中藥指紋圖譜研究課件

1、中藥指紋圖譜研究 指紋圖譜(fingerprint)系指某種中藥材或中藥制劑，經(jīng)適當(dāng)處理后采用一定的分析手段得到的、能表示該樣品特征的色譜、光譜或其它圖譜。一、為什么要研究中藥指紋圖譜（一）中藥質(zhì)量分析的現(xiàn)狀質(zhì)量穩(wěn)定的原料是生產(chǎn)質(zhì)量穩(wěn)定的產(chǎn)品的先決條件。中藥材絕大部分來(lái)源于生物，包括植物藥和動(dòng)物藥。中藥活性成分大部分為生物體內(nèi)次生代謝產(chǎn)物，少數(shù)為初生代謝產(chǎn)物。 產(chǎn)地、氣候、生態(tài)環(huán)境、栽培或養(yǎng)殖技術(shù)、產(chǎn)地加工、炮制方法等對(duì)中藥材的化學(xué)成分影響很大。 目前大部分中藥的有效成分未被闡明或僅部分闡明。 隨著現(xiàn)代科學(xué)手段引入到中藥的品質(zhì)研究中，通過(guò)利用植物學(xué)，植物化學(xué)，分析化學(xué)以及藥理學(xué)等相關(guān)學(xué)科的研究

2、方法，開(kāi)辟了中藥品質(zhì)評(píng)價(jià)的新天地。 中藥的質(zhì)量研究發(fā)展到普遍采用色譜學(xué)手段，分析中藥材或中藥制劑中的化學(xué)成分，并針對(duì)其中的一個(gè)或兩個(gè)成分進(jìn)行定性或定量分析，無(wú)論在藥典、部頒標(biāo)準(zhǔn)和地方標(biāo)準(zhǔn)，還是現(xiàn)在申報(bào)的新藥研究資料中，采用這種方式進(jìn)行質(zhì)量的評(píng)價(jià)已成為主流。（二）國(guó)外植物藥的質(zhì)量分析概況 國(guó)外對(duì)植物類中藥，所含有的植物化學(xué)成分是質(zhì)量控制的依據(jù)，對(duì)該類植物藥極其制劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法的建立，則是建立于全面的化學(xué)及藥理學(xué)研究的基礎(chǔ)之上， 如著名的銀杏葉標(biāo)準(zhǔn)制劑EGB761的標(biāo)準(zhǔn)，不僅僅控制總黃酮和總內(nèi)脂的含量，而且對(duì)黃酮中槲皮素、山柰酚和異鼠李素的比例，總內(nèi)脂中銀杏內(nèi)脂A，B，C，J和白果內(nèi)脂的比例，規(guī)

3、定了較為明確的范圍。從而全面的反映出制劑的質(zhì)量?jī)?nèi)涵。 國(guó)際植物藥市場(chǎng)中出現(xiàn)的標(biāo)準(zhǔn)植物藥制劑的概念，就是基于制劑中可控成分的分析結(jié)果來(lái)體現(xiàn)的。目前國(guó)際植物藥市場(chǎng)發(fā)展迅速， 我國(guó)雖擁有傳統(tǒng)中醫(yī)藥的優(yōu)勢(shì)，但在這個(gè)大市場(chǎng)中只是以原料或半成品的出口國(guó)的身份參與其中，所占市場(chǎng)份額與收益均不理想，其中重要的原因之一是產(chǎn)品質(zhì)控技術(shù)含量低，不能有效地說(shuō)明和保證產(chǎn)品質(zhì)量。 1中藥指紋圖譜的定義與特點(diǎn)1）中藥指紋圖譜的定義： 中藥指紋圖譜是指某種（或某產(chǎn)地）中藥材或中成藥中所共有的、具有特征性的某類或數(shù)類成分的色譜或光譜的圖譜。（2）中藥指紋圖譜的特點(diǎn)： 中藥指紋圖譜的特點(diǎn)：突破了傳統(tǒng)的線性思維，采用多學(xué)科、多領(lǐng)域

4、的先進(jìn)分析技術(shù)，著眼于宏觀規(guī)律性研究，建立客觀、整體和多指標(biāo)的綜合評(píng)價(jià)體系，在闡述中藥的活性成分的同時(shí)，闡明其中的其它成分，能夠展示各類成分的全貌，是當(dāng)前國(guó)際公認(rèn)的有效的質(zhì)量控制技術(shù)、能夠?qū)χ兴幉?、中藥制劑（包括半成品和成品）質(zhì)量的真?zhèn)蝺?yōu)劣與穩(wěn)定性作出較全面的評(píng)價(jià)。1）通過(guò)指紋圖譜的特征性，能有效鑒別樣品的真?zhèn)位虍a(chǎn)地； 2）通過(guò)指紋圖譜主要特征峰的面積 或比例的制定，能有效控制樣品的質(zhì)量，確保樣品質(zhì)量的相對(duì)穩(wěn)定。3中藥指紋圖譜的建立：應(yīng)以系統(tǒng)的化學(xué)成分研究和藥理學(xué)研究為依托；應(yīng)體現(xiàn)系統(tǒng)性、特征性、穩(wěn)定性三個(gè)基本原則。（1）系統(tǒng)性： 指的是指紋圖譜所反映的化學(xué)成分，應(yīng)包括中藥有效部位所含大部分的

5、種類，或指標(biāo)成分的全部。如中藥人參中所含的有效成分多為皂苷類化合物，則其指紋譜應(yīng)盡可能多的反映其中的皂苷成分；銀杏葉的有效成分是黃酮和銀杏內(nèi)酯類，則其指紋譜可采用兩種方法針對(duì)這兩類成分，分別分析，以達(dá)到系統(tǒng)全面的目的。（3）穩(wěn)定性： 指的是所建立的指紋圖譜，在規(guī)定的方法與條件下，不同的操作者和不同的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)能作出相同的指紋圖譜，其誤差應(yīng)在允許的范圍內(nèi)，這樣才可以保證指紋圖譜的使用具有通用性和時(shí)間性，也是作為標(biāo)準(zhǔn)方法所必備的特征之一。二中藥材指紋圖譜研究的一般方法主要介紹與中藥（新藥）注射劑指紋圖譜技術(shù)申報(bào)要求有關(guān)的研究?jī)?nèi)容樣品收集為了確保指紋譜的系統(tǒng)性，必須進(jìn)行具有廣泛代表性的樣品收集，尤其是

6、不同產(chǎn)地、不同采收期及加工方式的樣品的收集，只有保證了樣品的代表性，才能保證建立的指紋譜的有效性。（一）指紋圖譜的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容： 名稱、漢語(yǔ)拼音、拉丁名、來(lái)源、供試品和參照物的制備、檢測(cè)方法、指紋圖譜及技術(shù)參數(shù)。1、名稱、漢語(yǔ)拼音按中藥命名原則制定如：黃芪【名稱】黃芪【漢語(yǔ)拼音】Huangqi2、來(lái)源原植、動(dòng)物：科名、中文名、拉丁學(xué)名、藥用部位、產(chǎn)地、 采收季節(jié)、產(chǎn)地加工、炮制方法等。礦物藥：礦物的類、族、礦石名或巖石名、主要成分、產(chǎn)地、產(chǎn)地加工、炮制方法等。如：黃芪【基源】本品為豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge. var. mongho

7、licus (Bge.) Hsiao的干燥根。【產(chǎn)地】?jī)?nèi)蒙古自治區(qū)固陽(yáng)縣。【采收期】10月中旬至11月中旬?！井a(chǎn)地加工】除去須根及根頭，曬干。【炮制方法】除去雜質(zhì)，大小分開(kāi)，洗凈，潤(rùn)透，切厚片，干燥。 其性狀、鑒別、檢查、含量測(cè)定、浸出物等項(xiàng)應(yīng)符合中華人民共和國(guó)藥典2000年版一部249頁(yè)黃芪項(xiàng)下的各項(xiàng)規(guī)定。3、供試品的制備應(yīng)根據(jù)中藥材中所含化學(xué)成分的理化性質(zhì)和檢測(cè)方法的需要，選擇適宜的方法進(jìn)行制備。制備方法必須確保該中藥材的主要化學(xué)成分在指紋圖譜中的體現(xiàn)。對(duì)于僅提取其中某類或數(shù)類成分的中藥材，除按化學(xué)成分的性質(zhì)提取各類成分制定指紋圖譜外，還需按注射劑制備工藝制備供試品，制定指紋圖譜，用以分析

8、中藥材與注射劑指紋圖譜的相關(guān)性。4、參照物的制備制定指紋圖譜必須設(shè)立參照物。應(yīng)根據(jù)供試品中所含成分的性質(zhì)，選擇適宜的對(duì)照品作為參照物，如果沒(méi)有適宜的對(duì)照品，可選擇適宜的內(nèi)標(biāo)物作為參照物。參照物的制備應(yīng)根據(jù)檢測(cè)方法的需要，選擇適宜的方法進(jìn)行制備。例：黃芪1)黃芪甲苷對(duì)照品溶液的制備：取黃芪甲苷對(duì)照品，加流動(dòng)相制成每1ml含1mg的溶液作為皂苷類成分檢測(cè)的對(duì)照品溶液。2)毛蕊異黃酮-7-O-D-吡喃葡萄糖苷對(duì)照品溶液的制備：取毛蕊異黃酮-7-O-D-吡喃葡萄糖苷對(duì)照品，加流動(dòng)相制成每1ml含1mg的溶液作為黃酮及其苷類成分檢測(cè)的對(duì)照品溶液。5、測(cè)定方法包括測(cè)定方法、儀器、試劑、測(cè)定條件等。應(yīng)根據(jù)中

9、藥材所含化學(xué)成分的理化性質(zhì)，選擇適宜的測(cè)定方法，建議優(yōu)先考慮色譜方法。對(duì)于成分復(fù)雜的中藥材，必要時(shí)可以考慮采用多種測(cè)定方法，建立多張對(duì)照指紋圖譜。以色譜方法制定指紋圖譜所采用的色譜柱、薄層板、試劑、測(cè)定條件等必須固定；以光譜方法制定指紋圖譜，相應(yīng)條件也必須固定。例：黃芪黃酮及其苷類成分的測(cè)定方法 照高效液相色譜法（中國(guó)藥典2000年版一部附錄D）測(cè)定。 色譜條件和系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，型號(hào)為Polaris 5 C-18-A，2504.6mm（MetaChem公司產(chǎn)品）；流動(dòng)相為乙氰水（含0.042磷酸）(1:4)，流速0.8ml/分鐘，檢測(cè)波長(zhǎng)225nm；理論塔

10、板數(shù)按毛蕊異黃酮-7-O-D-吡喃葡萄糖苷計(jì)，應(yīng)不低于3000。 測(cè)定法 分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各10l，注入液相色譜儀中，記錄60分鐘的色譜圖，即得。以毛蕊異黃酮-7-O-D-吡喃葡萄糖苷的色譜峰(S峰)的相對(duì)保留時(shí)間和峰面積為1計(jì)算相對(duì)保留時(shí)間和峰面積比值。6、指紋圖譜及技術(shù)參數(shù)(1)指紋圖譜根據(jù)供試品的檢測(cè)結(jié)果，建立指紋圖譜。采用HPLC和GC制定指紋圖譜，其記錄時(shí)間一般為1小時(shí)；采用TLCS制定指紋圖譜，必須提供從原點(diǎn)至溶劑前沿的圖譜；采用光譜法制定指紋圖譜，必須按各種光譜的相應(yīng)規(guī)定提供全譜?；瘜W(xué)成分類型復(fù)雜的品種，必要時(shí)可建立多張對(duì)照指紋圖譜。 指紋圖譜的建立：根據(jù)10批

11、次以上供試品的檢 測(cè)結(jié)果所給出的相關(guān)參數(shù)，制定指紋圖譜。(2)共有指紋峰的標(biāo)定采用色譜方法制定指紋圖譜，必須根據(jù)參照物的保留時(shí)間，計(jì)算指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間。根據(jù)10批次以上供試品的檢測(cè)結(jié)果，標(biāo)定中藥材的共有指紋峰。色譜法采用相對(duì)保留時(shí)間標(biāo)定指紋峰，光譜法采用波長(zhǎng)或波數(shù)標(biāo)定指紋峰。(3)共有指紋峰面積的比值以對(duì)照品作為參照物的指紋圖譜，以參照物峰面積作為1，計(jì)算各共有指紋峰面積與參照物峰面積的比值；以內(nèi)標(biāo)物作為參照物的指紋圖譜，則以共有指紋峰中其中一個(gè)峰（要求峰面積相對(duì)較大、較穩(wěn)定的共有峰）的峰面積作為1，計(jì)算其他各共有指紋峰面積的比值。各共有指紋峰面積比值必須相對(duì)固定。峰面積比值的要求：Ai2

12、0At: SD2010%At AiAi 10At：SD25； 10 AtAi 5At：SD30； Ai5At：峰面積比值不作要求，但必須標(biāo)定相對(duì)保留時(shí)間。保留時(shí)間超過(guò)30分鐘的共有峰： Ai 10At：按上述規(guī)定執(zhí)行； Ai 10At：峰面積比值不作要求，但必須標(biāo)定相對(duì)保留時(shí)間。(4)非共有峰面積 供試品圖譜與指紋圖譜比較，非共有峰總面積不得大于總峰面積的5。(5)中藥材、有效部位、中間體和注射劑指紋圖譜之間的相關(guān)性可采用加入某一中藥材、有效部位或中間體的供試品或制備某一中藥材、有效部位或中間體陰性供試品的方法標(biāo)定各指紋圖譜之間的相關(guān)性。提供相關(guān)性研究的指紋圖譜。(6)中試產(chǎn)品的指紋圖譜申報(bào)臨

13、床的中藥注射劑必須提供三批以上中試產(chǎn)品的指紋圖譜。申報(bào)生產(chǎn)的中藥注射劑必須提供十批以上中試產(chǎn)品的指紋圖譜。5、中藥注射劑指紋圖譜檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)（草案）書寫格式(1)供試品的制備(2)對(duì)照品溶液或內(nèi)標(biāo)物溶液的制備(3)測(cè)定方法（包括儀器、試劑、測(cè)定條件和測(cè)定方法）(4)指紋圖譜及各項(xiàng)技術(shù)參數(shù)(5)起草說(shuō)明(6)有效部位或中間體的指紋圖譜檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)及起草說(shuō)明（二）指紋圖譜的評(píng)價(jià)1. 指紋圖譜的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 供試品指紋圖譜與該品種對(duì)照用指紋圖譜（共有模式）之間的相似性。（1）指紋圖譜的相似性應(yīng)從兩個(gè)方面考慮： A. 色譜的整體“面貌”，即有指紋意義的峰的數(shù)目、峰的位置和順序、各峰之間的大致比例（TLC還有斑點(diǎn)顏

14、色）等是否相似，以判斷樣品的真實(shí)性。B. 供試品與對(duì)照樣品或“對(duì)照用指紋圖譜”之間及不同批次樣品指紋圖譜之間總積分值作量化比較 如總積分面積相差較大（如20%），則說(shuō)明同樣量的樣品含有的內(nèi)在物質(zhì)有較明顯的“量”的差異。 這種差異是否允許，應(yīng)視具體品種、具體工藝的實(shí)際情況，并結(jié)合含量測(cè)定項(xiàng)目綜合判斷。（2）相似性比較 一般用“相似度”表達(dá) 藥典會(huì)推薦的“中藥指紋圖譜計(jì)算機(jī)輔助相似度評(píng)價(jià)軟件” 一般成品指紋圖譜相似度計(jì)算結(jié)果在0.9 1.0（或以90 100表示）之間作為符合要求2.中藥指紋圖譜的計(jì)算機(jī)處理 中藥的指紋圖譜大都比較復(fù)雜，尤其是復(fù)方中藥。如果用人工對(duì)其進(jìn)行分析，找出其圖譜特征并分析藥

15、品質(zhì)量，容易由于人的主觀因素，造成結(jié)果的誤差。中藥的質(zhì)量具有模糊性，圖譜的相似性只有相對(duì)的意義。對(duì)于這種具有模糊性的問(wèn)題，使用模糊分析顯然比較合適。當(dāng)前在指紋圖譜分析方面，使用較多的為模糊聚類分析。主要分析計(jì)算方法有：A. 主成分分析（principle component analysis，PCA)B. 簡(jiǎn)單分類法（simple classification algorithm，SIMCA）C.非線性映照（nonlinear mapping，NLM）D.星座圖技術(shù)（constellation-graphing technique）E.系統(tǒng)聚類分析（hierarchical clustering analysis）F.模糊聚類分析（fuzzy clustering analysis）G.向量夾角法H.人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)識(shí)別（artificial neural net ，ANN）比較有發(fā)展前途的還有人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模式識(shí)別技術(shù)。與其他模式識(shí)別技術(shù)相比，人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模式識(shí)別具有下述4方面的優(yōu)勢(shì)：(1)較高的容錯(cuò)性能，能夠識(shí)別帶有噪聲或變形的輸入；(2)更強(qiáng)的自適應(yīng)學(xué)習(xí)能力；(3)采用并