轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)課件

1、食品生物技術(shù)與食品安全檢測目錄一、轉(zhuǎn)基因食品的檢測方法目前已有的轉(zhuǎn)基因檢測方法主要有兩大類：一類是蛋白質(zhì)水平的檢測；另一類是核酸水平的檢測。主要方法免疫學(xué)方法核酸探針法分子標(biāo)記法蛋白質(zhì)水平核酸水平檢測目標(biāo)：DNA,RNA和蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)DNARNA血清學(xué)方法PCR及核酸雜交方法（一）、蛋白質(zhì)水平檢測方法免疫分析技術(shù)是通過抗原抗體之間的特異反應(yīng)來實現(xiàn)的。這種方法的優(yōu)點是：具有高度特異性，即使在待測樣品中有干擾性化合物存在，也能準(zhǔn)確識別抗原性物質(zhì)。免疫學(xué)分析技術(shù)蛋白質(zhì)印跡法酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）試紙條法酶聯(lián)免疫吸附法ELISA檢測是將抗原和抗體反應(yīng)的特異性與酶對底物的高效催化作用結(jié)合起來，根據(jù)

2、酶作用于底物后的顯色反應(yīng)，當(dāng)抗原與抗體結(jié)合時，借助于比色或熒光反應(yīng)鑒定轉(zhuǎn)基因食品。優(yōu)點：提高了檢測靈敏度，能產(chǎn)生有顏色的底物，通過儀器或肉眼識別，具有高度選擇性、靈敏性和商業(yè)可利用性。缺點：復(fù)雜的基質(zhì)對它的準(zhǔn)確性和精度性有干擾，并且外源基因表達蛋白質(zhì)含量低或熱處理變性時，此免疫方法的檢測能力下降。試紙條法將特異性抗體交聯(lián)到試紙上，當(dāng)紙上抗體與特異抗原（待測抗原）結(jié)合后，再與帶有標(biāo)記物的特異抗體進行反應(yīng)，即可在試紙上形成帶有顏色的三明治結(jié)構(gòu)。此法不需要特殊儀器，方便攜帶，適用于現(xiàn)場檢測或初篩。PCR技術(shù)PCR技術(shù)（聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)）是指模擬體內(nèi)DNA復(fù)制方式在體外選擇性擴增DNA某個特殊區(qū)域的技

3、術(shù)。具有短時間內(nèi)準(zhǔn)確大量復(fù)制目的順序，具有靈敏度較高、特異性強、可準(zhǔn)確定量等優(yōu)點，是目前轉(zhuǎn)基因食品檢測中最為成熟的方法?；疽兀耗０?，引物、合成DNA的原料即dNTP和DNA聚合酶。關(guān)鍵步驟：DNA抽提與純化。PCR既可做定性又可做定量分析。1、定性PCR技術(shù)其原理：轉(zhuǎn)基因食品重組DNA的基本結(jié)構(gòu)包括啟動子、目的基因、終止子和標(biāo)記基因，其中啟動子和終止子為表達目的基因所必需的。而現(xiàn)有的商品化轉(zhuǎn)基因食品中絕大多數(shù)含花椰菜花葉病毒啟動子CaMV35S、根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)錄終止子NOS及抗生素抗性基因NFIII。人們可通過擴增這些特殊的啟動子和終止子序列，鑒定食品中有無轉(zhuǎn)基因成分。目前為止，利用定性PC

4、R檢測技術(shù)可檢測如大豆，玉米、番茄、油菜等多種轉(zhuǎn)基因作物。2、定量PCR技術(shù)在定性篩選PCR方法的基礎(chǔ)上，引入內(nèi)部參照反應(yīng)以消除檢測時的干擾，并與已知含量的系列GMO標(biāo)準(zhǔn)樣品的PCR結(jié)果進行比較，從而可以半定量地檢測待測樣品中的GMO含量。（1）半定量PCR通過同時擴增待測樣品和一系列標(biāo)準(zhǔn)樣品中共有核酸成分，由標(biāo)準(zhǔn)品建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線來判斷待測樣品中轉(zhuǎn)基因成分的含量。2、定量PCR技術(shù)（3）實時熒光定量PCR在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上，添加一條標(biāo)記了兩個熒光基團的探針，一個標(biāo)記在探針的5端，另一個標(biāo)記在探針的3端。優(yōu)點：采用了獨特的全封閉反應(yīng)，減少了污染，具有高度的靈敏性。缺點：熒光標(biāo)記探針會在一些食物基

5、質(zhì)中水解；且操作儀器較貴。應(yīng)用：日本、韓國和美國等采用這一方法分析了5個轉(zhuǎn)基因玉米品種和1種轉(zhuǎn)基因大豆。它是目前最具應(yīng)用前景的一種方法。PCR-ELISA將PCR技術(shù)與ELISA相結(jié)合的方法。既適合快速的定性篩選又可進行準(zhǔn)確的定量分析。巢式定性PCR（nested-PCR）由兩對巢式引物和兩輪PCR擴增所組成。此法極大地提高檢測的靈敏度和特異性，避免伴有假陽性或假陰性現(xiàn)象。此法在轉(zhuǎn)基因成分很少時也能檢測出來。（三）、基因芯片基因芯片又稱DNA微陣列，是指將許多特定的寡核苷酸片段或基因片段作為探針，有規(guī)律的排列固定于支持物上形成的DNA分子陣列?？梢澡b定和分析具有多種特征的轉(zhuǎn)基因食品。優(yōu)點：高效

6、、快捷、精確、快速。缺點：寡核苷酸或cDNA在玻片表面固定的效率低，自動雜交消耗成本高，不能保證相似條件下通過一實驗操作的結(jié)果重現(xiàn)性。轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)的一個新發(fā)展方向，未來會得到更廣泛的應(yīng)用。（四）、除草劑活性的生物分析法檢測未加工材料的某種特定特征的存在或缺失（如抗除草或耐除草性征）的方法。優(yōu)點：對可發(fā)芽的種子和谷粒的性征識別非常準(zhǔn)確，是種子公司的一種精確、廉價、實用的初步預(yù)防性檢測方法。缺點：只能用來檢測可發(fā)芽的種子或谷粒，不能檢測加工食品。二、轉(zhuǎn)基因食品安全管理及相關(guān)法規(guī)國際組織2000年制定的GMO貿(mào)易協(xié)定-卡塔赫納生物安全協(xié)定書已由62個國家簽署通過?？ㄋ占{生物安全協(xié)定書規(guī)定，任何含

7、有GMO的產(chǎn)品都必須事先告知進口商，他們的產(chǎn)品是否含有GMO，進口商或其政府有權(quán)拒絕進口含有GMO產(chǎn)品。美國采取著重管理產(chǎn)品本身是否對環(huán)境及身體健康造成威脅的可靠科學(xué)原則。2001年1月美國出臺轉(zhuǎn)基因食品管理草案，規(guī)定來源于植物且被用于人類或動物的轉(zhuǎn)基因食品須在進入市場之前至少120天，向FDA提出申請并提供食品的相關(guān)資料，以確認此類食品與相應(yīng)的傳統(tǒng)產(chǎn)品相比具有等同的安全性。在轉(zhuǎn)基因食品標(biāo)識方面，美國2001年出臺了轉(zhuǎn)基因食品自愿標(biāo)簽的指南，要求來源于轉(zhuǎn)基因技術(shù)的食品在包裝的標(biāo)簽上須注明該種食品的成分、營養(yǎng)物質(zhì)含量、所含過敏源及可能引起的后果等，但并不強制要求標(biāo)明食品是利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)生產(chǎn)的。歐

8、盟歐盟對轉(zhuǎn)基因食品的監(jiān)管最為嚴(yán)格，因此歐盟轉(zhuǎn)基因作物的種植面積很小、品種也很少，孟山都公司的轉(zhuǎn)基因玉米品種MON810是1998年至今，唯一一種經(jīng)歐盟委員會批準(zhǔn)可在歐洲種植的轉(zhuǎn)基因作物。2003年，歐盟頒布轉(zhuǎn)基因食品和飼料的管理條例和轉(zhuǎn)基因生物追溯性及標(biāo)識辦法以及含轉(zhuǎn)基因生物物質(zhì)的食品及飼料產(chǎn)品的追溯性管理條例，強制規(guī)定任何轉(zhuǎn)基因成分含量超過0.9%的食品和飼料都必須進行明確標(biāo)識。日本1991年，日本厚生省制定了轉(zhuǎn)基因食品和食品添加劑安全性審查準(zhǔn)則。日本的轉(zhuǎn)基因食品標(biāo)簽管理規(guī)定也較復(fù)雜，是轉(zhuǎn)基因食品強制標(biāo)簽和轉(zhuǎn)基因食品自愿標(biāo)簽的結(jié)合。日本將轉(zhuǎn)基因食品分為三類：一是與傳統(tǒng)農(nóng)產(chǎn)品和加工品無實質(zhì)等同性；二是與傳統(tǒng)農(nóng)產(chǎn)品具有實質(zhì)等同性，但外源基因或蛋白質(zhì)在加工