《細胞與免疫學技術與原理》2課件

1、第二講細胞培養(yǎng)技術二 動物細胞培養(yǎng)可以在同一時期、相同條件、相似性狀的條件下提供大量的實驗樣本，開展科學研究，相對耗資較少，因而成為生物制品、單克隆抗體和基因工程制品生產(chǎn)的重要手段。 第一節(jié)動物細胞原代培養(yǎng)概念：從供體獲得組織細胞為材料，進行首次培養(yǎng)，稱為細胞的原代培養(yǎng)或稱細胞的初代培養(yǎng)。 原代培養(yǎng)的細胞特點：（1）原始性（2）不均一性 一般要求： 無特定的要求時，取容易培養(yǎng)的組織進行培養(yǎng)，成功率高。取材后最好立即培養(yǎng)，因故不能培養(yǎng)時，應把組織切成1cm3左右的小塊，置培養(yǎng)液中，4儲存，存放時間不宜超過24小時。 因為時間越長、組織塊越大細胞越易死亡。 從體內(nèi)取材時，應嚴格保持無菌，嚴防有害物

2、污染，如化學藥物、試劑、射線等。 取組織時要作好記錄，如動物、性別、年齡、部位、種類和疾病，以便與日后實驗結果相比較。2、取人體皮膚或活檢材料 （1）皮膚用75%酒精消毒；（2）用刮皮刀刮取表皮，以輕微滲血為界；（3）包扎傷口，傷口好后不留疤痕。 這種取皮方法的優(yōu)點是表皮細胞多，培養(yǎng)容易成功。如取活檢組織（小兒包皮）須先準備含雙抗的BSS液送入手術間，手術后儲4冰箱。 3、取內(nèi)臟和實體瘤 內(nèi)臟除消化道外基本是無菌的，要明確和熟悉所需組織的類型和部位。 實體瘤取材時要取腫瘤細胞豐富的區(qū)域，要避開破潰、壞死液化部分，以防污染。懷孕母鼠4、取鼠胚17天的胚胎5、取各種動物材料 先準備好一瓶含雙抗的無

3、菌PBS液，待處死動物后，迅速取出所需要的臟器組織，放入無菌PBS 液內(nèi)，盡快將實驗材料送入超凈工作臺，進行細胞原代培養(yǎng)。 從體內(nèi)取出的各種組織均由眾多的細胞和纖維成分組成，且結合十分緊密， 為獲取大量生長良好的細胞，必須把組織細胞分散開來，使細胞解離出來；能達到單細胞水平更好，同時并不使細胞受傷害。二、組織分離方法離心前離心后Ficoll分層液離心后外周血細胞示意圖2、機械分散法 適用范圍：某些軟組織如腦、胚胎及一些腫瘤組織。 組織消化法是在把組織經(jīng)過切割處理后，再用生化手段進一步分散成細胞團或單個細胞然后加入培養(yǎng)液。制成細胞懸液，接種入培養(yǎng)容器中后，細胞容易生長增殖，如： 3、消化分離法胰

4、蛋白酶消化法膠原酶消化法EDTA消化法 優(yōu)點：組織和細胞剛剛離體，生物性狀尚未發(fā)生很大變化，具有二倍體遺傳性狀，供體來源充分、生物條件穩(wěn)定的情況下，在一定程度上能反映在體狀態(tài)。 三、細胞原代培養(yǎng)方法 1組織塊培養(yǎng)法組織塊培養(yǎng)法示意圖 翻轉培養(yǎng)瓶的目的是為了使組織塊微干涸，以利貼附和免從瓶壁脫落，但時間不易過長，超過4小時以上可能對組織有不利影響。單層細胞培養(yǎng)示意圖 胰蛋白酶冷消化法 胰蛋白酶熱消化法 消化得到的細胞沉淀，用培養(yǎng)液配制成細胞懸液，接種到培養(yǎng)瓶內(nèi)水平放置，37進行培養(yǎng)，每隔12天換培養(yǎng)液一次，培養(yǎng)一定的時間后，細胞在瓶底可長成一單層。 單層培養(yǎng)的神經(jīng)細胞（左）和內(nèi)皮細胞（右） 單層

5、細胞培養(yǎng)的好處：（1）更換新鮮培養(yǎng)液比較容易，便于細胞從培養(yǎng)液攝取營養(yǎng)和排除代謝產(chǎn)物；（2）易于觀察某些因子加到培養(yǎng)液內(nèi)后的作用，以及從培養(yǎng)液中減去某些因子后對細胞生長的影響。（3）當細胞粘附在基底質上后，則更容易表達某些產(chǎn)物；（4）單層細胞培養(yǎng)更適用許多細胞系。（5）適合大量細胞培養(yǎng)。 第二節(jié)動物細胞傳代培養(yǎng) 原代培養(yǎng)過程中要不斷更換新鮮培養(yǎng)液以維持細胞的生長。待細胞生長到一定的限度時會產(chǎn)生接觸抑制，需要對細胞進行再培養(yǎng)。概念：由原代培養(yǎng)的細胞經(jīng)消化分離后，從培養(yǎng)瓶中取出，配制成細胞懸浮液，分裝到兩個或兩個以上的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，稱為細胞傳代培養(yǎng)或再培養(yǎng)。 傳代培養(yǎng)形成的細胞群稱細胞系。細胞

6、系雖然比原代培養(yǎng)物的細胞組成均一得多了，但它仍不是單一細胞。必須在細胞系的基礎上進行單細胞的克隆化、篩選而形成細胞株。一、需要更換新鮮培養(yǎng)液的提示1、培養(yǎng)液的pH值下降2、細胞濃度3、細胞類型4、細胞形態(tài)學二、傳代培養(yǎng)的確定 1細胞生長停滯，繼而細胞出現(xiàn)脂肪滴、衰老或者組織塊脫離基質漂流在培養(yǎng)液中。2正常細胞生長貼滿瓶壁后，由于正常細胞表面具有接觸抑制，因而細胞生長受抑制。3. 腫瘤細胞生長可形成多層細胞。多層細胞中，在低層部位的細胞與培養(yǎng)液不能直接觸，結果由于營養(yǎng)不足而生長停滯，甚至細胞呈片狀脫離瓶底而漂浮在培養(yǎng)中。 三、傳代培養(yǎng)的方法1、單層細胞的傳代培養(yǎng)（1）輕輕震蕩法（2）用胰蛋白酶消

7、化液處理（3）用EDTA溶液（4）機械刮削法消化法傳代培養(yǎng)步驟 懸浮細胞的傳代培養(yǎng)，不需要解離細胞一步，可直接用離心法得到細胞，然后將細胞懸于新鮮培養(yǎng)液內(nèi)，計數(shù)，分裝培養(yǎng)瓶，再培養(yǎng)。 2、懸浮細胞的傳代培養(yǎng) 原代培養(yǎng)所含的細胞類型多而雜，培養(yǎng)初期細胞類型多種多樣。隨著培養(yǎng)時間的延長，有的細胞類型經(jīng)過適應生長階段而加速繁殖生長；而另一些細胞，或者死亡，或者經(jīng)過逐步退化而至死亡。培養(yǎng)物的細胞類型由復雜逐步變?yōu)閱我坏幕蚓鶆虻摹?四、細胞系的建立 傳代培養(yǎng)不僅僅是為了維持細胞不斷地生長，而且使培養(yǎng)物逐步演變?yōu)榫哂性鲋衬芰?、特征專一、類型均勻的培養(yǎng)細胞，稱之為細胞系。 “有限”細胞系：壽命有限的細胞系。

8、這類細胞系大多經(jīng)過有限的細胞代數(shù)后，一般經(jīng)2080群體倍增后，細胞退化或死亡，其壽命長短與細胞類型和培養(yǎng)條件有關。 “無限”細胞系：經(jīng)過再培養(yǎng)傳代后，細胞發(fā)生轉化，可連續(xù)培養(yǎng)和生長，壽命變?yōu)椤盁o限”的，稱謂連續(xù)培養(yǎng)細胞系，或“無限”細胞系。 第三節(jié)培養(yǎng)細胞的生物學特性一、培養(yǎng)細胞的形態(tài)分類1、貼附型 只依賴于貼附才能生長的細胞稱貼附性細胞或錨著依存性細胞。（1）成纖維型細胞皮膚成纖維細胞（ 100 倍） 成纖維型細胞，細胞體呈梭形或不規(guī)則三角形，中央有卵圓形核，胞質向外伸出23個長短不同的突起。細胞在生長時多呈放射狀、火焰狀或旋渦狀走行。在培養(yǎng)中的細胞凡形態(tài)與成纖維細胞類似時，皆可稱之為成纖維

9、細胞。（2）上皮型細胞培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細胞3、游走型細胞 游走型細胞在支持物上散在生長，一般不連接成片。細胞質經(jīng)常伸出偽足或突起，呈活躍的游走或變形運動，速度快而且不規(guī)則。此型細胞不很穩(wěn)定，有時亦難和其它型細胞相區(qū)別。在一定條件下，由于細胞密度增大聯(lián)接成片后，可呈類似多角形。（4）多形型細胞 除上述三型貼附型細胞外，還有一些組織和細胞，如神經(jīng)組織的細胞等，難以確定它們規(guī)律的形態(tài)，可統(tǒng)歸入多形型細胞。2、懸浮型 有的細胞在培養(yǎng)時不貼附于支持物上，而呈懸浮狀態(tài)生長，如某些癌細胞和血液白細胞可呈懸浮型。 細胞懸浮生長時，胞體為圓形，觀察時不如貼附型方便。但優(yōu)點是細胞懸浮在培養(yǎng)液中生長，生存空間大，允許

10、長時間生長，能繁殖多量細胞，便于做細胞代謝等研究。二、培養(yǎng)細胞的生長和增殖過程 細胞在體外培養(yǎng)后，在一切條件適宜的情況下，最主要的活動是生長和增殖。細胞生長：細胞體積增大。細胞增殖：細胞數(shù)量增多。1、培養(yǎng)細胞的生命周期 組織培養(yǎng)細胞生命周期指細胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長的時間。體內(nèi)組織細胞的生存期與完整機體的死亡衰老基本相一致。 進行正常細胞培養(yǎng)時，不論細胞的種類和供體的年齡如何，在細胞全生存過程中，大致都經(jīng)歷以下三個階段：原代培養(yǎng)期 傳代期 衰退期2、培養(yǎng)細胞的一代生存期 細胞“一代” 僅指從細胞接種到分離再培養(yǎng)時的一段時間，如某一細胞系為第153代細胞，即指該細胞系已傳代153次。它與細胞世

11、代或倍增一代不同；細胞世代是指細胞的生命周期。而在細胞的一代中，細胞能倍增56次。細胞傳一代，一般要經(jīng)過以下三個階段： 潛伏期 指數(shù)增長期 停滯期培養(yǎng)細胞的生長曲線 3、細胞周期 一個細胞周期是從一次細胞分裂結束開始，經(jīng)過物質積累過程，直到下一次細胞分裂結束為止，這種細胞物質積累和細胞分裂的循環(huán)過程，稱為細胞周期。 細胞周期分為細胞間期和細胞分裂期兩個階段。4. 細胞系的生長過程 細胞系在培養(yǎng)中能夠存活時間的長短，主要取決于細胞來自何種動物種族及年齡。不同的細胞體外培養(yǎng)可傳代數(shù)不同，當細胞發(fā)生遺傳性改變，如獲永生性或惡習性轉化時，細胞的生存期可能發(fā)生改變。 人胚二倍體成纖維細胞培養(yǎng)，在不凍存和

12、反復傳代條件下，可傳3050代，相當于150300個細胞增殖周期，能維持1年左右的生存時間。 恒河猴的皮膚成纖維細胞能傳40代；雞胚胎成纖維細胞最多能傳30代；小鼠成纖維細胞只能傳8代左右；如供體為成體或衰老個體，則生存時間更短；如培養(yǎng)的肝細胞或腎細胞，僅能傳幾代或幾十代。 體外培養(yǎng)條件可能延遲細胞衰老，壽命從50代延至150代。當細胞發(fā)生遺傳性改變，如獲永生性或惡習性轉化時，細胞的生存期可能發(fā)生改變。 第三章培養(yǎng)細胞性狀的檢測與保存 細胞在體外培養(yǎng)過程中需要每天進行常規(guī)檢查和顯微鏡觀察，及時了解細胞生長狀態(tài)、數(shù)量改變、細胞形態(tài)、細胞有無移動、有無污染、培養(yǎng)液的pH是否變酸、變黃是否需要更換等

13、。 一、細胞常規(guī)檢查觀察的內(nèi)容 1、肉眼觀察 2、顯微鏡觀察 3、離體活細胞染色觀察 (1)中性紅染色 (2)結晶紫染色 (3)臺盼藍染色 4、固定細胞觀察法 組織培養(yǎng)既可直接觀察活細胞，也可進行固定制成永久標本觀察。標本制好以后可以長期保存和做長時間的觀察、分析。 5、固定細胞染色觀察法 培養(yǎng)細胞染色有一般和特殊之分；一般染色為觀察細胞一般形態(tài)之用，特殊染色為用于觀察細胞特殊成分的染色方法。 常用染色法：(1)Giemsa染色法 (2)蘇木精-伊紅（H.E.）染色法 (3)Feulgen染色法 (DNA特異性染色) (4)吖啶橙染色熒光觀察法 二、細胞增殖生長 細胞增殖生長率是判定細胞活力的

14、重要指標，有多種顯示方法。常用方法：1.細胞計數(shù) 2.生長周期的檢測 3.細胞周期測定 4.生長暈的測量1.細胞計數(shù) 用細胞計數(shù)法測定細胞生長動力學是目前采用的最普遍的方法。 計數(shù)方法： 血細胞計數(shù)板人工計數(shù) 細胞計數(shù)器計數(shù)平均值104稀釋倍數(shù) =細胞數(shù)/ml 計數(shù)中，如果細胞懸液的細胞濃度過高，必須稀釋后再計；如果細胞數(shù)太少，可離心濃縮后再計。每個細胞懸液至少滴樣兩次求平均值。 2.生長周期、細胞周期的檢測 任何一個細胞系在接種培養(yǎng)過程中均經(jīng)過生長緩慢期、快速生長和最后維持穩(wěn)定期的生長周期。掌握一個細胞系的生長周期，必須嚴格控制取樣、培養(yǎng)時間等培養(yǎng)條件。 細胞周期有絲分裂細胞系生長周期曲線D

15、T：倍增時間（doubling time）3、流式細胞儀檢測細胞周期時相和DNA合成 近年來流式細胞儀的發(fā)展已成為檢測細胞增殖周期的主要手段，可進行多項檢測，如細胞周期時相、DNA合成強度、持續(xù)時間等，已取代了應用同位素等繁瑣方法。特別是培養(yǎng)細胞非常適用于做流式細胞儀檢測的對象，且程序簡單、快速、效果準確。4.生長暈的測量 外植塊外周形成薄而透明的生長暈時，表明培養(yǎng)物生長正常；取生長良好的培養(yǎng)物觀察其生長情況。從起始培養(yǎng)后間隔一定時間，如培養(yǎng)24小時和48小時，在顯微鏡下借用投影描畫儀將組織塊大小和生長暈外周輪廓畫在同一張紙上。成纖維母細胞生長暈繪圖 中央E為接種培養(yǎng)的外植塊面積；A為培養(yǎng)6小

16、時時的生長暈面積；B為培養(yǎng)12小時后的生長暈面積；C為培養(yǎng)24小時時的生長暈面積。三、細胞培養(yǎng)的污染及控制 污染是細胞培養(yǎng)的大敵。預防和避免污染是細胞培養(yǎng)成功的關鍵之一。 (一) 細胞微生物污染的類型 細菌污染 2. 真菌污染 3. 支原體污染 4. 病毒污染 5. 非同種細胞污染 （二） 污染來源及鑒別 污染來源 （1）不潔的動物組織標本 （2）空氣 （3）清洗消毒 （4）操作 2. 污染的鑒別 （1）細菌、真菌污染的檢測（2）支原體污染的檢測（三） 污染的清除和預防 污染的清除 （1）使用抗生素 （2）加溫處理2. 污染的預防 （1）從物品、用品消毒滅菌著手 （2）從操作者做起 （3）防止

17、細胞交叉污染 四、細胞的凍存與復蘇技術 一、細胞的凍存 細胞在不加任何保護劑的情況下直接冷凍，細胞內(nèi)外的水分會很快形成冰晶，從而導致細胞死亡。采用甘油或二甲基亞砜(DMSO)作保護劑，這兩種物質分子量小，溶解度大，易穿透細胞，可以使冰點下降，提高細胞膜對水的通透性，且對細胞無明顯毒性。 慢速冷凍方法又可使細胞內(nèi)的水分滲出細胞外，減少胞內(nèi)形成冰結晶的機會，從而減少冰晶對細胞的損傷。 1、細胞凍存方法（1）選擇處于對數(shù)生長期的細胞，去細胞培養(yǎng)液，PBS清洗，0.25% 胰蛋白酶消化。將細胞收集于離心管中離心。離心后棄上清液，加含血清的培養(yǎng)基重懸細胞。（2）取少量細胞懸浮液計數(shù)細胞濃度及凍前存活率。

18、細胞濃度為110106/mL之間。加入凍存管，約1ml/管。（3）將冷凍管蓋子蓋緊，并標記好細胞名稱和凍存日期，同時作好登記（日期、細胞種類及代次、凍存支數(shù)）。（4）將凍存管置入4冰箱中30分鐘，再移至20冰箱30分鐘，70冰箱2小時或過夜，最后放入液氮罐內(nèi)。2、注意事項（1）要定期給液氮灌充液氮，以確保液氮灌內(nèi)有一定量的液氮。液氮溫度達-196，使用時注意勿讓液氮濺到皮膚上，以免引起凍傷。 （2）細胞凍存液的配方有很多種： 培養(yǎng)基：血清：DMSO=7:2:1或8：1：1或5：4：1。凍存細胞時也可直接用血清：DMSO=9:1，一般高濃度血清有助于維護細胞活力，對原代培養(yǎng)的細胞，以90%血清凍存更為有效，復蘇存活率在80%90%以上。（3）細胞凍存在液氮中可以長期保存，但為妥善起見，凍存半年后，最好取出一支凍存細胞復蘇培養(yǎng)，觀察生長情況，然后再繼續(xù)凍存。細胞在液氮中可長期凍存無限時間，而不會影響細胞活力； 注：在-80度只可保存數(shù)月 二、 細胞的復蘇1、細胞復蘇的方法（1）自液氮中取出冷凍管，檢查蓋子是