亞硒酸鈉對肝癌細(xì)胞發(fā)生自噬影響課件

1、自噬抑制劑3-MA克服肝癌細(xì)胞索拉菲尼耐藥的作用及機(jī)制研究專業(yè)：普通外科導(dǎo)師：王世明教授碩士研究生：梁源1自噬抑制劑3-MA專業(yè)：普通外科1 立論依據(jù) 研究現(xiàn)狀 研究方案 目錄1234 研究基礎(chǔ)5 參考文獻(xiàn)2 立論依據(jù) 肝癌 肝癌是臨床上最常見的惡性腫瘤之一，我國已成為全球肝癌發(fā)病率最高和死亡最多的國家。我國肝癌發(fā)病約347萬人年，占到全球的55；而死亡323萬人，占全球的45，因此，肝癌是一種具有“中國特色”的癌癥，嚴(yán)重地威脅人民健康和生命。 立論依據(jù) 研究背景（一）3 肝癌 A期（早期）B期 （中期）C期（晚期)D期（終末期）53.927.115.32.6按照BCLC分期，肝癌患者分布情況

2、調(diào)查結(jié)果：診斷為肝癌患者中53為晚期4A期（早期）B期 （中期）C期（晚期)D期（終末期）53.9 研究背景（二） 索拉菲尼 近年來，分子靶向藥物治療肝癌已成為新的研究熱點。其中索拉非尼(Sorafenib，商品名：Nexavar，多吉美)治療肝癌在臨床研究中取得了突破性進(jìn)展，能夠有效地阻止病情惡化，明顯地延長晚期肝癌患者的生存時間，成為第一個可以顯著延長晚期肝癌患者生存期的系統(tǒng)治療藥物和新標(biāo)準(zhǔn) 立論依據(jù)5 研究背景（二） 索拉菲消融術(shù) 0期PST 0, ChildPugh A級極早期（0） 1 HCC 2cm原位癌早期 (A)1個 HCC或3個結(jié)節(jié)2, ChildPugh C級HCC中期 (

3、B)多結(jié)節(jié)，PST 0AC期PST 02, ChildPugh AB級索拉非尼BCLC分期和治療策略(2010) 推薦索拉非尼作為晚期HCC標(biāo)準(zhǔn)治療 Alejandro F,Maria ER,Carlos R,et al.Semin Liver Dis .2010;30:61-74.6消融術(shù) 0期PST 0, ChildPugh A級極早期索拉非尼被各大指南推薦為標(biāo)準(zhǔn)用藥美國國家綜合癌癥網(wǎng)（NCCN）肝癌臨床實踐指南美國肝病研究協(xié)會（AASLD）肝癌臨床治療指南巴塞羅那（BCLC）肝癌分期和治療策略 亞太肝病學(xué)會（APASL）肝癌治療指南原發(fā)性肝癌規(guī)范化診治專家共識（中國） 日本肝臟病學(xué)會（J

4、SH）共識肝癌治療策略歐洲（EASL-EORTC）肝癌臨床實踐指南7索拉非尼被各大指南推薦為標(biāo)準(zhǔn)用藥美國國家綜合癌癥網(wǎng)（NCC索拉非尼34. Li Liu, et al. Cancer Res. 2006;66:11851-58 .抑制血管生成VEGFPDGF抑制腫瘤細(xì)胞增殖（抑制種子生長）殘余腫瘤細(xì)胞微小病灶循環(huán)腫瘤細(xì)胞抑制腫瘤血管生成（使土壤貧瘠）索拉非尼的雙重抗腫瘤作用8索拉非尼34. Li Liu, et al. Cancer 索拉菲尼抗腫瘤作用索拉菲尼通過抑制PI3KAktmTORp70S6K信號通路的磷酸化。促進(jìn)凋亡，同時激活自噬性程序性死亡?；罨疛NK途徑誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生自噬性細(xì)

5、胞死亡索拉菲尼9索拉菲尼抗腫瘤作用索拉菲尼通過抑制PI3KAktmTOR型程序性細(xì)胞死亡：凋亡型程序性細(xì)胞死亡：自噬壞死細(xì)胞死亡方式研究背景（三）自噬及凋亡的關(guān)系10型程序性細(xì)胞死亡：自噬壞死細(xì)胞死亡方式研究背景（三）自噬及 自噬模式圖 研究背景11 自噬模式圖 研究背景11 研究背景壞死凋亡12 研究背景壞死凋亡12自噬及凋亡的關(guān)系1自噬抑制凋亡：自噬通過降解受損蛋白損傷等途徑抑制凋亡。2自噬促進(jìn)凋亡：自噬自身并不引起細(xì)胞死亡，但它為凋亡小體的形成和吞噬作用提供能量，從而促進(jìn)凋亡的發(fā)生。3自噬及凋亡共存并可相互轉(zhuǎn)換：在自噬晚期使用特異性自噬抑制劑則使自噬性死亡轉(zhuǎn)向凋亡，有文獻(xiàn)報道imatin

6、ib可以致惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生自噬性死亡，然而在自噬晚期使用自噬抑制劑可使自噬性死亡轉(zhuǎn)向凋亡，而當(dāng)細(xì)胞凋亡被抑制劑阻斷細(xì)胞則轉(zhuǎn)向自噬，此時不論抑制凋亡還是自噬，細(xì)胞均轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪粭l途徑的細(xì)胞死亡。 研究背景13自噬及凋亡的關(guān)系1自噬抑制凋亡：自噬通過降解受損蛋白損傷等自噬對腫瘤的雙重作用 研究背景目前對自噬對腫瘤中到底是其抑制還是保護(hù)作用仍是倍具爭議。（1）一方面，自噬可以殺死腫瘤細(xì)胞。（2）另一方面，自噬可以保護(hù)腫瘤細(xì)胞。由于腫瘤細(xì)胞具有高代謝的特點，腫瘤持續(xù)快速增大營養(yǎng)供應(yīng)不足，自噬被激活將損傷的細(xì)胞器及蛋白降解成可利用的活性成分，供給給腫瘤細(xì)胞來度過這一危機(jī)。這一過程及肝癌細(xì)胞對索拉菲尼

7、耐藥形成相關(guān)。14自噬對腫瘤的雙重作用 研究背景目前對自噬對腫瘤中到凋亡自噬自噬肝癌索拉菲尼耐藥機(jī)制（一）凋亡自噬激活后，一方面，降解受損細(xì)胞器及蛋白為腫瘤提供營養(yǎng)。另一方面抑制凋亡，減少腫瘤細(xì)胞壞死。使得癌細(xì)胞存活。自噬對腫瘤形成了保護(hù)作用。該過程降低了肝癌細(xì)胞對于索拉菲尼的敏感性。我們推測這是是肝癌細(xì)胞對索拉菲尼耐藥形成原因之一。3MA腫瘤持續(xù)快速增大營養(yǎng)供應(yīng)不足1.索拉菲尼通過抑制P13KAktmTORp70S6K信號通路的磷酸化。促進(jìn)凋亡，激活自噬。2.活化JNK途徑誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生自噬性細(xì)胞死亡 激活早期晚期抑制 研究現(xiàn)狀干預(yù)15凋亡自噬自噬肝癌索拉菲尼耐藥機(jī)制（一）凋亡自噬激活后，

8、一方面2.PI3k/Akt通路的激活介導(dǎo)了肝癌細(xì)胞對索拉非尼的繼發(fā)性耐藥 PI3k/Akt是促進(jìn)細(xì)胞自噬發(fā)生的重要傳導(dǎo)通路。PI3k可被生長因子等刺激物激活生成PIP3，再激活其下游的Atk蛋白繼而磷酸化其一系列底物，從而達(dá)到對細(xì)自噬的調(diào)控。該通路的激活及腫瘤細(xì)胞的耐藥性的產(chǎn)生密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)耐藥細(xì)胞中pAkt有明顯上調(diào)。而抑制Akt的表達(dá)，則可逆轉(zhuǎn)耐藥細(xì)胞對索拉非尼的耐藥性。該研究結(jié)果表明，PI3k/Akt通路的激活介導(dǎo)了肝癌細(xì)胞對索拉非尼的繼發(fā)性耐藥。 研究現(xiàn)狀肝癌索拉菲尼耐藥機(jī)制（二）16 研究現(xiàn)狀肝癌索拉菲尼耐藥機(jī)制（二）16. 本研究構(gòu)建了裸鼠原位肝癌索拉菲尼耐藥模型，觀察自噬抑制

9、劑3-MA對裸鼠原位肝癌索拉菲尼耐藥模型皮下移植瘤的作用。并檢測 PI3KAKT途徑及JNK途徑相關(guān)蛋白水平。探討自噬抑制劑3-MA是否通過上述途徑抑制自噬，代償性激活凋亡，增加耐藥肝癌細(xì)胞對索拉菲尼的敏感性，對耐藥性形成克服或逆轉(zhuǎn)，從而抑制腫瘤生長，為臨床上治療對索菲拉尼耐藥的肝癌患者的用藥提供實驗依據(jù)。 研究目標(biāo)17. 本研究構(gòu)建了裸鼠原位肝癌索拉菲尼耐藥模型， 肝癌索拉菲尼耐藥細(xì)胞株的體外培養(yǎng) 建立移植瘤裸鼠模型空白對照組 索拉菲尼組3MA+索拉菲尼組低劑量組高劑量組高劑量組低劑量組腫瘤形態(tài)學(xué)觀察 觀察結(jié)束后取腫瘤組織及細(xì)胞組織繪制體質(zhì)量曲 線稱取腫瘤組織重量計算抑瘤率Western b

10、lotting 檢測pAtk、pJNK、Caspase3表達(dá)免疫組織化學(xué)染色法檢測pAk 、pJNK透射電鏡觀察自噬體及免疫熒光檢測MAP1-LC3噬水平結(jié)果分析及統(tǒng)計處理 研究內(nèi)容及 技術(shù)路線圖18 肝癌索拉菲尼耐藥細(xì)胞株的體外培養(yǎng) （1）統(tǒng)計數(shù)據(jù)用SPSS20.0 軟件包進(jìn)行分析。（2）實驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差表示。（3）采用單因素方差分析。 統(tǒng)計方法19 統(tǒng)計方法19（1）成功建立人肝癌細(xì)胞索菲拉尼耐藥株鼠移植瘤的動物模型（2）需繼續(xù)查閱大量文獻(xiàn)確定小鼠灌胃給藥濃度及劑量;（3）熟練掌握干預(yù)動物給藥方式。 （4）檢測各個指標(biāo)的實驗技術(shù)方法需熟練掌握； 擬解決關(guān)鍵問題20 擬解決關(guān)鍵問題20

11、實驗室及實驗器材等完備、試劑的完備，已基本掌握動物飼養(yǎng)、免疫組化等試驗操作的基本要領(lǐng)。已參閱大量相關(guān)文獻(xiàn)立論依據(jù)充分，且經(jīng)費已經(jīng)落實導(dǎo)師帶領(lǐng)的團(tuán)隊進(jìn)行了大量關(guān)于自噬的研究可作為前期研究工作積累Product A 研究基礎(chǔ)及可行性分析21實驗室及實驗器材等完備、試劑的完備，已基本掌握動物飼養(yǎng)、免疫預(yù)期研究成果231索拉菲尼及自噬抑制劑3-MA聯(lián)用可克服肝癌細(xì)胞對索拉菲尼的耐藥，明顯增強(qiáng)索拉菲尼治療肝癌效果自噬抑制劑可逆轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞對索拉菲尼耐藥，可能通過抑制及自噬有關(guān)的PI3KAKT途徑及JNK途徑。發(fā)表1-2篇論文 預(yù)期研究成果22預(yù)期研究成果231索拉菲尼及自噬抑制劑3-MA聯(lián)用可克服肝癌提出

12、了一種新的具有潛在應(yīng)用價值的輔助治療肝癌的新思路。裸鼠體內(nèi)水平研究自噬克服肝癌細(xì)胞索拉菲尼耐藥作用及機(jī)制研鮮有報道 1 2本課題創(chuàng)新之處23提出了一種新的具有潛在應(yīng)用價值的輔助治療肝癌的新思路。裸鼠體2015.01 -2014.04 2015.06-2015.08查閱文獻(xiàn)撰寫綜述及開題報告培養(yǎng)細(xì)胞,裸鼠造模。各組各項指標(biāo)的測定統(tǒng)計分析2015.08-2015.102015.04-2015.06撰寫畢業(yè)論文準(zhǔn)備答辯研究計劃及預(yù)期進(jìn)展242015.01 -2014.04 2015.06-2015.支出科目 金額（萬元） 計算根據(jù)及理由合計 0.6科研業(yè)務(wù)費 0.02 文獻(xiàn)檢索、打印、論文裝訂 實驗

13、材料費 0.5 實驗試劑、材料、藥品儀器設(shè)備費協(xié)作費 0.05 指標(biāo)檢測 研究組織實施費 0.03 日常研究組織. 經(jīng)費預(yù)算25支出科目 金額（萬元） 計算根據(jù)及理1.Wilson, G.S., et al., Tumoricidal effects of the JAK inhibitor Ruxolitinib (INC424) on hepatocellular carcinoma in vitro. Cancer Letters, 2013. 341(2): p. 224-230. 2.Chen, K.F., et al., Activation of Phosphatidylinos

14、itol 3-Kinase/Akt Signaling Pathway Mediates Acquired Resistance to Sorafenib in Hepatocellular Carcinoma Cells. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 2011. 337(1): p. 155-161. 3.聶艷麗 and 南克俊, 分子靶向藥物在肝細(xì)胞肝癌治療中的研究進(jìn)展. 現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué), 2014(8): p. 1996-1999. 4.胡博, et al., 姜黃素納米粒(NanoCurcTM)聯(lián)合索拉非尼

15、對肝細(xì)胞癌(HCC)的協(xié)同抑制作用. 復(fù)旦學(xué)報（醫(yī)學(xué)版）, 2014. 41(2): p. 143- 148. 5.暢建平, 細(xì)胞自噬在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用. 腫瘤研究及臨床, 2014. 26(5): p. 358-360. 6.朱云, 程旸 and 李愛民, 原發(fā)性肝細(xì)胞癌對索拉非尼耐藥機(jī)制的研究進(jìn)展. 中國藥理學(xué)通報, 2013. 29(6): p. 752-755. 7.任金妹, et al., 姜黃素抗腫瘤及逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的研究進(jìn)展. 中國藥師, 2013. 16(10): p. 1582-1585. 8. Maiuri MC，Zalckvar E，Kimchi A，et alSelf

16、-eating and selfkilling：erosstalk between autophagy and apoptosisJNat RevMol Cell Bi012007，8(9)：741-752 9.Rautou PE，Mansouri A，Lebreec D，et al、Autophagy in liver diseasesJJ Hepatol，2010，53(6)：1123一1134 10. Clark S JCellular differentiation in the kidneys of newborn micestudies with the electron micr

17、oscopeJJ Biophys Biochem Cytol，1957，3(3)：349-362 參考文獻(xiàn)261.Wilson, G.S., et al., Tumor 11.代景友, 抑制自噬對肝癌耐藥性的影響及機(jī)制研究. 2013, 哈爾濱醫(yī)科大學(xué). 12.郝慧瑤, 索拉菲尼誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞程序性細(xì)胞死亡的作用及其機(jī)制研究. 2013, 河北醫(yī)科大學(xué).13.劉捷, et al., 靶向腫瘤細(xì)胞自噬通路的植物天然產(chǎn)物研究進(jìn)展. 國際藥學(xué)研究雜志, 2013(06): p. 688-694.14.傅思睿 and 陸驪工, 索拉菲尼在肝癌靶向治療中的應(yīng)用. 中華醫(yī)學(xué)雜志, 2012. 92(29)

18、: p. 2084-2086.14.傅思睿 and 陸驪工, 索拉菲尼在肝癌靶向治療中的應(yīng)用. 中華醫(yī)學(xué)雜志, 2012. 92(29): p. 2084-2086. 15.姚超, et al., 索拉菲尼誘導(dǎo)的肝癌耐藥細(xì)胞株的建立及其生物學(xué)特性. 第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報, 2012. 34(14): p. 1366-1369. 16.張棟, et al., PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及卵巢癌順鉑耐藥相關(guān)性的研究. 天津醫(yī)藥, 2011(04): p. 361-363. 17. Yang Z，Klionsky DJEaten alive：a history of maeroautophagyJNa

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20、amamoto A，Hatano M，el alDissection of autophagosome formation using Ap95一deficient Iouse embryonic stem cellsJJ Cell Biol，2001，152(4)：657-668 參考文獻(xiàn)27 參考文獻(xiàn)2721.李先亮 and 陳大志, 硬化型肝癌靶向治療的目標(biāo)及應(yīng)用進(jìn)展. 中華肝膽外科雜志, 2011. 17(12): p. 963-968. 22.杜海磊, et al., 索拉非尼抑制肝癌細(xì)胞增殖中自噬的作用及其機(jī)制. 外科理論與實踐, 2011(03): p. 270-274.23.穆

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