豬偽狂犬病的PCR診斷課件

1、實驗七 豬偽狂犬病PCR診斷豬偽狂犬病的PCR診斷1實驗七 豬偽狂犬病PCR診斷豬偽狂犬病的PCR診斷1實驗?zāi)康模?、了解PCR反應(yīng)的原理、方法及操作步驟；2、掌握豬偽狂犬病毒PCR檢測的方法；實驗內(nèi)容：1、講述PCR反應(yīng)的原理、方法及操作步驟，2、豬偽狂犬病毒PCR檢測。豬偽狂犬病的PCR診斷2實驗?zāi)康模?、了解PCR反應(yīng)的原理、方法及操作步驟；實驗內(nèi)容什么是PCR？ 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，簡稱PCR）又稱無細(xì)胞分子克隆或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴增技術(shù)。一、PCR反應(yīng)的原理、方法及操作步驟豬偽狂犬病的PCR診斷3什么是PCR？ 聚合酶鏈

2、式反應(yīng)（Polymerase ChaPCR原理 PCR是一種選擇性擴增DNA或RNA的方法，其基本原理是依據(jù)體內(nèi)細(xì)胞分裂中的DNA半保留復(fù)制機理，以及在體外DNA分子于不同溫度下雙鏈和單鏈可以互相轉(zhuǎn)變的性質(zhì)，人為地控制體外合成系統(tǒng)的溫度，以促使雙鏈DNA變成單鏈；單鏈DNA與人工合成的引物退火，以及在dNTP存在下，耐高溫的DNA聚合酶使引物沿單鏈模板延伸成為雙鏈DNA。高溫變性，低溫退火，適溫延伸等步反應(yīng)循環(huán)進行，使目的DNA得以迅速擴增。豬偽狂犬病的PCR診斷4PCR原理 PCR是一種選擇性擴增DNA或RNA的方法，其PCR原理PCR技術(shù)在模板DNA、dNTP、Mg2+、合適Buffer等

3、條件下，用耐熱的Taq聚合酶代替DNA聚合酶，用合成的DNA引物代替RNA引物，經(jīng)過DNA變性、引物與模板結(jié)合（復(fù)性）和延伸3個步驟的反復(fù)循環(huán) （2530次）過程，使目的DNA呈指數(shù)擴增 。豬偽狂犬病的PCR診斷5PCR原理PCR技術(shù)在模板DNA、dNTP、Mg2+、合適B反應(yīng)程序變性：93-94 2min變性：93-94 30s復(fù)性：55-65 30s延伸：72 30s延伸：72 2min35個循環(huán)豬偽狂犬病的PCR診斷6反應(yīng)程序變性：93-94 2min35個循環(huán)豬偽狂PCR原理Sample denaturatationPrimer annealingPrimer extension豬偽狂

4、犬病的PCR診斷7PCR原理Sample denaturatation豬偽狂犬PCR product豬偽狂犬病的PCR診斷8PCR product豬偽狂犬病的PCR診斷8標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系10擴增緩沖液 10ul 4種dNTP混合物 各200umol/L 引物 10100pmol 模板DNA 0.12ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加雙或三蒸水至 100ul豬偽狂犬病的PCR診斷9標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系10擴增緩沖液 豬偽狂犬病的PCR診斷10豬偽狂犬病的PCR診斷10酶及其濃度目前有兩種 Taq DNA 聚合酶供應(yīng)天然酶：從棲熱水生桿菌中提純基因工程酶：大

5、腸菌合成一個典型的 PCR反應(yīng)約需酶量 2.5U（指總反應(yīng)體積為100 ul時）濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少豬偽狂犬病的PCR診斷11酶及其濃度目前有兩種 Taq DNA 聚合酶供應(yīng)豬偽狂犬引物引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計互補的寡核苷酸鏈做引物，用 PCR就可將模板DNA在體外大量擴增豬偽狂犬病的PCR診斷12引物引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵豬偽狂犬病的PCR診斷12引物在線設(shè)計網(wǎng)址：primer/primer3_豬偽狂犬病的PCR診斷13引物在線設(shè)計網(wǎng)址：豬偽狂犬病

6、的PCR診斷13豬偽狂犬病的PCR診斷14豬偽狂犬病的PCR診斷14豬偽狂犬病的PCR診斷15豬偽狂犬病的PCR診斷15PCR產(chǎn)物分析 凝膠電泳分析法 可用瓊脂糖（Agrose）或聚丙烯酰胺（PAGE）凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物的大小。 同時應(yīng)以標(biāo)準(zhǔn)DNA分子量作平行對照，凝膠中加入溴化乙錠，電泳后，紫外檢測儀下觀察結(jié)果并拍照。豬偽狂犬病的PCR診斷16PCR產(chǎn)物分析豬偽狂犬病的PCR診斷16二 豬偽狂犬病毒感染PCR檢測-試劑盒豬偽狂犬病的PCR診斷17二 豬偽狂犬病毒感染PCR檢測-試劑盒豬偽狂犬病的PCR豬偽狂犬病的PCR診斷18豬偽狂犬病的PCR診斷18使用方法豬偽狂犬病的PCR診斷19使用方法豬偽狂犬病的PCR診斷19注意事項：豬偽狂犬病的PCR診斷20注意事項：豬偽狂犬病的PCR診