壬基酚對成年雌性SD大鼠生殖功能的影響

1、壬基酚對成年雌性SD大鼠生殖功能的影響【摘要】目的：觀察壬基酚對成年雌性SD大鼠生殖功能的影響。方法：對成年雌性SD大鼠每天灌胃壬基酚50、100、200gkg-1，陽性對照組每天灌胃乙菧酚0.2gkg-1，陰性對照組管飼花生油。通過陰道涂片觀察性周期的變化，28d后處死大鼠，放免法測定血清雌激素、黃體生成素濃度，并作垂體、子宮、卵巢組織病理學(xué)檢查，免疫組化技術(shù)檢測子宮的雌激素受體ER表達(dá)情況。結(jié)果：壬基酚劑量100gkg-1可使大鼠出現(xiàn)持續(xù)動情期，血清雌激素、黃體生成素程度降低P0.05，卵巢組織病理學(xué)切片顯示卵泡數(shù)目減少P0.05，子宮ER表達(dá)無明顯差異。結(jié)論：壬基酚在較高濃度時可抑制雌性

2、大鼠的生殖功能。1材料與方法1.1實驗動物雌性SD大鼠10周齡，質(zhì)量210260g，共40只，購自東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心。1.2試劑壬基酚購于無錫市凌飛助劑廠，純度99%。市售魯花牌花生油由萊陽魯花濃香花生油消費。乙菧酚由上海信誼康捷藥業(yè)消費。雌二醇E2、黃體生成素LH放免試劑盒由原子高科股份消費。雌激素受體ER單克隆抗體為SantaruzBitehnlgyIn產(chǎn)品。DAB(二氨基聯(lián)苯胺)、SP免疫組化試劑盒購自北京中杉生物技術(shù)。1.3動物飼養(yǎng)及分組大鼠以不含植物雌激素的飼料去除大豆喂養(yǎng)，每天上午9：0011：00陰道涂片，觀察大鼠的性周期，觀察4個周期，選用有正常性周期的動物進(jìn)入實驗。大

3、鼠隨機(jī)分成5組，每組7只。實驗組按壬基酚50、100、200gkg-1分為低、中、高劑量組，陰性對照組為管飼花生油，陽性對照組為乙菧酚0.2gkg-1。飼養(yǎng)28d，每天陰道涂片，觀察動情周期，在動情期陰道涂片示大量無核角化細(xì)胞處死大鼠。10%水合氯醛每100g質(zhì)量0.3l腹腔注射麻醉，眶后靜脈叢采血，取血清置-70冰箱待用。按液體灌注固定方法，別離出垂體、子宮、卵巢，繼續(xù)固定、脫水、透明，浸蠟包埋，制成4厚的石蠟切片。1.4E2、LH測定方法按試劑盒操作說明，采用放射免疫法測定上述待用血清中的E2、LH程度。1.5組織形態(tài)學(xué)觀察及卵泡計數(shù)上述的切片HE染色，光鏡觀察。取最大剖面的切片，光鏡下計

4、數(shù)具有正常卵泡構(gòu)造的卵泡數(shù)雙側(cè)卵巢的卵泡數(shù)相加，分別測定各組大鼠的初級卵泡、生長卵泡、成熟卵泡、總卵泡數(shù)。卵泡分級標(biāo)準(zhǔn)為：初級卵泡直徑2530，生長卵泡直徑31400，成熟卵泡直徑6507003。1.6ER的檢測按SP法鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)法進(jìn)展免疫組化染色，二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，3%過氧化氫室溫孵育，微波修復(fù)抗原，羊血清封閉，37孵育15in，滴加1250稀釋的ER兔抗大鼠單克隆抗體，4孵育過夜，再依次參加生物素偶聯(lián)的羊抗兔IgG抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈酶卵白素，各37孵育15in，DAB染色，顯微鏡下控制顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、樹膠封片。陰性對照以0.05l

5、L-1PBS代替一抗，得陰性結(jié)果。以人乳腺癌組織作為陽性對照，得陽性結(jié)果。根據(jù)染色面積和強(qiáng)度按以下方法進(jìn)展半定量評分：0,無染色或微弱染色；1,染色面積25%；2,染色面積在25%50%；3,50%染色面積75%；4,染色面積75%。1.7統(tǒng)計學(xué)處理實驗數(shù)據(jù)用x-s表示，采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件，組間差異比擬用獨立樣本的t檢驗，免疫組化評分結(jié)果用成組設(shè)計兩樣本比擬的秩和檢驗ilxn，編秩后對秩次進(jìn)展t檢驗，檢驗水準(zhǔn)=0.05。2結(jié)果2.1壬基酚對性周期的影響成年雌性SD大鼠的正常性周期是45d，壬基酚100gkg-1組的大鼠用藥7d后陰道涂片顯示，出現(xiàn)大量有核上皮細(xì)胞動情前期和大量無核角化

6、細(xì)胞動情期的時間明顯延長，而出現(xiàn)白細(xì)胞、少量角化細(xì)胞及有核細(xì)胞動情后期和大量白細(xì)胞、上皮細(xì)胞及黏液動情期間的時間縮短。200gkg-1壬基酚組和乙菧酚組的大鼠用藥7d后，陰道涂片長時間觀察到大量無核角化細(xì)胞，即出現(xiàn)持續(xù)動情期。陰性對照組和50gkg-1壬基酚組的大鼠直到處死前皆能觀察到規(guī)律的性周期。2.2血清中的E2、LH程度100、200gkg-1壬基酚組和乙菧酚組的大鼠血清E2、LH程度均降低，與相應(yīng)陰性對照組相比擬，差異有顯著性P0.05表1。表1各組大鼠E2、LH測定結(jié)果1與陰性對照組比擬，P0.05；2與低劑量組比擬，P0.05；3與中劑量組比擬，P0.05；4與高劑量組比擬，P0.

7、052.3垂體、卵巢、子宮組織形態(tài)學(xué)變化2.3.1垂體各組均見嫌色細(xì)胞數(shù)量最多，成群分布，嗜酸細(xì)胞次之，嗜堿細(xì)胞單個分布，數(shù)量最少，血竇豐富，高劑量壬基酚組見到少量的凋亡小體圖1、2。2.3.2卵巢陰性對照組可見原始卵泡、初級卵泡、次級卵泡和成熟卵泡，黃體數(shù)目較多，間質(zhì)少，間質(zhì)腺少見，血管豐富。壬基酚各組隨著劑量的增加，總卵泡數(shù)減少，尤其是成熟卵泡數(shù)減少最為明顯，閉鎖卵泡數(shù)增多，差異有顯著性P0.05。乙菧酚組總卵泡數(shù)也明顯減少，高劑量壬基酚組變化與此相似圖3、4，表2。表2各組大鼠雙側(cè)卵巢卵泡數(shù)比擬與陰性對照組比擬，1)P0.05,2)P0.05；3與低劑量組比擬，P0.05；與中劑量組比擬，4)P0.05,5)P0.05；6與高劑量組比擬，P0.052.3.3子宮各組大鼠子宮變化相似，黏膜厚，約占子宮壁的2/3，上皮以分泌細(xì)胞為主，固有層有大量子宮腺體，腺腔大，結(jié)締組織疏松，有豐富的毛細(xì)血管及小動靜脈?；鶎虞^厚，平滑肌細(xì)胞正常。2.4子宮ER的表達(dá)大鼠子宮組織ER蛋白主要表達(dá)在子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞、子宮腺上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的細(xì)胞核。ER蛋白表達(dá)半定量分析顯示，壬基酚低、中、高劑量組分別為2.00.29、1.930.35、1.930.53,乙菧酚組為1.90.35