齊魯醫(yī)學實驗七聚丙烯酰胺凝膠柱狀電泳分離血清蛋白

1、實驗六 聚丙烯酰胺凝膠柱狀電泳分離血清蛋白質 指導教師劉建昌、池雪林2021/9/301一、目的1、掌握聚丙烯酰胺凝膠柱狀電泳的原理、操作方法。2、學會用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質。2021/9/302二、原理“不連續(xù)系統”最大的特點在于大大提高了樣品分離的分辨率，這種電泳的主要特點是：（1）使用兩種不同濃度的凝膠系統；（2）配制 兩種凝膠的緩沖溶液成分及PH值不同；（3）配膠緩沖液與電泳槽中電泳緩沖液的成分、PH值也不相同。在實驗中，電泳凝膠分為兩層：上層膠為低濃度的大孔膠，稱為濃縮膠，成膠的緩沖液是Tris-HCL，PH6.7；下層膠則是高濃度的小孔膠，稱為分離膠，成膠的緩沖液是Tris

2、-HCL,PH8.9。電極緩沖液則是Tris-甘氨酸，PH8.3。可見，凝膠濃度、成膠成分、PH值與電泳緩沖液系統各不相同，形成了一個不連續(xù)系統。2021/9/303在不連續(xù)系統中電泳時，甘氨酸、蛋白質、鹽酸中的氯離子和溴酚藍等均解離為陰離子，形成離子流向陽極泳動。當電極緩沖液（pH8.3）中的甘氨酸離子進入濃縮膠時，pH值降到接近于甘氨酸等電點（5.97），于是甘氨酸的解離度突然降低，所帶電荷明顯減少，遷移率減慢。樣品中蛋白質成分也進入濃縮膠，pH值的改變雖對其解離度有影響，但比對甘氨酸小得多，其遷移率比甘氨酸要大，而且濃縮膠的膠孔較大對蛋白質分子不會造成阻礙。濃縮膠中的Tris-HCl中C

3、l離子則全部解離，其遷移率最快。于是在濃縮膠中各種離子的遷移率形成：甘氨酸蛋白質溴酚藍Cl離子的順序。2021/9/304甘氨酸分子進入濃縮膠后解離度的下降，造成移動離子流的突然缺失，出現電流減少電導率下降，然而整個電泳系統中其他部分的電流仍維持不變，根據電導及電位梯度成反比，于是在前導離子Cl與慢離子甘氨酸離子之間突然形成了較高的局部電位梯度。處在這個局部高電位梯度區(qū)域中的血漿蛋白質各成分，在高電場作用下迅速以不同的速度泳向前導Cl離子區(qū)域。當到達前導Cl離子區(qū)域時因不缺少離子，大的電場強度減弱，離子移動速度急速減慢下來，結果在甘氨酸和Cl離子之間的蛋白質樣品就按其分子的大小濃縮成層。蛋白質

4、樣品濃縮了好幾百倍，且蛋白質各成分也按一定的順序排列成層。2021/9/305當離子流繼續(xù)向前，進入以pH8.9緩沖液配制的小孔膠時，蛋白質分子在小孔膠里遇到阻力，遷移率減慢，同時在pH8.9條件下，甘氨酸又充分解離，其帶電量增加，消除了離子流缺失的現象，小分子的甘氨酸離子趕上了蛋白質。凝膠各部分恢復具有恒定的電場強度，蛋白質的分離完全按一般區(qū)帶電泳方式進行。不連續(xù)電泳最主要的優(yōu)點就是使蛋白質樣品經濃縮膠后，形成緊密地壓縮層進入分離膠。蛋白質各成分預先分開且壓縮成層，可以減少在電泳時由于自由擴散而造成的區(qū)帶相互重疊，這樣就是提高了電泳的分辨能力。 2021/9/306三、試劑及器材（1）制備兩

5、種膠的貯存液：見操作。（2）電極緩沖溶液 取甘氨酸28.8g及Tris6g分別溶解后，加蒸餾水到1000ml，為pH8.5。用前稀釋10倍。（3）染色液：0.25g考馬氏亮藍R250,加入454ml甲醇水溶液和46ml冰醋酸。（4）脫色液：75ml冰醋酸、875ml蒸餾水與50ml甲醇混合。（5）凝膠電泳玻管：選內徑56mm、外徑78mm、長80100mm光滑均勻的玻璃管。（6）510ml注射器（7）10cm長注射器針頭（7號）（8）100l微量取樣器。（9）圓盤電泳槽（10）0.05%溴酚藍 2021/9/307四、操作 1、凝膠柱的制備 將洗凈烘干的玻璃管一端插入疫苗瓶的橡皮帽中，或用其他

6、材料將玻璃管一端封閉。將封閉的一端朝底垂直放于桌面支架上。按表6-1先配制分離膠，在50ml干燥小燒杯中按比例加入1、2號溶液及蒸餾水，放入干燥器中，用水泵或抽氣機抽氣至溶液中無氣泡冒出為止。取出，加入新配制的過硫酸銨，用玻璃棒混勻，及時用皮頭滴管吸取膠液灌入玻璃管內約6.5cm高。然后立即順管壁加入510mm高的水層，以隔離空氣加速凝膠的過程。待30min既凝聚成膠，此時膠與水之間形成一條明顯的界線。倒出膠面上的水，也可用濾紙條吸干。 2021/9/308100ml溶液中的含量溶液混合比例1號1mol/L HClTrisTEMED用濃HCl調至pH8.948.0ml36.6g0.23ml分離

7、膠1號 1份2號 2份H2O 1份 （抽氣）3號 4份凝膠濃度7.5%，pH8.92號AcrBis30.0g0.8g3號過硫酸銨0.3g100ml溶液中的含量溶液混合比例4號1mol/L HClTrisTEMED用濃HCl調至pH6.7約48.0ml5.98g0.46ml分離膠4號 1份5號 2份7號 4份 （抽氣）6號 1份凝膠濃度2.5%，pH6.75號AcrBis10.0g2.5g6號核黃素4.0mg7號蔗糖40.0g2021/9/309按表6-1配制濃縮膠，在抽氣后加入核黃素，混勻。先用部分膠液沖洗分離膠面，倒出，在立即灌入余下的濃縮膠約1cm高，再沿管壁加入緩緩加入蒸餾水約0.5cm

8、高度，放置約30分鐘左右。此時可見濃縮膠呈一層明顯的灰白色膠柱。除去水層，用電極緩沖液洗滌膠面，吸棄，再用電極緩沖液加滿至管頂，即可上樣電泳。2021/9/30102加樣 取新鮮血清（動物或人）5l，加40%蔗糖5l和溴酚藍5l，放置在干凈的白瓷板孔中，混勻。用微量取樣器吸取樣品，讓針頭穿過膠面上的緩沖液，緩慢推動取樣器，使樣品慢慢落在膠面上。推動取樣器時不宜過猛，以免樣品和緩沖液混合。2021/9/30113電泳 將已加好樣品的凝膠管，輕輕除去下端的皮塞或封閉物，將管插入圓盤電泳槽孔中，管要插得垂直。插好后加入少量電極緩沖液于槽中，檢查是否漏水。如不漏水即可加足電極緩沖液，至少要淹沒過凝膠管頂部。電泳槽下槽中也加入電極緩沖液，至少要淹沒電極。然后接通電源，負極在上，正極在下。電泳初期電壓控制在80V，待樣品進入分離膠后，加大電壓到160V，繼續(xù)電泳。當指示劑到達距管底1cm處時停止電泳，關閉電源。2021/9/30124、剝膠 倒出電極緩沖液，取出凝膠玻璃管。用帶長注射針頭（10cm）的注射器吸滿水，針頭插入玻璃管壁與凝膠之間，邊插入邊推水，并使針頭沿管壁轉動，直到針頭插到頭。這樣凝膠柱即可脫離玻璃管滑出。若仍不自動滑出，可用洗耳球輕輕把凝膠柱吹出。但不能用力過大，以免凝膠滑出過猛而斷裂。2021/9/30135染色 將取出的凝膠柱放入大