gè)病毒結(jié)構(gòu)蛋白（3端），及包含5-9個(gè)在已有蛋白數(shù)據(jù)序列庫(kù)中找不到任何同源序列的未知蛋白的ORF。第74頁(yè)，共271頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)22分，星期四 SARS-CoV比其他冠狀病毒更穩(wěn)定。在室溫下，可在糞便和尿液中穩(wěn)定存在1-2天，在腹瀉病人的大便中（pH較高）可存活4天以上。然而，56加熱90min或75加熱30min就能滅活SARS-CoV，應(yīng)用含氯消毒劑和過(guò)氧乙酸，按衛(wèi)生部推薦的濃度，在幾分鐘內(nèi)完全可以殺滅糞便和尿液中的SARS-CoV，紫外線也可以殺滅SARS-CoV。第75頁(yè)，共271頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)22分，星期四二、病毒的復(fù)制 冠狀病毒的整個(gè)復(fù)制

52、周期在寄主細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行。 入侵：首先病毒表面的S蛋白與寄主細(xì)胞表面專一的受體結(jié)合，然后通過(guò)兩種途徑進(jìn)入細(xì)胞，一種是受體介導(dǎo)的內(nèi)吞，另一種為病毒與寄主細(xì)胞的質(zhì)膜融合。SARSCoV 的受體有兩種，ACE2蛋白與血管緊張肽轉(zhuǎn)化酶（angiotensin-converting enzyme，ACE）同源，為SARS冠狀病毒的受體。氨基肽酶N(aminopeptidase N,APN)也是SARSCoV的受體之一。第76頁(yè)，共271頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)22分，星期四 冠狀病毒成熟的顆粒中并不存在RNA病毒復(fù)制所必須的RNA聚合酶，因此，它進(jìn)入寄主細(xì)胞以后，首先以病毒基因組RNA為模板，利

53、用寄主細(xì)胞的蛋白質(zhì)翻譯系統(tǒng)，表達(dá)病毒RNA聚合酶。然后利用該酶，完成負(fù)鏈基因組RNA的轉(zhuǎn)錄合成、各級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白mRNA的合成、以及病毒基因組RNA的復(fù)制。 冠狀病毒各個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白的成熟mRNA的合成，不存在轉(zhuǎn)錄后的修飾剪切過(guò)程，而是直接通過(guò)RNA聚合酶和一些轉(zhuǎn)錄因子，以一種“不連續(xù)轉(zhuǎn)錄”（discontinuous transcription）的機(jī)制，通過(guò)識(shí)別特定的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列（transcription regulating sequences, TRS），有選擇性的從負(fù)義鏈RNA上，一次性轉(zhuǎn)錄得到構(gòu)成一個(gè)成熟mRNA的全部組成部分。第77頁(yè)，共271頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)22分，星

54、期四 冠狀病毒的顆粒組裝發(fā)生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體的區(qū)域。組裝時(shí)，N蛋白包裹基因組RNA形成螺旋型的核衣殼，然后M蛋白通過(guò)與N蛋白的結(jié)合并識(shí)別基因組上的包裝信號(hào)序列啟動(dòng)病毒囊膜的組裝，E蛋白和S蛋白則通過(guò)與M蛋白的相互作用整合入病毒顆粒。在高爾基體內(nèi)加工形成包內(nèi)體樣結(jié)構(gòu)，以胞吐方式釋放到細(xì)胞外，感染新的寄主。第78頁(yè)，共271頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)22分，星期四 冠狀病毒的復(fù)制和成熟第79頁(yè)，共271頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)22分，星期四三、SARS-CoV致病性與免疫性 SARS-CoV可感染多個(gè)組織器官，包括：肺、脾、腸道、氣管、淋巴結(jié)、腎等，特別是肺部，并造成損傷。引發(fā)

55、肺部損傷機(jī)制為過(guò)強(qiáng)的自身免疫反應(yīng)，大規(guī)模免疫細(xì)胞的激活，會(huì)破壞正常的細(xì)胞和組織。SARS患者出現(xiàn)發(fā)燒、咳嗽及快速進(jìn)展的呼吸系統(tǒng)衰竭，同時(shí)伴隨寒顫、肌肉疼痛、淋巴細(xì)胞減少等癥狀，嚴(yán)重時(shí)，患者死亡。同時(shí)，患者體內(nèi)產(chǎn)生SARS-CoV專一性的抗體，一般7天后出現(xiàn)IgM，10天達(dá)到高峰，15天左右下降；IgG在10天后產(chǎn)生，20天左右達(dá)到高峰。SARS-CoV的潛伏期平均為6.4天。 SARS-CoV主要以近距離飛沫傳播為主，同時(shí)可通過(guò)手接觸呼吸道分泌物經(jīng)口、鼻、眼傳播。也可能存在糞口傳播等其它傳播途徑的可能性。該病毒對(duì)溫度很敏感，在33時(shí)生長(zhǎng)良好，但35就使之受到抑制。由于這個(gè)特性，冬季和早春是該病

56、毒疾病的流行季節(jié)。第80頁(yè)，共271頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)22分，星期四四、微生物學(xué)診斷 目前SARS-CoV的診斷方法主要有4類(lèi)：臨床表現(xiàn)及排除性診斷、影像學(xué)診斷、血清學(xué)抗體診斷和病毒學(xué)診斷。 ELISA診斷中，主要應(yīng)用針對(duì)SARS-CoV 結(jié)構(gòu)蛋白的特異性多抗或單抗，特別是針對(duì)S蛋白的特異性抗體，在發(fā)病早期進(jìn)行診斷。通過(guò)電鏡觀察和RT-PCR技術(shù)也能對(duì)病毒進(jìn)行鑒定。第81頁(yè)，共271頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)22分，星期四五、防治原則 病毒對(duì)熱敏感，紫外線、來(lái)蘇水及0.1%過(guò)氧乙酸等都可在短時(shí)間內(nèi)將病毒殺死。目前，冠狀病毒的血清型和抗原變異性還不明確。冠狀病毒可以發(fā)生重

57、復(fù)感染，表明其存在有多種血清型（至少有4種已知）并有抗原的變異，其免疫較困難，目前尚無(wú)特異的預(yù)防和治療藥物?？梢酝ㄟ^(guò)非特異性預(yù)防措施（即預(yù)防春季呼吸道傳染疾病的措施，如保暖、洗手、通風(fēng)、勿過(guò)度疲勞及勿接觸病人，少去人多的公共場(chǎng)所，及時(shí)隔離病人等）進(jìn)行預(yù)防。第82頁(yè)，共271頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)22分，星期四 六、細(xì)胞培養(yǎng)及動(dòng)物模型 病毒分離是診斷病毒感染的重要方法?？梢酝ㄟ^(guò)細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)來(lái)自SARS病例樣本(如呼吸道分泌物、血液或糞便)中的病毒進(jìn)行分離。與其它冠狀病毒相比，SARS-CoV的分離相對(duì)容易。目前發(fā)現(xiàn)，SARS-CoV可在非洲綠猴腎傳代細(xì)胞(VeroE6)、人宮頸癌傳代細(xì)

58、胞(Hela)、狗腎傳代細(xì)胞(MDCK)、腫瘤橫紋肌傳代細(xì)胞(RD)、人胚肺傳代細(xì)胞(2BS)、人胚腎傳代細(xì)胞(HEK293)等多種組織細(xì)胞中增殖并引起細(xì)胞病變，但以VeroE6細(xì)胞最為敏感。細(xì)胞培養(yǎng)陽(yáng)性結(jié)果是人體內(nèi)存在SARS-CoV的可靠證據(jù)，說(shuō)明患者現(xiàn)在或最近受到SARS-CoV的感染。第83頁(yè)，共271頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)22分，星期四 目前SARS的研究主要集中在致病機(jī)制、抗SARS疫苗和藥物的制備方面，這些研究的基礎(chǔ)有賴于SARS動(dòng)物模型的發(fā)展，SARS動(dòng)物模型應(yīng)該符合以下標(biāo)準(zhǔn)：被SARS-CoV感染的動(dòng)物表現(xiàn)出類(lèi)似SARS患者的癥狀和體征;從實(shí)驗(yàn)感染的動(dòng)物體內(nèi)可分離

59、到病毒；動(dòng)物體內(nèi)存在針對(duì)病毒感染的特異的免疫反應(yīng)；活檢和尸檢顯示出動(dòng)物具有SARS患者一樣的病理特征。 至今，SARS動(dòng)物模型包括非人靈長(zhǎng)類(lèi)、雪貂、貓、鼠等，然而這些動(dòng)物很少能夠模擬出可靠的SARS患者的呼吸癥狀。他們大多數(shù)只符合上述一部分條件。第84頁(yè)，共271頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)22分，星期四七、 SARS-CoV的疫苗研制1、正在研制的疫苗：治療性疫苗（抗體）滅活病毒疫苗病毒樣顆粒（VLP）疫苗核酸疫苗（基于S蛋白和N蛋白）多表位疫苗2、存在問(wèn)題： RNA病毒多變對(duì)疫苗研發(fā)的挑戰(zhàn) 動(dòng)物模型問(wèn)題 第85頁(yè)，共271頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)22分，星期四抗體依賴性感染

60、增強(qiáng)（antibody-dependent enhancement, ADE ）的問(wèn)題 一般來(lái)說(shuō)，機(jī)體產(chǎn)生的病毒抗體或者對(duì)病毒有中和或抵抗作用，或者是一些無(wú)中和作用的抗體，但近年來(lái)相繼在人免疫缺陷病毒（HIV）、流感病毒（IV）、貓感染性腹膜炎病毒（FIPV）、登革病毒（DV）等病毒中發(fā)現(xiàn)了一種現(xiàn)象，這些病毒的抗體滴度在低水平或高水平時(shí)對(duì)病毒存在中和作用，而在中度水平或亞中和滴度水平時(shí)（稱為感染增強(qiáng)抗體）與病毒形成病毒-抗體復(fù)合物，能明顯增強(qiáng)Fc受體（FcR）或補(bǔ)體受體（CR）陽(yáng)性細(xì)胞對(duì)該種病毒感染，從而引起疾病，這種現(xiàn)象稱為抗體依賴的病毒感染增強(qiáng)作用（ADE）。其中貓感染性腹膜炎病毒（FIP