生物大分子相互作用課件

1、生物大分子相互作用徐文弟2010.9.29分子生物學(xué)研究的重要領(lǐng)域遺傳中心法則基因表達(dá)調(diào)控細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) 關(guān)于中心法則Genome(cells repertoire of DNA)Transcriptome(cells repertoire of RNA transcripts)Proteome(cells repertoire of proteins)單個(gè)基因單個(gè)細(xì)胞中心法則組學(xué)關(guān)于基因表達(dá)調(diào)控Regulation of Gene ExpressionChromatinepigenetic controlRNA silencingProteindegradation一般而言的基因表達(dá)調(diào)控范疇基

2、因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基本要素（一）RNA聚合酶 (RNA Polymerase)（二）特異DNA序列 (cis-acting elements)（三）調(diào)節(jié)蛋白 (trans-acting factors)Gene expression regulation at the level of DNA (transcriptional regulation)-highly sequence-dependent-varied regulation for different genes順式作用元件：是決定真核基因轉(zhuǎn)錄活性的關(guān)鍵因素之一exon1intron1exon nintron n上游下游轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)增強(qiáng)子沉

3、默子啟動(dòng)子TATA盒GC盒CAAT盒增強(qiáng)子反式作用因子和順式作用蛋白： 是真核基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白在真核細(xì)胞核中，有許多蛋白質(zhì)能夠幫助RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄RNA。這類蛋白質(zhì)統(tǒng)稱轉(zhuǎn)錄因子（transcription factors，TF）或轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白（transcription regulatory protein）。以反式作用方式調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子稱為反式作用因子（trans-acting factor），以順式作用方式調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子稱為順式作用蛋白（cis-acting protein） 。 真核基因的調(diào)節(jié)蛋白 反式作用因子 (trans-acting factor) 能直接或間接與

4、順式作用元件相互作用，進(jìn)而調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的一類調(diào)節(jié)蛋白，統(tǒng)稱為反式作用因子。 按其功能不同，常有以下三類： 基本轉(zhuǎn)錄因子 :識(shí)別promoter元件 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子:識(shí)別enhancer或silencer 共調(diào)節(jié)因子：不能進(jìn)行DNA-蛋白質(zhì)相互作用RNA聚合酶在轉(zhuǎn)錄因子幫助下，形成的轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物polTFHTAFTFFTAFTAFTFATFBTBPTATA DNATAF: TBP associated factorsholoenzyme（1）基本轉(zhuǎn)錄因子 (general transcription factor) 能夠直接或間接與啟動(dòng)子核心序列TATA盒特異結(jié)合、并啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的一類調(diào)節(jié)蛋白。TB

5、P: TATA-box binding proteinTFII: pol II associated TF(2) 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子 (transcription factor, TF) 這類調(diào)節(jié)蛋白能識(shí)別并結(jié)合轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的上游序列和遠(yuǎn)端的增強(qiáng)子元件，通過(guò)DNA蛋白質(zhì)相互作用而調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活性。決定不同基因的時(shí)間、空間特異性表達(dá).轉(zhuǎn)錄激活因子(transcriptional activator)轉(zhuǎn)錄阻遏因子(transcriptional repressor)（3）共調(diào)節(jié)因子 (transcriptional regulator/ co-factor) 首先與轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生蛋白蛋白相互作用，進(jìn)而影響它們的

6、分子構(gòu)象，以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活性,本身無(wú)DNA結(jié)合活性。 如果與轉(zhuǎn)錄激活因子有協(xié)同作用共激活因子； 與轉(zhuǎn)錄阻遏因子有協(xié)同作用共阻遏因子。最常見(jiàn)的 DNA binding domain鋅指(zinc finger)C CysH His常結(jié)合GC box典型的類固醇激素受體結(jié)構(gòu)示意圖堿性亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄激活蛋白與調(diào)控區(qū)DNA相結(jié)合的示意圖 堿性亮氨酸拉鏈（bZIP: basic Leu Zip)結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄激活因子序列比較 bHLH蛋白(basic Helix-Loop-Helix)同源域(Homeodomain)蛋白通過(guò)其第三個(gè)螺旋與雙鏈DNA的大溝相結(jié)合，其N端的延伸部分則與DNA的小溝相結(jié)合，提高了穩(wěn)定

7、性 關(guān)于細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)存在復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)信息轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程信號(hào)分子在細(xì)胞內(nèi)的合成信號(hào)分子從發(fā)出信號(hào)的細(xì)胞釋放信號(hào)分子轉(zhuǎn)運(yùn)至靶細(xì)胞靶細(xì)胞上的特異性受體識(shí)別信號(hào)分子靶細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的啟動(dòng)靶細(xì)胞的代謝、功能或分化改變信號(hào)分子的清除及靶細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)的終止 在細(xì)胞中，各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子相互識(shí)別、相互作用將信號(hào)進(jìn)行轉(zhuǎn)換和傳遞，構(gòu)成信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路（signal transduction pathway）。 不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之間發(fā)生交叉調(diào)控（crosstalking）形成復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)（signal transduction network）系統(tǒng) 。蛋白激酶的逐級(jí)磷酸化是細(xì)胞信號(hào)通路的重要特征 MAP

8、K的逐級(jí)磷酸化是將膜受體接受的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至核內(nèi)基因表達(dá)控制的重要環(huán)節(jié)，是細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和應(yīng)激反應(yīng)的共同信號(hào)通路蛋白質(zhì)復(fù)合物：細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)細(xì)胞中的各種蛋白分子不是獨(dú)立的，而是聚集在一起形成蛋白質(zhì)復(fù)合體，共同完成各種生命活動(dòng)。 EGFR介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程生物大分子相互作用: 是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)控制基因表達(dá)的物質(zhì)基礎(chǔ)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路形成要求信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子之間可特異性地相互識(shí)別和結(jié)合，即蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，這是由信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子中存在的一些特殊結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的。這些結(jié)構(gòu)域被稱為蛋白相互作用結(jié)構(gòu)域（protein interaction domain）。 蛋白相互作用結(jié)構(gòu)域特點(diǎn) 一個(gè)信號(hào)分子可以含有兩種以

9、上的蛋白質(zhì)相互作用結(jié)構(gòu)域，因此可以同時(shí)與兩種以上的其他信號(hào)分子結(jié)合； 同一類蛋白質(zhì)相互作用結(jié)構(gòu)域可存在于多種不同的分子中。這些結(jié)合結(jié)構(gòu)域的一級(jí)結(jié)構(gòu)不同，因此對(duì)所結(jié)合的信號(hào)分子具有選擇性，這是信號(hào)分子相互作用特異性的基礎(chǔ)； 這些結(jié)構(gòu)域本身均為非催化結(jié)構(gòu)域。 蛋白相互作用結(jié)構(gòu)域縮寫識(shí)別模體Src homology 2 SH2含磷酸化酪氨酸模體Src homology 3 SH3富含脯氨酸模體pleckstrin homologyPH磷脂衍生物Protein tyrosine binding PTB含磷酸化酪氨酸模體WW WW富含脯氨酸模體蛋白相互作用結(jié)構(gòu)域及其識(shí)別模體 銜接蛋白和支架蛋白：連接信號(hào)

10、通路與網(wǎng)絡(luò)銜接頭蛋白（adaptor protein）： 是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中不同信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的接頭，連接上游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子與下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。發(fā)揮作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)：蛋白相互作用結(jié)構(gòu)域。功能：募集和組織信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物，即引導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子到達(dá)并形成相應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物。大部分銜接蛋白的結(jié)構(gòu)中只有2個(gè)或2個(gè)以上的蛋白相互作用結(jié)構(gòu)域，除此以外幾乎不含有其他的序列。 銜接蛋白連接信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子基因表達(dá)與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的偶聯(lián)機(jī)制Coupling of Gene Expression and Cell Signalning轉(zhuǎn)錄因子染色質(zhì)相關(guān)蛋白R(shí)NA加工蛋白R(shí)NA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白細(xì)胞周期蛋白細(xì)胞骨架NH2AAAAAm7GTr

11、anslation信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)信號(hào)接收信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) 應(yīng)答反應(yīng) 細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的基本方式示意圖 影響轉(zhuǎn)錄共調(diào)節(jié)因子p300的信號(hào)通路 關(guān)于ATP合酶ATP合酶組成可旋轉(zhuǎn)的發(fā)動(dòng)機(jī)樣結(jié)構(gòu) F0的2個(gè)b亞基的一端錨定F1的亞基，另一端通過(guò)和33穩(wěn)固結(jié)合，使a、b2和33、亞基組成穩(wěn)定的定子部分。部分和亞基共同形成穿過(guò)33間中軸，還與1個(gè)亞基疏松結(jié)合作用，下端與嵌入內(nèi)膜的c亞基環(huán)緊密結(jié)合。c亞基環(huán)、和亞基組成轉(zhuǎn)子部分。 質(zhì)子順梯度向基質(zhì)回流時(shí)，轉(zhuǎn)子部分相對(duì)定子部分旋轉(zhuǎn)，使ATP合酶利用釋放的能量合成ATP。 關(guān)于陽(yáng)性菌篩選 互補(bǔ)利用互補(bǔ)原理篩選重組體pUC18 關(guān)于生物大分子相互作用研究的關(guān)鍵技術(shù)酵母雙雜交技

12、術(shù)的基本原理46酵母單雜交技術(shù)的基本原理47酵母三雜交基本原理 生物大分子研究相關(guān)技術(shù) 隨著生命現(xiàn)象的研究逐漸由獲取基因序列信息轉(zhuǎn)向研究基因功能,一門新的學(xué)科蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)運(yùn)而生。 蛋白質(zhì)組是一個(gè)在空間和時(shí)間上動(dòng)態(tài)變化的整體,其功能往往是通過(guò)蛋白質(zhì)之間或與核酸之間相互作用而表現(xiàn)出來(lái)的,這種相互作用存在于機(jī)體每個(gè)細(xì)胞的生命活動(dòng)過(guò)程中,相互交叉形成網(wǎng)絡(luò),構(gòu)成細(xì)胞中一系列重要生理活動(dòng)的基礎(chǔ)。 對(duì)于蛋白質(zhì)相互作用的研究就成為蛋白質(zhì)組學(xué)中最主要研究?jī)?nèi)容之一 迄今已發(fā)展了包括經(jīng)典的噬菌體展示技術(shù)、酵母雙雜交系統(tǒng)以及新近發(fā)展并廣泛應(yīng)用的串聯(lián)親和純化和熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)、表面等離子共振技術(shù)等多種有效的研究蛋白

13、質(zhì)間相互作用的高通量分析方法,為蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)相互作用研究當(dāng)前進(jìn)展1.利用蛋白質(zhì)片段互補(bǔ)研究其相互作用和文庫(kù)篩選2.通過(guò)核糖體展示進(jìn)行相互作用的體外篩選和進(jìn)化3.利用膜上肽合成法分析蛋白相互作用4.蛋白質(zhì)成束法增強(qiáng)其相互作用的檢測(cè)5.用計(jì)算方法分析全基因組蛋白質(zhì)的相互作用6.通過(guò)蛋白質(zhì)相互作用發(fā)展新的治療方法7.利用核磁共振法分析蛋白質(zhì)相互作用蛋白質(zhì)相互作用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)標(biāo)簽融合蛋白（Labeled fusion protein）免疫共沉淀（co-immunoprecipitation）酵母雙雜交（Yeast two hybrid system）熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)（FR

14、ET）表面等離子共振技術(shù)（Biacore SPR）原子力顯微鏡技術(shù)（Atomic force microscopy）噬菌體展示技術(shù)（Phage display）免疫共沉淀熒光共振轉(zhuǎn)移技術(shù)噬菌體展示技術(shù)酵母雙雜交技術(shù)基因外抑制子合成致死篩選分子生物學(xué)方法親和印跡Pull down 試驗(yàn)遺傳學(xué)方法蛋白質(zhì)相互作用研究方法生物物理學(xué)方法酵母雙雜交系統(tǒng)( Yeast two2hybrid system,Y2H) 酵母雙雜交系統(tǒng)( Yeast two2hybrid system,Y2H)是1989年由Fields等提出并初步建立的,主要用于研究真核生物的蛋白質(zhì),到現(xiàn)在,雙雜交系統(tǒng)已經(jīng)成為檢測(cè)和鑒定蛋白質(zhì)相

15、互作用的標(biāo)準(zhǔn)方法,并且在旨在建立一系列蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系的蛋白質(zhì)組研究中扮演著重要角色。 Y2H的建立是基于人們對(duì)酵母半乳糖苷酶基因的轉(zhuǎn)錄激活因子GAL4的詳細(xì)了解。GAL4包括兩個(gè)可以獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域: N 末端的DNA 結(jié)合域(DNA2binding domain,DNA2BD)和C末端的轉(zhuǎn)錄激活域( Transcrip tion activating domain, DNA2AD ) 。DNA2BD可以與DNA 分子的上游激活序列結(jié)合,DNA2AD則可以激活下游基因的轉(zhuǎn)錄,只有當(dāng)兩者在空間上充分接近時(shí)才會(huì)共同作用激活轉(zhuǎn)錄活性。 雙雜交技術(shù)正是利用了GAL4的這一特點(diǎn),將欲研究的兩個(gè)目標(biāo)蛋白的

16、編碼序列分別與GAL4的結(jié)合域和激活域的編碼序列融合,構(gòu)建成兩個(gè)雜交系統(tǒng);再將這兩個(gè)雜交系統(tǒng)共同轉(zhuǎn)化至含有報(bào)告基因的酵母細(xì)胞株;若兩個(gè)目標(biāo)蛋白發(fā)生相互作用,則會(huì)使DNA - BD和DNA - AD在空間上靠近進(jìn)而激活報(bào)告基因的表達(dá)。 酵母雙雜交系統(tǒng)簡(jiǎn)單快速,最常用于鑒定與已知蛋白相互作用的未知蛋白,同時(shí)也是發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)相互作用以及確定相互作用結(jié)構(gòu)域的重要研究手段。 TRPC通道是一組Ca2 +流量調(diào)節(jié)通道蛋白,研究證明磷脂酶C1 (phospholipase C1, PLC21)結(jié)合并控制該通道,對(duì)降低Ca2 +流量是必要的,但一直沒(méi)有鑒定出它們相互作用的結(jié)構(gòu)域。 Rossum等人應(yīng)用Y2H

17、系統(tǒng),構(gòu)建了pGBKT72BD2TR2PC3和pGADT72AD2 PLC21兩個(gè)載體,共同轉(zhuǎn)化到酵母當(dāng)中,以Lacz為報(bào)告基因,發(fā)現(xiàn)PLC21只特異的與TRPC3相結(jié)合。實(shí)驗(yàn)人員又構(gòu)建了載有不同氨基酸長(zhǎng)度TRPC3 與PLC21的雙雜交系統(tǒng),發(fā)現(xiàn)TRPC3與PLC21的相互作用只依賴于TRPC3中對(duì)應(yīng)的PH相似結(jié)構(gòu)域中4046個(gè)氨基酸,從而建立了一個(gè)廣泛的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)模型。融合蛋白pull-down實(shí)驗(yàn) 融合蛋白pull-down技術(shù)基本原理是將一種蛋白質(zhì)固定于某種基質(zhì)上(如Sepharose),當(dāng)細(xì)胞抽提液經(jīng)過(guò)該基質(zhì)時(shí)，可與該固定蛋白相互作用的配體蛋白被吸附，而沒(méi)有被吸附的“雜質(zhì)”則隨洗脫液流

18、出。被吸附的蛋白可以通過(guò)改變洗脫液或洗脫條件而回收下來(lái)。 為了更有效地利用pull-down技術(shù)，可以將待純化地蛋白以融合蛋白地形式表達(dá)，即將“誘餌”蛋白與一種易于純化地配體蛋白相融合。1988年Smith等利用谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（glutathione-S-transferase ,GST）融合標(biāo)簽從細(xì)菌中一步純化出GST融合蛋白。從此GST融合蛋白在蛋白質(zhì)相互作用研究領(lǐng)域里得到極大的推廣。 GST融合蛋白在經(jīng)過(guò)固定有GST(glutathione)的色譜柱時(shí)，就可以通過(guò)GST 與GSH的相互作用而被吸附。當(dāng)再有細(xì)胞抽提物過(guò)柱，就可得到能夠與“誘餌”蛋白相互作用的興趣蛋白。 一般來(lái)說(shuō)GST融合

19、蛋白pull-down方法用于兩個(gè)方面： 一、鑒定與已知融合蛋白相互作用的未知蛋白質(zhì) 二、鑒定兩個(gè)已知蛋白質(zhì)之間是否存在相互作用洗脫（2）結(jié)合（3）檢測(cè)（6）收集（5）洗脫（4）固定誘餌蛋白（1）噬菌體展示 噬菌體展示技術(shù)是在深刻理解噬菌體遺傳學(xué)和生理學(xué)特性的基礎(chǔ)上產(chǎn)生的。 其原理是將蛋白質(zhì)文庫(kù)整合到一個(gè)簡(jiǎn)單的噬菌體顆粒中，利用目的蛋白質(zhì)與特異配基的親和力，篩選和配基特異結(jié)合的蛋白質(zhì)。 噬菌體展示技術(shù)一般要經(jīng)過(guò)多輪的篩選，這樣就可以得到在文庫(kù)中含量很低的與配基特異作用的蛋白質(zhì)。 噬菌體展示技術(shù) Phage display techniques, PDT 大腸桿菌絲狀噬菌體包括f1、fd和M13

20、,它們只感染含F(xiàn)因子的大腸桿菌。1985年,美國(guó)Missouri大學(xué)Smith博士等人將R I核酸內(nèi)切酶基因片段連接到絲狀噬菌體fd編碼次要外殼蛋白的基因中,成功地得到了在外殼蛋白中融合表達(dá)了酶分子的噬菌體顆粒。 后經(jīng)驗(yàn)證,該噬菌體能被EcoR核酸內(nèi)切酶抗體有效中和,說(shuō)明展示在噬菌體外殼表面的酶分子具有與天然酶分子相同或極其相近的構(gòu)象和活性,這一試驗(yàn)的成功標(biāo)志著噬菌體展示技術(shù)的誕生。 噬菌體展示技術(shù)是在噬菌體展示肽庫(kù)建立之后才開(kāi)始廣泛應(yīng)用到蛋白質(zhì)相互作用研究的。 1990年Scott等人利用噬菌體展示技術(shù)構(gòu)建了隨機(jī)多肽文庫(kù),該文庫(kù)由特定長(zhǎng)度的隨機(jī)短肽組成,理論上包含了某一固定長(zhǎng)度短肽所有氨基酸

21、的排列組合方式。 由于蛋白質(zhì)間的識(shí)別與結(jié)合主要取決于局部肽段中少數(shù)幾個(gè)氨基酸,所以用受體蛋白對(duì)隨機(jī)肽庫(kù)進(jìn)行親和篩選,就能得到之結(jié)合的短肽序列,根據(jù)此短肽的序列,就可以得到與目的蛋白相互作用所依賴的氨基酸殘基,從而可以進(jìn)一步研究蛋白質(zhì)之間的分子識(shí)別,酶與底物的結(jié)合等。 突破了傳統(tǒng)研究蛋白質(zhì)相互作用時(shí)需對(duì)其結(jié)構(gòu)詳盡了解的限制。絲狀噬菌體蝌蚪形噬菌體噬菌體、T4噬菌體、T7噬菌體M13噬菌體 噬菌體展示技術(shù)最大的特點(diǎn)在于被展示在噬菌體表面的多肽或蛋白質(zhì)可保持相對(duì)獨(dú)立的空間結(jié)構(gòu)和生物活性,建立起了基因型和表現(xiàn)型之間的一致性。 到現(xiàn)在已相繼成功構(gòu)建了f1、M13、T4 等噬菌體表達(dá)載體,為蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)

22、展提供了有利的工具。 Jespers等利用噬菌體展示技術(shù),通過(guò)熱變性發(fā)展了一種選擇抗凝集蛋白的方法,這一方法的建立對(duì)于抗凝集蛋白的選擇、鑒定;防止或促進(jìn)蛋白的凝集反應(yīng)以及診斷由凝集蛋白引起的疾病等方面都意義重大。串聯(lián)親和純化Tandem affinity purification , TAP 串聯(lián)親和純化( TAP) 1999年Rigaut等人共同提出了一套分離復(fù)合蛋白的新方法串聯(lián)親和純化( Tandem affinity purification , TAP) ,兼具標(biāo)準(zhǔn)親和純化和免疫共沉淀兩種生化方法的優(yōu)點(diǎn),為蛋白質(zhì)復(fù)合體的分離鑒定提供了一條新路徑。 串聯(lián)親和純化技術(shù)原理 串聯(lián)親和純化技術(shù)

23、首先需通過(guò)基因工程給被分離純化蛋白的一端加一個(gè)TAP標(biāo)簽,該標(biāo)簽由IgG結(jié)合結(jié)構(gòu)域( ProtA ) 及一個(gè)鈣調(diào)蛋白結(jié)合多肽(CBP)組成,結(jié)構(gòu)域與多肽之間由一個(gè)TEV蛋白酶切位點(diǎn)隔開(kāi)。 通過(guò)基因重組將細(xì)胞內(nèi)源性的目標(biāo)蛋白基因置換為帶有TAP標(biāo)簽的基因。 溫和裂解細(xì)胞,獲取細(xì)胞抽提物,將抽提物加入IgG親和柱,TAP標(biāo)簽的ProtA端會(huì)與IgG形成強(qiáng)結(jié)合,在用洗脫液洗脫掉大部分非特異性結(jié)合物和雜蛋白后,再用含有TEV蛋白酶的洗脫液將蛋白質(zhì)復(fù)合體切割下來(lái)。 在鈣離子參與下,被切割下來(lái)帶有CBP的蛋白質(zhì)復(fù)合體與鈣調(diào)蛋白緊密結(jié)合,充分洗脫,就可以進(jìn)一步去除非特異作用的蛋白質(zhì)雜質(zhì),最后純化出高純度的目

24、的蛋白復(fù)合體。 利用串聯(lián)親和純化技術(shù),通過(guò)對(duì)洗脫后的復(fù)合體作質(zhì)譜分析或電鏡觀察,可以快速的發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中新的蛋白質(zhì)復(fù)合體或鑒定出復(fù)合體中的新組分。TAP親和層析純化原理 TAP親和層析純化應(yīng)用實(shí)例 Dziembowski等人應(yīng)用TAP技術(shù),純化分析了釀酒酵母(Saccharom yces cerevisie)前體mRNA拼接酶復(fù)合體2U2微小核糖核蛋白顆粒( small nuclear ribo2nucleop rotein particle, snRNP)關(guān)聯(lián)拼接因子SF3a和SF3b。在對(duì)SF3b的純化中分離出了一個(gè)新的重要的蛋白亞基Ysf3p。 按照先前的觀點(diǎn),認(rèn)為在酵母SF3b中存在一個(gè)S

25、nu17p亞基,是人類SF3b因子中p14 亞基的直系同源物, 在此次試驗(yàn)中卻發(fā)現(xiàn)Snu17p不屬于酵母SF3b因子,而是屬于本實(shí)驗(yàn)中新發(fā)現(xiàn)的另一個(gè)拼接酶復(fù)合體RFS的一個(gè)組分。免疫共沉淀coimmunoprecipitation 非變性裂解完整細(xì)胞時(shí)，胞內(nèi)許多蛋白質(zhì)間的結(jié)合狀態(tài)可以保持下來(lái)。如果蛋白質(zhì)X用其抗體免疫沉淀，則在細(xì)胞內(nèi)與X穩(wěn)定結(jié)合的蛋白質(zhì)Y也能沉淀下來(lái)。 蛋白質(zhì)Y的沉淀是基于與X的物理性相互作用，被稱為免疫共沉淀。 該技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中常用融合表達(dá)的帶有蛋白標(biāo)簽的特異性抗體與目標(biāo)蛋白質(zhì)或蛋白復(fù)合物結(jié)合，形成蛋白復(fù)合物沉淀。將蛋白質(zhì)復(fù)合物溶解，再通過(guò)對(duì)蛋白標(biāo)簽具有特異吸附作用的親和色

26、譜柱將蛋白復(fù)合物分離純化出來(lái), 進(jìn)而通過(guò)凝膠電泳或質(zhì)譜等技術(shù)鑒定分離的蛋白。 該方法常用來(lái)確定生理?xiàng)l件下目的蛋白在細(xì)胞或組織內(nèi)是否存在與其相互作用的蛋白質(zhì)。 免疫共沉淀法的優(yōu)點(diǎn)是，所研究的相互作用蛋白均是經(jīng)翻譯后修飾的天然蛋白，可以表征生理?xiàng)l件下蛋白質(zhì)間的相互作用。 但該方法需首先針對(duì)目標(biāo)蛋白，制備出一定量的多克隆或單克隆抗體，過(guò)程相對(duì)復(fù)雜。同時(shí)，目的蛋白質(zhì)只有達(dá)到一定濃度才能與抗體結(jié)合形成沉淀，因而該法只適用于研究具有高表達(dá)量的目標(biāo)蛋白，應(yīng)用范圍有較大局限。 Dugan等利用該技術(shù)確定了細(xì)胞周期中cMyc和E2F兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子間的相互作用。蛋白質(zhì)片段互補(bǔ)分析（protein fragment

27、complementation analysis，PCA） 泛素蛋白可以分為兩個(gè)片段，將編碼這兩個(gè)片段的基因分別與編碼“誘餌”蛋白和“獵物”蛋白的基因在胞質(zhì)內(nèi)進(jìn)行融合表達(dá)，如果“誘餌”蛋白和“獵物”蛋白發(fā)生相互作用，則泛素蛋白的兩個(gè)片段得到重組而形成完整的泛素蛋白。 在泛素蛋白的介導(dǎo)下，作為泛素蛋白介導(dǎo)酶底物的報(bào)告蛋白被酶解，通過(guò)檢測(cè)報(bào)告蛋白的含量變化監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)間的相互作用。 除泛素蛋白外，腺苷酸環(huán)化酶和氨基酸異構(gòu)酶也可作為片段蛋白。 蛋白質(zhì)片段互補(bǔ)技術(shù)也已成功應(yīng)用于膜蛋白相互作用的系統(tǒng)化研究。以上方法是通過(guò)間接監(jiān)測(cè)報(bào)告蛋白特性的改變來(lái)鑒定蛋白質(zhì)相互作用，容易產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果?，F(xiàn)在通過(guò)將熒光蛋白

28、等報(bào)告蛋白作為蛋白互補(bǔ)片段與“誘餌”蛋白和 “獵物”蛋白融合表達(dá)，可通過(guò)直接監(jiān)測(cè)熒光蛋白特性的改變來(lái)鑒定蛋白質(zhì)相互作用。該種方法更為直接，減少了泛素蛋白介導(dǎo)酶解過(guò)程中的假陽(yáng)性反應(yīng) 。 該技術(shù)常用于檢測(cè)環(huán)境因素或激素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)相互作用。 Westwick等用該技術(shù)從時(shí)間和空間兩方面研究了Ras蛋白（一類GTP結(jié)合蛋白）與其調(diào)節(jié)因子及效應(yīng)因子間的相互作用，為藥物治療Ras蛋白相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)疾病指明了方向。 相對(duì)于酵母雙雜交技術(shù)，蛋白質(zhì)片段互補(bǔ)分析技術(shù)準(zhǔn)確率較高，假陽(yáng)性率較低，且能檢測(cè)任何細(xì)胞類型的體內(nèi)和體外的蛋白質(zhì)相互作用。但該技術(shù)對(duì)融合蛋白的設(shè)計(jì)和表達(dá)要求較高。 化學(xué)交聯(lián)法chemical cr

29、oss linking 化學(xué)交聯(lián)是共價(jià)連接不同化學(xué)功能基團(tuán)的技術(shù)，是對(duì)蛋白質(zhì)化學(xué)修飾的簡(jiǎn)單延伸。蛋白質(zhì)的親核側(cè)鏈和多肽鏈末端的活性氨基酸可與化學(xué)交聯(lián)劑發(fā)生化學(xué)交聯(lián)反應(yīng)。相互作用的蛋白質(zhì)是彼此結(jié)合或靠近的，可選擇合適的化學(xué)交聯(lián)劑，通過(guò)化學(xué)交聯(lián)反應(yīng)得到蛋白交聯(lián)復(fù)合物，再利用蛋白質(zhì)電泳或放射自顯影等技術(shù)，即可鑒定出彼此間有相互作用的蛋白質(zhì)。 化學(xué)交聯(lián)法可以檢測(cè)到很微弱的相互作用以及難溶的蛋白質(zhì)（如膜蛋白）之間的相互作用，還可以使蛋白復(fù)合物鎖定在某一特定構(gòu)象，進(jìn)而獲取相對(duì)的和絕對(duì)的結(jié)構(gòu)信息。 化學(xué)交聯(lián)法適于研究能夠形成穩(wěn)定復(fù)合物的蛋白質(zhì)間的相互作用。但化學(xué)交聯(lián)法受交聯(lián)劑種類、濃度,反應(yīng)時(shí)間、溫度及pH

30、值等條件的影響較大，條件優(yōu)化過(guò)程繁雜，這在一定程度上限制了該技術(shù)的應(yīng)用。 Dey等已利用該方法成功研究了大腸桿菌L7/L12蛋白與其延長(zhǎng)因子的相互作用,并確定了個(gè)活性結(jié)構(gòu)域。蛋白質(zhì)芯片protein microarray 蛋白質(zhì)芯片技術(shù)，是DNA芯片技術(shù)的擴(kuò)展，即在固體支持物表面高密度地固定化排列探針蛋白點(diǎn)陣，以特異地捕獲樣品中的靶蛋白，然后通過(guò)檢測(cè)器對(duì)靶蛋白進(jìn)行定性或定量分析。 蛋白質(zhì)芯片技術(shù)主要用于進(jìn)行自動(dòng)化分析，支持高通量快速篩選。蛋白質(zhì)芯片能夠同時(shí)高效地分析上千種蛋白質(zhì)間的相互作用,也使得在全基因組水平研究蛋白質(zhì)的功能(如酶活性、抗體特異性配體、受體交互作用)成為可能。但該項(xiàng)技術(shù)的使用

31、受到了蛋白質(zhì)固定化技術(shù)以及載體材料選擇的限制，同時(shí)也需要復(fù)雜昂貴的儀器來(lái)對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理和檢測(cè)。 何為等通過(guò)固定規(guī)?；苽涞亩喾N抗體制作成抗體微陣列芯片，通過(guò)與熒光標(biāo)記的人球蛋白和人白蛋白的相互作用,實(shí)現(xiàn)了高通量地對(duì)不同抗體株抗球蛋白和抗白蛋白活性的快速篩選與比較?？贵w芯片 蛋白芯片技術(shù)的出現(xiàn)給蛋白組學(xué)研究帶來(lái)新思路。蛋白組學(xué)研究中一個(gè)主要的內(nèi)容就是要研究在不同生理狀態(tài)或病理狀態(tài)下蛋白水平的量變。 微型化，集成化，高通量化的抗體芯片就是一個(gè)非常好的研究工具，它也是蛋白芯片中發(fā)展最快的芯片，而且在技術(shù)上已經(jīng)日益成熟。 這些抗體芯片有的已經(jīng)在向臨床應(yīng)用上發(fā)展，比如腫瘤標(biāo)志物抗體芯片等，還有很多已經(jīng)

32、用在研究的各個(gè)領(lǐng)域里。 第一張商品化的抗體芯片是由美國(guó)BD Clontech公司推出的。 這是一張用于研究的抗體芯片，芯片上排列了378種已知蛋白的單抗（Ab Microarray 380， 目錄號(hào) K1847-1），這些單抗對(duì)應(yīng)的蛋白都是細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能上十分重要的蛋白，涉及信號(hào)傳導(dǎo)、腫瘤、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞凋亡和神經(jīng)生物學(xué)等廣泛的領(lǐng)域。通過(guò)這張芯片，我們?cè)谝淮螌?shí)驗(yàn)中就能夠比較幾百種蛋白的表達(dá)變化。 微量熱技術(shù)（microcalorimetry） 微量熱法分為： 等溫滴定量熱（isothermal titration calorimetry,ITC） 差示掃描量熱(different

33、ial scanning calorimetry,DSC) 其中等溫滴定量熱法可以用來(lái)研究蛋白質(zhì)的相互作用，實(shí)驗(yàn)中通過(guò)將可能有相互作用的蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行互相滴定。 每次滴定后，反應(yīng)熱放出或吸收，可以被ITC所檢測(cè)到，檢測(cè)到的熱效應(yīng)的熱力學(xué)分析提供了相互作用的相關(guān)能量過(guò)程的定量特征，可以直接測(cè)量常溫下發(fā)生相互作用過(guò)程中完整的相關(guān)的熱力學(xué)數(shù)據(jù)，如結(jié)合常數(shù)（Ka）、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)（n），結(jié)合焓（H）、恒壓熱容（Cp）和動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)（如酶促反應(yīng)的Km）,進(jìn)而分析蛋白質(zhì)間的相互作用。 等溫滴定量熱法常用于獲取蛋白質(zhì)間相互作用的完整的熱力學(xué)信息。 微量熱法能通過(guò)高靈敏度、高自動(dòng)化的微量量熱儀連續(xù)、準(zhǔn)確地監(jiān)測(cè)和記錄

34、一個(gè)變化過(guò)程的量熱曲線，原位和在線和無(wú)損傷地同時(shí)提供熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)信息。 Jacobson等用等溫滴定量熱法研究了人細(xì)胞RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄因子TFIID的最大亞單位TAFII250的組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶活性。等溫滴定量熱法靈敏度較高，能測(cè)量到的熱效應(yīng)最低可達(dá)125 nJ，最小可檢測(cè)熱功率2 nW，蛋白樣品最小用量0.4 g，響應(yīng)時(shí)間小于10 s，但該法對(duì)樣品純度要求較高。原子作用力顯微技術(shù)（atomic force microscopy, AFM） 原子作用力顯微技術(shù)是在掃瞄隧道顯微技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的。AFM通過(guò)力掃描方式，以單分子水平的高分辨率測(cè)量蛋白質(zhì)間的相互作用力。 如在配體受體間相互作

35、用力的研究中，配體被固定于AFM的彈性懸臂表面，受體被固定于適當(dāng)?shù)幕妆砻?，在懸臂接近和離開(kāi)基底的過(guò)程中，通過(guò)懸臂的偏折便可測(cè)得配體受體間的作用力。 該技術(shù)常用于直接檢測(cè)蛋白復(fù)合物解體期間的動(dòng)力強(qiáng)度及自由能變化。原子作用力顯微技術(shù)能直接有效地檢測(cè)在外力作用下，蛋白質(zhì)分子機(jī)械性質(zhì)的改變。由于該技術(shù)常受到非特異結(jié)合力的干擾，導(dǎo)致結(jié)果誤差較大。 Yuan等用該技術(shù)測(cè)得鏈霉抗生物素蛋白與生物素之間的結(jié)合力在115170 pN之間。熒光共振能量轉(zhuǎn)移( Fluorescence resonance energy transfer,FRET) 熒光共振能量轉(zhuǎn)移是近年來(lái)迅速發(fā)展的一種新技術(shù),其最大的特點(diǎn)就是可

36、以在活體細(xì)胞生理?xiàng)l件下對(duì)蛋白質(zhì)間的相互作用進(jìn)行實(shí)時(shí)的動(dòng)態(tài)研究,已成為現(xiàn)代蛋白質(zhì)組學(xué)研究的有力工具。 一對(duì)合適的熒光物質(zhì)構(gòu)成一個(gè)能量供受體對(duì)時(shí),能量在它們之間可以發(fā)生轉(zhuǎn)移。 1948 年Frster提出的這一熒光共振能量轉(zhuǎn)移理論奠定了FRET技術(shù)的理論基礎(chǔ)。 1992 年, Prasher等首次從維多利亞水母中分離并克隆了一種熒光物質(zhì)綠色熒光蛋白( green fluorescent p rotein, GFP) 。 隨后, Heim等通過(guò)點(diǎn)突變等方式,得到了多種熒光光譜不同的熒光蛋白,如藍(lán)色熒光蛋白( blue fluorescence p ro2tein ,BFP) ,黃色熒光蛋白( yel

37、low fluorescence p ro2tein , YFP) 和藍(lán)綠色熒光蛋白( cyan fluorescence p rotein, CFP ) 等, 提供了大量的能量供受體, 為FRET技術(shù)提供了現(xiàn)實(shí)基礎(chǔ)。 目前FRET技術(shù)中常用的熒光蛋白對(duì)是YFP和CFP,當(dāng)與熒光基團(tuán)融合的被研究蛋白發(fā)相互作用時(shí),熒光基團(tuán)在空間上靠近,發(fā)生能量轉(zhuǎn)移,通過(guò)檢測(cè)供受體分子發(fā)射程度比率的變化就可得知蛋白質(zhì)結(jié)合程度的強(qiáng)弱。 目前, FRET技術(shù)已在檢測(cè)酶活性變化、膜蛋白的研究、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期調(diào)控等研究中發(fā)揮了重要作用。 例如在細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的研究中,天冬氨酸特異的半胱氨酸蛋白酶在細(xì)胞凋亡的執(zhí)行期發(fā)

38、揮關(guān)鍵的作用。Reiko等利用FRET技術(shù)研究了Caspase8與其底物Bid蛋白質(zhì)間的相互作用,將Bid蛋白兩端分別與CFP和YEP融合,精心設(shè)計(jì)使其在沒(méi)有被酶裂解前剛好可以發(fā)生共振能量轉(zhuǎn)移,當(dāng)Bid蛋白被裂解后,能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)自然消失,從而很好的檢測(cè)了Caspase8酶的活性。表面等離子共振( Surface plasmon resonance, SPR) 表面等離子共振是數(shù)理科學(xué)與生物學(xué)相互滲透、結(jié)合而產(chǎn)生的一種全新的研究生物大分子之間相互作用的方法,近幾年在生物技術(shù)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。 表面等離子共振( Surface plasmon reso2nance, SPR)是一種物理光學(xué)現(xiàn)象

39、,當(dāng)一束平面單色偏振光以一定角度入射到鍍?cè)诓ＡП砻娴谋咏饘倌ど习l(fā)生全反射時(shí),若入射光的波向量與金屬膜內(nèi)表面電子的振蕩頻率相一致,光線即被耦合入金屬膜引發(fā)電子共振,即表面等離子共振。由于共振的產(chǎn)生,導(dǎo)致反射光的強(qiáng)度在某一特定的角度大大減弱,反射光消失的角度稱為共振角( SPR angle) ,共振角隨金屬表面折射率的變化而變化,而折射率的變化又與金屬表面結(jié)合物的分子質(zhì)量成正比。 在20世紀(jì)90年代發(fā)展了應(yīng)用SPR原理檢測(cè)生物傳感芯片( biosensor chip ) 上的配位體與分析物作用的一種新技術(shù)表面等離子共振。 在該技術(shù)中,待測(cè)生物分子被固化在生物傳感芯片上,使另一種被測(cè)分子的溶液流過(guò)

40、表面,如二者發(fā)生相互作用,就會(huì)引起芯片表面折射率的變化,從而導(dǎo)致共振角的改變,通過(guò)檢測(cè)該共振角的變化,就可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)分子間的相互作用。 1992 年, Fagerstam 等首次將此技術(shù)用于生物特異相互作用分析( biospecific interaction analysis , BIA) 之后,由于該技術(shù)快速、安全、無(wú)需標(biāo)記以及高靈敏度等特點(diǎn),已被廣泛用于分析生物分子如蛋白質(zhì)間、蛋白質(zhì)與核酸、核酸之間的相互作用,涉及免疫識(shí)別、信號(hào)傳導(dǎo)、藥物篩選和蛋白質(zhì)構(gòu)象變化等多個(gè)研究領(lǐng)域。基于計(jì)算分析和構(gòu)建相互作用模型的方法 全基因組計(jì)算分析法（analysis of genome wide protei

41、n interactions by computational approaches） 基因組中的基因和蛋白質(zhì)組中的蛋白具有遺傳和翻譯的上下對(duì)應(yīng)關(guān)系。因此，可以從完整的基因組序列獲取更多的蛋白質(zhì)遺傳翻譯信息，包括基因本身及位置的保守性、基因組內(nèi)的基因融合分析、代謝重建及基因共調(diào)控等。 基于以上信息，運(yùn)用大規(guī)模高效的數(shù)值計(jì)算和理論模型來(lái)識(shí)別基因組序列中代表蛋白質(zhì)的編碼區(qū)，破譯隱藏在核酸序列中的遺傳語(yǔ)言規(guī)律，可以獲知蛋白質(zhì)復(fù)合物的形成以及蛋白質(zhì)在代謝和信號(hào)通路中的直接或間接作用。 該法的特點(diǎn)是：充分整合了基因組和蛋白質(zhì)組的研究信息，能夠有效預(yù)測(cè)相關(guān)的蛋白質(zhì)相互作用，指導(dǎo)蛋白質(zhì)相互作用的實(shí)驗(yàn)研究。

42、但該方法必需和具體的實(shí)驗(yàn)技術(shù)結(jié)合，才能確認(rèn)不同蛋白質(zhì)間的相互作用。如Uetz等利用全基因組計(jì)算分析法，耦合酵母雙雜交技術(shù)準(zhǔn)確鑒定出了啤酒酵母細(xì)胞中的957種蛋白質(zhì)相互作用。構(gòu)建相互作用模型法（integrate networks and models） 人們?cè)谘芯康鞍踪|(zhì)相互作用的同時(shí)，也建立了多種蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)庫(kù)，基于合理的運(yùn)算程序，有效地整合分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，建立蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)模型。 該方法可以對(duì)參與和調(diào)節(jié)某個(gè)生理過(guò)程的各種蛋白質(zhì)間的相互作用進(jìn)行有效系統(tǒng)研究，進(jìn)而研究代謝、信號(hào)傳導(dǎo)、遺傳調(diào)控等調(diào)節(jié)生命活動(dòng)的重要功能途徑。 如Ideker等基于GraphWin程序，將Schwikowski

43、等給出的酵母細(xì)胞中2709對(duì)蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)進(jìn)行分析整合，繪制出相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，進(jìn)而從中發(fā)現(xiàn)Gal4p、Gal11p和Gal80p三種蛋白質(zhì)間的相互作用調(diào)控著酵母中半乳糖代謝途徑中的多個(gè)重要進(jìn)程。 相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)生物分子相互作用網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)（BIND） 蛋白相互作用數(shù)據(jù)庫(kù)（DIP）蛋白相互作用數(shù)據(jù)庫(kù)的JSP鏈接http:/point.bioinformatics.tw/intro/intro.jsp DNA與蛋白質(zhì)相互作用研究方法研究技術(shù)新進(jìn)展 隨著分子生物學(xué)和生物技術(shù)的迅猛發(fā)展,傳統(tǒng)的生物化 學(xué)和物理化學(xué)研究方法已不能滿足現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)要求,分子生物化學(xué)家們力求建立和發(fā)展更為有效、靈敏、快速和精確的

44、鑒定 DNA - 蛋白質(zhì)相互作用的方法。 核酸適體技術(shù)、熒光技術(shù)、掃描探針顯微鏡技術(shù)、等離子共振技術(shù)、質(zhì)譜技術(shù)和分子模擬等先進(jìn)手段應(yīng)運(yùn)而生,并促進(jìn)該研究領(lǐng)域沿微觀方面發(fā)展。 目前對(duì)以蛋白質(zhì)為主的生物大分子的研究已經(jīng)進(jìn)入了一個(gè)新的層次。其重要特點(diǎn)不再是滿足于對(duì)單一生物大分子的研究，而是綜合各種分析方法來(lái)研究一個(gè)完整的生物學(xué)途徑或一個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞器中蛋白質(zhì)、核酸、多糖等分子之間識(shí)別和相互作用的機(jī)制。其中DNA與蛋白質(zhì)間相互作用參與許多生物學(xué)過(guò)程。92酵母單雜交技術(shù)的基本原理酵母單雜交技術(shù)yeast one hybrid system該技術(shù)是由Li J J 和Herskowitz 從酵母雙雜交技術(shù)發(fā)展

45、 來(lái)的。通過(guò)對(duì)酵母細(xì)胞內(nèi)報(bào)告基因表達(dá)狀況的分析,來(lái)鑒定DNA 順式作用元件和轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合情況;通過(guò)篩選DNA 文庫(kù),來(lái)獲得與靶序列特異結(jié)合的蛋白質(zhì)基因序列。其原理是:根據(jù)大多數(shù)轉(zhuǎn)錄因子含有DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA - binding domain ,BD) 和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(activation domain ,AD) ,且兩結(jié)構(gòu)域可完全獨(dú)立地發(fā)揮作用的特點(diǎn),來(lái)設(shè)計(jì)攜帶有編碼“靶蛋白”的文庫(kù)質(zhì)粒,從而使文庫(kù)蛋白編碼基因置換酵母原有轉(zhuǎn)錄因子GAL4 的DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域,并通過(guò)表達(dá)的“靶蛋白”與目的基因相互作用來(lái)激活RNA 聚合酶,啟動(dòng)下游報(bào)告基因的錄。該系統(tǒng)需包含: 將文庫(kù)蛋白的編碼基因與

46、 GAL4 轉(zhuǎn)錄激活域融合表達(dá)的cDNA 文庫(kù)質(zhì)粒; (2) 含目的基因與下游報(bào)告基因的報(bào)告質(zhì)粒。 其中,文庫(kù)的設(shè)計(jì)和篩選實(shí)驗(yàn)是整個(gè)酵母單雜交系統(tǒng)的核心技術(shù)。 酵母單雜交系統(tǒng)已被用于克隆多種重要的DNA 結(jié)合蛋白,該系統(tǒng)相對(duì)直接、快捷、靈敏,篩選到的蛋白是在體內(nèi)相對(duì)天然條件下有結(jié)合功能的蛋白質(zhì),比其他體外技術(shù)獲得的結(jié)果更能體現(xiàn)真核內(nèi)基因表達(dá)調(diào)控的真實(shí)情況,且無(wú)需復(fù)雜的蛋白質(zhì)分離純化操作。但因細(xì)胞技術(shù)的先天局限性和所用報(bào)告基因His3 或lacZ的自泄漏表達(dá)等缺陷,在實(shí)際操作中常出現(xiàn)漏檢和假陽(yáng)性現(xiàn)象。 DNA-蛋白質(zhì)印跡雜交 主要用于調(diào)控蛋白與調(diào)控元件相互作用的研究，是根據(jù)位點(diǎn)特異性結(jié)合蛋白借助

47、于氫鍵、離子鍵和疏水鍵與同位素標(biāo)記的特異序列探針結(jié)合，通過(guò)放射自顯影體系對(duì) 結(jié)合蛋白進(jìn)行定性、定量及對(duì)基因組結(jié)合序列進(jìn)行定位分析的一種方法。DNase足跡法DNase footprinting 常用于體外DNA - 蛋白質(zhì)相互作用的鑒定。該方法于1978 年引入科研領(lǐng)域,其原理與DNA 的化學(xué)測(cè)序法相似,即用DNase 部分消化已進(jìn)行單鏈末端標(biāo)記的待測(cè)雙鏈DNA ,形成在變性聚丙烯酰胺凝膠上以相差一個(gè)核苷酸為梯度的DNA 條帶。 當(dāng)DNA片段與其特異性結(jié)合的蛋白結(jié)合后,DNA 結(jié)合蛋白就阻礙DNase 在結(jié)合位點(diǎn)及其周圍部位的結(jié)合,形成切割梯中的空白區(qū)域,結(jié)合DNA 化學(xué)測(cè)序法,就可知該結(jié)合區(qū)

48、的堿基序列。 該技術(shù)在實(shí)際操作中涉及了有機(jī)抽提、離心等蛋白純化步驟, 較為繁雜,因此在該足跡法的基礎(chǔ)上又發(fā)展了固相DNase 足跡法 ,它具有如下優(yōu)點(diǎn)采用生物素進(jìn)行末端標(biāo)記,避免放射性同位素的摻入,減少危害; (2) 省略了有機(jī)抽提、沉淀等蛋白純化步驟,操作簡(jiǎn)便,效率高;(3) 使用范圍廣,可適用于未經(jīng)純化的核蛋白粗提物內(nèi)特異性DNA 結(jié)合蛋白的研究。 凝膠阻滯電泳 該方法是一種簡(jiǎn)單、快速檢測(cè)DNA結(jié)合蛋白的方法。 在非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳中DNA和蛋白質(zhì)的復(fù)合物的遷移速度比單一的DNA片段或雙鏈的寡核苷酸要慢。免疫沉淀法(chromatin immunoprecipitation ana

49、lysis , ChIP) 其原理是在活細(xì)胞狀態(tài)下利用甲醛或其他交聯(lián)劑固定蛋白質(zhì)- DNA 復(fù)合物,經(jīng)超聲破碎、特異性抗體沉淀復(fù)合體,后解除偶聯(lián)、純化目的片段并檢測(cè)等步驟來(lái)獲得蛋白質(zhì)與DNA相互作用的信息。 ChIP能捕捉到發(fā)生在染色質(zhì)水平上的基因表達(dá)調(diào)控的瞬時(shí)事件,如實(shí)、完整地反映DNA 與蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)結(jié)合 ,但該方法尚存些不足,如:難以同時(shí)得到多個(gè)因子對(duì)同一序列結(jié)合的信息,或目標(biāo)蛋白不是直接地與染色質(zhì)結(jié)合 等。 近年來(lái),研究者不斷地發(fā)展和完善此技術(shù),建立了廣泛用于特定反式因子靶基因的高通量篩選的CHIP - chip (芯片)方法和研究RNA 在基因表達(dá)調(diào)控中的作用的RNA - CHIP方

50、法等。 該技術(shù)在國(guó)外已得到廣泛應(yīng)用,但在國(guó)內(nèi)尚未成熟應(yīng)用。 SELEX技術(shù) 適配分子技術(shù)是一種最近發(fā)展起來(lái)的體外篩選和放大技術(shù)，通過(guò)該技術(shù)可得到一段能與各種目標(biāo)分子高親和、高特異結(jié)合的核酸序列，該核酸序列稱之為適配分子(aptamer)。 Aptamer一詞來(lái)源于拉丁文Aptus，意即適合的意思(fit)，而這種體外的篩選技術(shù)稱之為指數(shù)級(jí)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)即SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)。 簡(jiǎn)言之，Aptamer就是一段核酸序列，它能與相應(yīng)的配體高特異性和高親合力地結(jié)合。從原始文庫(kù)中篩選配體相應(yīng)

51、的Aptamer的技術(shù)稱為SELEX技術(shù)。 Aptamer具有廣泛的實(shí)用性，它能用于任何以分子識(shí)別為基礎(chǔ)的診斷和治療。原理 從大量的隨機(jī)序列的寡核苷酸庫(kù)中鑒定出一種數(shù)量很少的具有獨(dú)特性質(zhì)的核酸序列的方法是由Tuerk和Ellington等在1990年建立的，它是一種通過(guò)體外反復(fù)選擇和放大從核苷酸組合庫(kù)中篩選特定核苷酸序列的方法。 SELEX過(guò)程中，首先是用組合化學(xué)合成DNA的方法合成隨機(jī)序列的核酸庫(kù)，庫(kù)中的每一個(gè)成員是一個(gè)線形的寡聚物，庫(kù)中分子多樣性的程度取決于隨機(jī)寡核苷酸的長(zhǎng)度。 理論上講，一個(gè)40個(gè)堿基的隨機(jī)序列可有1.2 X 1024種核苷酸排列順序(440 =1.2 X 1024)。實(shí)

52、際上1mol的固相DNA合成的隨機(jī)組合核苷酸庫(kù)的序列多樣性僅限制于10141015種，能否找出與靶分子相互作用的稀有序列，很大程度上取決于組合庫(kù)的多樣性，在所有種類的組合隨機(jī)序列庫(kù)中寡核苷酸庫(kù)的多樣性最為豐富。 篩選過(guò)程中，首先在一定的溫度下將寡核苷酸隨機(jī)序列庫(kù)與靶分子共同孵育于特定的緩沖液中，組合庫(kù)中的極少數(shù)分子將與靶分子結(jié)合，然后用物理的方法將結(jié)合的分子與末結(jié)合的分子分離開(kāi)來(lái)。標(biāo)準(zhǔn)的方法是將蛋白靶分子固定于硝酸纖維素濾膜上，而其他小的靶分子則固定于固相載體的表面，因此，未與靶分子結(jié)合的序列很容易被沖洗掉，而與靶分子結(jié)合的序列將被分離出來(lái)并放大以獲得一個(gè)序列庫(kù)，再對(duì)這一序列庫(kù)進(jìn)行下一輪的篩選

53、和放大。SELEX技術(shù)原理 由于aptamer 具有精確識(shí)別、易體外合成與修飾等特性，SELEX 技術(shù)在分析化學(xué)、基因調(diào)控、蛋白質(zhì)組研究、疾病治療與新藥研發(fā)等方面得到廣泛的應(yīng)用。 更重要的是，aptamer 的靶分子范圍很廣，與靶分子間的親和力和特異性更高，從SELEX 技術(shù)建立至今，SELEX 技術(shù)和aptamer 的研究不斷受到新的挑戰(zhàn)與更新。SELEX與核酸適體技術(shù)其篩選過(guò)程包括: 體外合成單鏈寡核苷酸序列的隨機(jī)文庫(kù); 在適宜條件下,孵育單鏈寡核苷酸庫(kù)與靶蛋白形成DNA - 蛋白質(zhì)復(fù)合物; 分離未與靶蛋白結(jié)合的寡核苷酸; 解離與靶蛋白結(jié)合的寡核苷酸,以此為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,得到特異結(jié)

54、合的寡核苷酸庫(kù),再進(jìn)行下輪的篩選過(guò)程; 通過(guò)反復(fù)篩選與擴(kuò)增,得到親合力強(qiáng)于抗原抗體之間的高特異核酸適體。SELEX 技術(shù)至問(wèn)世來(lái)就以驚人的速度發(fā)展,因其庫(kù)容量大、特異性高、親和力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),在靶物質(zhì)的篩選上得到了廣泛應(yīng)用,也為DNA - 蛋白質(zhì)相互作用研究提供了一 種新穎的研究方法。用于DNA - 蛋白質(zhì)相互作用研究的指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment ,SELEX)是一種新型的體外篩選技術(shù),它以DNA 與蛋白質(zhì)相互作用為基礎(chǔ)建立隨機(jī)寡核苷酸文庫(kù),從中篩選到能與各種配體(靶蛋白) 特異性結(jié)合的單

55、鏈寡聚核苷酸片段, 長(zhǎng)度一般為20 40bp ,該寡核苷酸片段就稱為核酸適體(aptamer) 。 核酸適體技術(shù)已成為適配體篩選的有效工具,其所結(jié)的靶分子范圍非常廣泛,除蛋白質(zhì)之外,還可以是酶、核酸、細(xì)胞黏附分子、植物凝集素、病原菌、有機(jī)物甚至是金屬離子等,且篩選到的適配體能識(shí)別單抗不能區(qū)分的蛋白質(zhì)。 基于這些特性,核酸適體技術(shù)已在基礎(chǔ)研究、臨床診斷、藥物篩選、生物傳感器等領(lǐng)域應(yīng)用。 SELEX 技術(shù)是體外實(shí)驗(yàn),其篩選到的核酸適體所表現(xiàn)出的一些優(yōu)良性質(zhì),在體 內(nèi)實(shí)驗(yàn)中可能會(huì)完全失效;核酸適體與靶分子的非特異性結(jié)合及適配體的同源性、親和力等的影響,造成了SELEX的前期篩選工作的復(fù)雜性。這也是SELEX 技術(shù)亟待解決的兩個(gè)問(wèn)題。如果完成適配體的各種有效修飾及安全的藥物評(píng)價(jià)模型的構(gòu)建,SELEX技術(shù)存在的問(wèn)題也將逐步解決。 熒光技術(shù) 該技術(shù)已廣泛用于生物分子之間的相互作用研究。由于核酸及其鏈上的堿基的熒光產(chǎn)率很低,蛋白質(zhì)組成里也只有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸有天然熒光,所以采用“內(nèi)源熒光”的分析方法受到了很大的限制。 用于研究DNA - 蛋白質(zhì)相互作用的熒光法,主要是將熒光物質(zhì)修飾到蛋白質(zhì)或核酸分子上構(gòu)成新型熒光標(biāo)記物質(zhì)并結(jié)合相關(guān)儀器而改造成新型的檢測(cè)技術(shù)。它對(duì)待測(cè)物質(zhì)的濃度要求低,靈敏度高且部分熒光技術(shù)可實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)物質(zhì)的動(dòng)態(tài)