親和分離的技術

1、關于親和分離技術第1頁，共102頁，2022年，5月20日，18點23分，星期四第六章 親和分離技術6.1 親和萃取6.2 親和沉淀6.3 親和膜技術6.4 分子印跡分離技術6.5 親和反膠團萃取技術第2頁，共102頁，2022年，5月20日，18點23分，星期四6.1 親和萃取 親和萃取簡介 親和配基高聚物的合成 親和分配的影響因素和親和模型 親和分配的應用第3頁，共102頁，2022年，5月20日，18點23分，星期四6.1.1 親和萃取簡介 萃取是一種常見的生化分離技術，生化分離技術的萃取技術包括雙水相萃取、反膠團萃取等。親和萃取就是將親和層析的親和配基用于萃取分離中，包括親和雙水相和親

2、和反膠團等。第4頁，共102頁，2022年，5月20日，18點23分，星期四分離蛋白親和配基體系白蛋白脂肪酸PEG/dextran堿性磷酸化酶Procion red HE-3GPEG/dextran, PEG/ 鹽共脂肪酶（Colipase）卵磷脂LecithinPEG/dextran脫氫酶，激酶活性染料PEG/dextran, PEG/ 鹽-2-巨球細胞Cu2+PEG/dextranS-23 骨髓瘤蛋白二硝基酚PEG/dextran3-氧代類固醇異構酶雌甾二醇lPEG/ dextran胰蛋白酶對氨基苯咪PEG/dextran親和萃取簡介常用的親和配基、雙水相體系和它們所對應分離的物質(zhì)第5頁，

3、共102頁，2022年，5月20日，18點23分，星期四6.1.2 親和配基高聚物的合成 親和雙水相中親和配基可固定在上相高聚物或下相高聚物上，甚至親和配既可以以游離狀態(tài)分配在體系中。 一般配基固定在上相高聚物上，即將親和配基通過化學方法結合在PEG上。主要包括以下兩種: PEG 的活化 親和配基直接反應第6頁，共102頁，2022年，5月20日，18點23分，星期四6.1.3 親和分配的影響因素和親和模型影響親和分配的影響因素包括普通雙水相的影響因素如PEG濃度，還有: 配基濃度 配基載體 染料配基 pH: 增加，效率降低 溫度: 升高，效率降低 鹽濃度 第7頁，共102頁，2022年，5月

4、20日，18點23分，星期四鹽的種類添加鹽時的log K占不添加鹽時的百分數(shù)（）25mM63mM250mM磷酸鈉（添加）100103甲酸鈉，pH788醋酸鈉，pH71059781丙酸鈉，pH789Na2SO4988533KCl1048021Li2SO477Tris，pH776KI97691NaSCN67臨苯二甲酸鉀48NaClO442親和分配的影響因素和親和模型鹽對分配系數(shù)的影響第8頁，共102頁，2022年，5月20日，18點23分，星期四親和分配的影響因素和親和模型體系中的目標蛋白質(zhì)被配基分子飽和時第9頁，共102頁，2022年，5月20日，18點23分，星期四親和分配的影響因素和親和模型

5、整個過程的自由能變可以列成如下算式G5G1G2G3G1 第10頁，共102頁，2022年，5月20日，18點23分，星期四有N個結合位點的蛋白質(zhì)而言 親和分配的影響因素和親和模型 推導得目標蛋白質(zhì)的結合位點不被配基聚合物飽和時第11頁，共102頁，2022年，5月20日，18點23分，星期四6.1.4 親和分配的應用 乳酸脫氫酶（LHD）的親和分配 第12頁，共102頁，2022年，5月20日，18點23分，星期四6.1.4 親和分配的應用 葡萄糖-6-磷酸化脫氫酶（G6PDH）的純化第13頁，共102頁，2022年，5月20日，18點23分，星期四6.1.4 親和分配的應用 葡萄糖-6-磷酸

6、化脫氫酶（G6PDH）的純化第14頁，共102頁，2022年，5月20日，18點23分，星期四6.2 親和沉淀分離技術 親和沉淀的原理 親和沉淀聚合物和親和配基 親和沉淀可逆性聚合物 親和沉淀親和配基 親和沉淀的展望第15頁，共102頁，2022年，5月20日，18點23分，星期四6.2.1 親和沉淀的原理親和沉淀的機理： 加到含有目標分子得溶液中配體的連接 特異性結合 目標分子 形成親和沉淀目標分子解離親和沉淀原理圖親和沉淀(Affinity precipitation)是將生物專一性識別與沉淀分離相結合的純化技術。第16頁，共102頁，2022年，5月20日，18點23分，星期四親和沉淀的

7、優(yōu)點溶液中進行，無擴散傳質(zhì)阻力和結合時的空間位阻，親和結合速度快，結合充分； 親和配基裸露在溶液中，配基利用率高； 利用成熟的離心或過濾技術回收沉淀，易于規(guī)模放大 親和沉淀法可用于高粘度或含微粒的料液中目標產(chǎn)物 的純化，可在分離操作的初期進行，這對目標分子是 極其有利的：因為粗料液中通常含有對目標產(chǎn)物有害 的雜質(zhì)（如蛋白酶）。快速、有效地將目標產(chǎn)物分離 出來，有利于提高產(chǎn)品的質(zhì)量和收率第17頁，共102頁，2022年，5月20日，18點23分，星期四親和沉淀機理 一次作用親和沉淀 (primary-effect precipitation) 二次作用親和沉淀 (secondary-effect

8、 precipitation) 親和沉淀的機理分為兩種 第18頁，共102頁，2022年，5月20日，18點23分，星期四 一次作用親和沉淀水溶性化合物分子偶聯(lián)有兩個或兩個以上的親和配基，即雙配基(bis-ligand)和多配基(polyligand)通過與多價蛋白質(zhì)(multivalent protein)支聯(lián)，在適當?shù)臈l件下，形成較大的支聯(lián)網(wǎng)絡而沉淀。一次作用親和沉淀作用機理與抗原抗體的沉淀作用相似。存在著配基與蛋白質(zhì)的結合部位的最優(yōu)化使沉淀率最高。 第19頁，共102頁，2022年，5月20日，18點23分，星期四一次作用親和沉淀雖然簡單，但僅適用于多價、特別是4價以上的蛋白質(zhì)要求配基與

9、目標分子的親和結合常數(shù)較高沉淀條件難于掌握，并且沉淀的目標分子與配基的分離需要凝膠過濾等難于大規(guī)模應用的附加工具，實用上存在較大難度。另外，在一次作用親和沉淀這常用的多配基染料有配基自交聯(lián)(ligandself-assoliation)的現(xiàn)象，成為交聯(lián)網(wǎng)絡形成的競爭機制，從而阻礙了沉淀的生成。所以人們更多是采用二次作用親和沉淀。 一次作用親和沉淀第20頁，共102頁，2022年，5月20日，18點23分，星期四 二次作用親和沉淀 制備親和沉淀介質(zhì):利用在物理場如pH、離子強度、溫度等改變時溶解度下降、發(fā)生可逆性沉淀的水溶性聚合物為載體固定親和配基。親和介質(zhì)結合目標分子后，通過改變物理場使介質(zhì)與

10、目標分子共同沉淀的方法稱為二次作用親和沉淀。 離心或過濾回收沉淀，即可除去未沉淀的雜蛋白。沉淀清洗后加入洗脫劑即可純化目標產(chǎn)物。第21頁，共102頁，2022年，5月20日，18點23分，星期四二次親和沉淀分離蛋白質(zhì)示意圖第22頁，共102頁，2022年，5月20日，18點23分，星期四6.2.2 親和沉淀聚合物和親和配基 典型的親和沉淀有以下步驟： 親和沉淀介質(zhì)的制備 將親和沉淀介質(zhì)加入含有目標蛋白質(zhì)或酶的粗液中 聚合物親和配基目標蛋白的沉淀: 通過降低聚合物的 溶解度來實現(xiàn)聚合物發(fā)生可逆性沉淀的方法： pH、溫度、離子強度的改變 金屬離子的添加 水溶性有機溶劑的添加等選用何種方法取決于使用

11、的配基載體，有時幾種方法聯(lián)合使用第23頁，共102頁，2022年，5月20日，18點23分，星期四典型的親和沉淀有以下步驟（續(xù)）： 離心或過濾使沉淀分離，使目標蛋白就從雜蛋白中分 離出來 目標分子的解離：目前所采用的洗脫方式于親和層析所 使用的方法大致相同，如改變pH值或離子強度來降低目 標成為與配基的親和作用力。 配基的回收：如果目標蛋白的洗脫是在介質(zhì)與目標蛋白 復合物不溶的狀態(tài)下進行，配基可重新使用；否則，需 要采取凝膠過濾等方法分離第24頁，共102頁，2022年，5月20日，18點23分，星期四親和沉淀的有機聚合物，主要是可逆性沉淀聚合物即親和載體(affinity carrier)或

12、可逆性溶解聚合物可逆性溶解聚合物SIS（ Soluble and Insoluble Polymers）溶解和非溶解狀態(tài)可隨環(huán)境參數(shù)如pH、溫度等的變化發(fā)生可逆變化，因此可用于酶或蛋白質(zhì)的親和沉淀?？赡嫘匀芙饩酆衔锟梢灾苯雍偷鞍踪|(zhì)結合發(fā)生親和沉淀，但有時需要將親和配基結在可逆性溶解聚合物上。親和沉淀可逆性聚合物第25頁，共102頁，2022年，5月20日，18點23分，星期四二次親和沉淀選擇可逆性聚合物的原則： 包含活性基團，以便親和配基能夠結合； 不能和親和配基強烈結合，以免配基不能和目標分子作用； 在一定條件下可以發(fā)生明顯的可逆性的沉淀和溶解； 分子量分布窄； 可形成緊密的沉淀； 易回收，

13、有一定循環(huán)操作次數(shù)； 廉價易得親和沉淀可逆性聚合物第26頁，共102頁，2022年，5月20日，18點23分，星期四 (1) 天然的可逆性溶解聚合物 目前所使用的天然親和配基載體主要是脫乙酰殼聚糖(chitosan)和藻酸鹽(alginate): Chitosan在pH低于6時是可溶性的，升高pH值則會發(fā)生 沉淀 藻酸鹽是D甘露糖醛酸和L葡萄糖醛酸的線性多聚 物，在二價陽離子如Cu2+的存在下或pH低于2的條件下 形成沉淀 第27頁，共102頁，2022年，5月20日，18點23分，星期四Senstad和Mattiasson將大豆胰蛋白酶抑制劑(soy bean trypsin inhibit

14、or,STI)共價偶聯(lián)到親和配基載體Chitosan上，制成親和沉淀介質(zhì)結合胰蛋白酶(trypsin)用0.1M的NaOH調(diào)節(jié)溶液PH值至8.5，介質(zhì)與胰蛋白酶一起沉淀，離心用0.1M的glycine-鹽酸緩沖液清洗，胰蛋白酶與配基STI解離（此時PH約2.5），胰蛋白酶收率為86。研究表明，為了使沉淀更完全，應適當延長時間，因為親和作用進行很快，但沉淀步驟相對來說要緩慢得多。 (1) 天然的可逆性溶解聚合物(應用pH 敏感性) 第28頁，共102頁，2022年，5月20日，18點23分，星期四孫彥等人研制了含有共軛二炔結構單元的磷脂酰乙醇胺型聚合脂質(zhì)體(Polymerized Liposom

15、e, PLS)。磷脂酰乙醇胺的水懸浮液在超聲波處理下形成0.1-0.2mm的球形液泡狀磷脂雙分子膜，即脂質(zhì)體(liposome)，表面為親水性乙醇胺基團。該脂質(zhì)體溶液在紫外線照射下可發(fā)生聚合反應，形成聚合脂質(zhì)體，即PLS。向PLS溶液加入NaCl，當NaCl濃度超過0.17mol/L時，在滲透壓作用下PLS發(fā)生快速完全的沉淀。離心回收沉淀后向其中加入水或低濃度鹽溶液，沉淀重新溶解。(2) 合成可逆性溶解聚合物(應用離子強度敏感性) 第29頁，共102頁，2022年，5月20日，18點23分，星期四可逆沉淀性聚合物聚合脂質(zhì)體（polymerized liposome,PLS） 第30頁，共102

16、頁，2022年，5月20日，18點23分，星期四PLS具有在鹽的作用下發(fā)生可逆性沉淀的性質(zhì)。將大豆胰蛋白酶抑制劑（STI共價偶聯(lián)PLS的表面，制成親和沉淀介質(zhì)STIPLS。加入豬胰提取液中，用0.1M的NaCl沉淀，離心，并用0.01M的NaOH洗脫胰蛋白酶。結果表明，此法親和沉淀的胰蛋白酶收率在80以上，純化倍數(shù)達到8，比活達到13000U/mg，接近純酶的水平。PLS的優(yōu)點是，在很寬的PH值范圍內(nèi)和有機溶解中均表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性，經(jīng)配基修飾后具有很好的蛋白質(zhì)親和沉淀特性：蛋白質(zhì)吸附容量大，無非特異性吸附。 (2) 合成可逆性溶解聚合物(應用離子強度敏感性) 第31頁，共102頁，2022年

17、，5月20日，18點23分，星期四可逆沉淀性聚合物 聚丙烯酰胺第32頁，共102頁，2022年，5月20日，18點23分，星期四親和配基載體Eudragit S-100，它是甲基丙烯酸(methacrylic acid)和甲基丙烯酸甲酯(methyl methacrylate)的聚合物。Eudragit S-100在PH低于5時發(fā)生可逆性沉淀；在(NH4)2SO4或PEG8000存在的情況下，沉淀發(fā)生的PH值相對高一些。 Eudragit與親和配基染料Cibucron Blue的復合物Eudragit-Cibacron Blue在Ca2+存在的條件下，溫度達到40，在任何PH值范圍內(nèi)都會發(fā)生可

18、逆性沉淀。這就擴大了Eudragit的應用范圍，尤其是對那些在酸性條件容易變性的酶類。 (2) 合成可逆性溶解聚合物第33頁，共102頁，2022年，5月20日，18點23分，星期四 親和沉淀的親和配基 在很多情況下，親和沉淀時將親和配基固定在可逆性溶解聚合物上，親和沉淀的親和配基和親和層析的配基沒有太大差異，包括生物專一性配基如輔酶、蛋白質(zhì)A及非專一性親和配基如染料、金屬離子等。采用雙金屬離子螯和的雙功能試劑，將金屬離子固定在一些可以固定金屬離子的二聚物如poly-VI-VCL和poly-VI-PIPAM。這些聚合物上有多個咪唑基，可以結合金屬離子Cu2+。Cu2+-poly-VI-NIPA

19、M已成功地用來沉淀分離大豆蛋白酶抑制劑；Cu2+-poly-VI-VCL可用于分離純化乙酸脫氫酶。 第34頁，共102頁，2022年，5月20日，18點23分，星期四poly-VI-NIPAM poly VI-VCL 親和沉淀的親和配基 第35頁，共102頁，2022年，5月20日，18點23分，星期四6.2.3 親和沉淀的展望親和沉淀是一種簡單、高效的分離純化技術，已在多種蛋白的分離純化中應用。 pH敏感性親和沉淀 熱誘導親和沉淀 離子強度敏感性的親和沉淀 親和沉淀和其他技術的集成 制備規(guī)模的親和沉淀第36頁，共102頁，2022年，5月20日，18點23分，星期四 (1) pH敏感性親和沉

20、淀 pH敏感性聚合物本身帶有電荷，當它的凈電荷減少時，溶解度降低而發(fā)生沉淀，通過改變pH值改變其溶解狀態(tài)，以此類聚合物作為載體結合親和配基用于親和沉淀。pH敏感性聚合物包括： 天然可逆性聚合物：脫乙酰殼聚糖(chitosan)、藻酸鹽 (alginate)、纖維素衍生物（cellulose）； 合成可逆性聚合物：丙烯酰胺、N-丙烯酰-p-氨基苯酸、N- 丙烯酰-m-氨基苯酰胺的共聚物，甲基丙烯酸(methacrylic acid)和甲基丙烯酸甲酯(methyl methacrylate)的聚合 物，異丁烯酸-異丁烯酸甲酯共聚物等第37頁，共102頁，2022年，5月20日，18點23分，星期四

21、 對某些可逆溶解性聚合物，通過改變溫度可改變?nèi)芙舛?。在親和沉淀中使用的熱聚合物用于蛋白質(zhì)的分離純化時，能夠進行特異性沉淀，稱為熱誘導親和沉淀。其原理是利用雙官能團試劑，其中一部分功能基團與被分離的生物分子特異性結合，另一部分功能基團在介質(zhì)性質(zhì)尤其是溫度變化后能形成沉淀。(2) 熱誘導親和沉淀第38頁，共102頁，2022年，5月20日，18點23分，星期四對氨基苯甲瞇結合到異丙基酰胺的共聚物上就得到已蛋白酶的熱親和沉淀聚合物，將這種沉淀劑加入胰蛋白酶提取液中形成以蛋白酶-聚合物復合體。濾液中剩余的酶活僅為原酶活的7%。過濾得到沉淀復合物，加入緩沖液中加熱，使胰蛋白酶和聚合物脫離，得到分離純化的

22、酶。熱誘導親和沉淀可以和親和配基如金屬離子結合起來，如Cu-IDA-PVCL是一種人誘導聚合物，可用于乙酸脫氫酶的分離純化。(2) 熱誘導親和沉淀（應用）第39頁，共102頁，2022年，5月20日，18點23分，星期四(3) 離子強度敏感性的親和沉淀 此類聚合物在很寬的pH范圍內(nèi)對有機溶劑表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性，當添加或除去鹽是發(fā)生可逆性沉淀。 孫彥等人研制了含有共軛二炔結構單元的磷脂酰乙醇胺型聚合脂質(zhì)體(Polymerized Liposome,PLS)具有這種性質(zhì)，這在前面已經(jīng)敘述過。 第40頁，共102頁，2022年，5月20日，18點23分，星期四 (4) 親和沉淀和其他技術的集成 雙水

23、相萃取技術易于直接處理含細胞碎片的體系，可以和親和沉淀技術結合起來，提高分離效率。Kamihira等人將親和沉淀和雙水相技術結合分離純化蛋白質(zhì)A親和沉淀的可逆溶解聚合物Eudragit S-100，以免疫球蛋白IgG為配基Eudragit主要分配在上相，因此和蛋白A 結合的Eudragit分配在上相，分出上相后，調(diào)節(jié)pH使Eudragit沉淀，再將沉淀復合物解離便可得到蛋白A，同時上相的聚合物可以重復使用。具體過程如圖所示。 第41頁，共102頁，2022年，5月20日，18點23分，星期四第42頁，共102頁，2022年，5月20日，18點23分，星期四制備規(guī)模的親和沉淀(1) T1中加入料

24、液(2) 調(diào)節(jié)溫度至4(3) 加入AML和助濾劑(4) 調(diào)節(jié)溫度至30進行沉淀(5) 30下，在F1中進行混合物的過濾，在T2中收集濾液(6) 30下，用硫酸銨溶液洗滌濾餅，在T2中收集濾液(7) 30下，用洗脫液洗滌濾餅，在T3中收集含有目標分子的洗脫液(8) 洗滌并回收AML和過濾助劑，重復利用第43頁，共102頁，2022年，5月20日，18點23分，星期四6.3 親和膜分離技術 親和膜的原理及特點 親和膜的制備 膜材料和（基質(zhì)）配基的選擇 親和膜的制備 親和膜分離的理論模型 吸附模型 親和膜過程傳質(zhì)模型 親和膜分離技術的影響因素 親和膜分離技術的應用第44頁，共102頁，2022年，5

25、月20日，18點23分，星期四6.3.1 親和膜的原理和特點 親和膜分離是將親和分離技術和膜分離技術結合，它將親和配基結合在分離膜上，利用膜作為基質(zhì)，對膜進行改性，再按照吸附、清洗、洗脫和再生的過程，對生物產(chǎn)品進行分離純化。 第45頁，共102頁，2022年，5月20日，18點23分，星期四親和膜分離親和色譜原理利用膜固定親和配基利用層析介質(zhì)固定親和配基過程一般為低壓，可連續(xù)操作低、中、高都有，一般為間歇式操作設備板式、卷式、中空纖維式超濾或微濾膜填料一般在柱中進行速度快，擴散阻力小較慢，擴散阻力較大產(chǎn)物純度相對較低純度很高親和膜和普通的親和層析的比較 第46頁，共102頁，2022年，5月2

26、0日，18點23分，星期四具有相同傳質(zhì)效率的親和膜與親和色譜裝置參數(shù) 中空纖維親和膜裝填100m凝膠粒子的親和色譜裝置流體停留時間0.014min34.7min裝置體積0.773dm31070dm3平均流速1.4dm3/min1. 4dm3/min配基裝填量1.9g1950g第47頁，共102頁，2022年，5月20日，18點23分，星期四 膜多孔床上的配基和液流之間的擴散路徑極短，傳質(zhì)速率很高，可更有效的利用配基，所以大大加快了分離時間，提高了分離效率。 膜床的厚度一般較小，液流通過膜時的阻力也較小，因此壓降也較小，便于實現(xiàn)大規(guī)模的分離和連續(xù)、自動操作。 第48頁，共102頁，2022年，5

27、月20日，18點23分，星期四親和膜的操作模式死端過濾模式Dead-end mode錯流過濾模式Cross-flow mode 微孔親和過濾膜 親和超濾膜 第49頁，共102頁，2022年，5月20日，18點23分，星期四親和膜的形狀 板式 圓盤式 中空纖維式 前兩種較為簡單，成本低，容量小，中空纖維式便于實現(xiàn)連續(xù)、自動、規(guī)?；僮鞯?0頁，共102頁，2022年，5月20日，18點23分，星期四膜材料（基質(zhì)）和配基的選擇 親和膜對基質(zhì)材料的要求 (1) 惰性； (2) 具有親水性； (3) 物理、化學性質(zhì)穩(wěn)定，同時機械穩(wěn)定性也好； (4) 多孔性，內(nèi)外表面積大； (5) 具有足夠多的可利用的

28、化學基團； (6) 非特異性吸附低； (7) 適于成膜6.3.2 親和膜的制備第51頁，共102頁，2022年，5月20日，18點23分，星期四 親和膜的制備常用親和膜基質(zhì)材料 脂族烴類（聚乙烯，聚丙烯，聚丙烯氫） 芳香族共聚物（聚碳酸酯，聚砜，聚醚砜） 脂族聚酰胺（尼龍6，尼龍66） 一些特殊的聚合物，如聚乙烯醇，纖維素和纖維素的衍生物等 第52頁，共102頁，2022年，5月20日，18點23分，星期四膜材料制造商膜特性應用NalgeneMemtek Corp.圓形,2.5cm,4.7cm,孔徑0.2,0.5,交聯(lián)、結合酶及血清白蛋白的純化ActidickFMC Corp.圓形, 孔徑1,

29、交聯(lián)、包埋肽、蛋白質(zhì)及酶的固載化MemSep 1010Millipore圓形,床體積1.4ml,孔徑1.2，結合蛋白A 6mg單抗和多抗的分離MemSep 1010Millipore床體積4.9ml, 蛋白A 28mg單抗和多抗的分離NugelSeparation Corp.平板式10cm20cm, 包埋、涂層、結合抗原、抗體、重組蛋白及酶的純化聚合物、硅膠Biotechnology Inst. of Canada板式親和超濾，結合型胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的純化PolymerBiochemic板式15cmcm,結合孔徑0.22細胞生長劑，IgG、干擾素純化（氨基苯甲醚）Fiuka卷式（0.3c

30、m3cm），結合孔徑0.2RNA、DNA轉錄，中性蛋白純化Protrans大連化物所板式10cm10cm,結合孔徑0.20.5cm胰蛋白酶抑制劑的分離 第53頁，共102頁，2022年，5月20日，18點23分，星期四親和膜的制備親和配基 特異性配基：只與其對應的分子特異性結合，如抗原、 抗體、激素、激素受體等 常見的特異性配基： 肝素、伴刀豆蛋白A、單克隆抗體、胰蛋白酶等 通用型配基：與某一類物質(zhì)結合 常見的通用型配基： NAD+、NADP+等輔酶； Cibacron Blue F3G-A、Procion Red H-3B、Procion Blue MX-3G等活性染料 金屬離子（Cu2+、

31、Ni2+、Fe2+、Zn2+）親和膜的親和配基一般可分為兩類： 特異性配基和通用型配基第54頁，共102頁，2022年，5月20日，18點23分，星期四配基應用的膜生物特異性配基Protein A中空纖維膜，平板膜白細胞間介素2受體中空纖維膜肝素聚合物/共聚物膜sartobind單克隆抗體中空纖維胰蛋白酶改性聚砜膜通用性配基Cibraon Blue聚合物/共聚物膜sartobind，尼龍膜，殼聚糖膜IDA-Cu2+改性PE膜，聚合物/共聚物膜sartobind，改性聚砜膜苯丙氨酸改性PE膜組氨酸或糖多菌素尼龍66平板膜常見親和膜配基第55頁，共102頁，2022年，5月20日，18點23分，星

32、期四間隔臂 在分離生物大分子時，若將親和配基直接結合到基質(zhì)上，由于欲分離生物大分子的立體構型使它很難接近介質(zhì)上的配基產(chǎn)生親和相互作用，此即色譜分離中的“空間位阻”效應。這種情況在配基是小分子時表現(xiàn)尤為明顯，為了克服這種障礙，往往在介質(zhì)和配基之間插入一個具有一定幾何長度的有機基團，即間隔臂，以使欲分離的物質(zhì)方便的接近親和配基上的作用位點。第56頁，共102頁，2022年，5月20日，18點23分，星期四 對于一個理想的間隔臂，不僅要具有一定的長度（至少要含3個以上原子），而且要求其自身不帶任何電荷，疏水性也不能太強，不帶任何附加的活性中心，以避免對分離物產(chǎn)生非特異性相互作用。由于間隔臂既要與親和

33、介質(zhì)相連，又要與配基相接，因此要求其分子上含有雙官能團反應基。間隔臂長度一般以5-50nm較為適宜。常用的間隔臂是含2個活潑氨基的二胺類化合物，如乙二胺、丙二胺、己二胺、對苯二胺等。此外許多氨基酸和肽類化合物，由于其分子含有氨基、羧基、羥基、巰基等可反應的基團，也可用作間隔臂。間隔臂第57頁，共102頁，2022年，5月20日，18點23分，星期四親和膜的制備 很多膜材料不能直接應用于親和膜的分離，必須改性后才可以使用。改性的目的側重于增加膜的親水性、生物相容性，降低非特異性吸附，同時膜應具有良好的機械強度、孔結構、滲透性和均勻的孔分布。改性的膜再接上親和配基制備成親和膜。 親和膜的制備主要分

34、為三步:成膜、功能化、活化第58頁，共102頁，2022年，5月20日，18點23分，星期四按機械先后順序不同可分為以下兩種途徑： 膜材料功能化的膜材料功能化的膜活化的膜 膜材料包埋或結合親和配基功能化的膜 親和膜的制備 功能化，通過引用適當?shù)幕鶊F，使膜改性； 活化，引入基團使膜的活性增強、能與配基作用 具體采用哪一種途徑更好，因材料而異，一般認為活化在成膜后機械更好一些，成膜方法有溶膠凝膠轉化法，靜電紡絲法第59頁，共102頁，2022年，5月20日，18點23分，星期四纖維素親和膜的制備 由于纖維素膜分子上有許多羥基，因此可以用碳二胺法，氧化物法等羥基活化方法進行活化,然后結合上親和配基。

35、 商振華等用3-氯-1,2-環(huán)氧丙烷活化纖維素以對苯二胺作為間隔臂，然后偶合牛血清白蛋白活性染料作配基，制得一系列親和膜，并用于-干擾素、白蛋白、堿性磷酸酯酶等的分離純化，效果良好。 第60頁，共102頁，2022年，5月20日，18點23分，星期四纖維素膜的交聯(lián)和活性染料配基的固載化第61頁，共102頁，2022年，5月20日，18點23分，星期四 聚酰胺膜可以先用酸水解改性，然后結合上羥乙基纖維素以增強反應基團的活性，而且降低蛋白質(zhì)的非特異性吸附。在親和分離中，以尼龍膜居多。 水解后的尼龍66微孔膜用二溴丙烷活化，接上己二胺做間隔臂，再用戊二醛法固載上組氨酸，制得的親和膜可成功地去除氨基酸

36、注射液、牛血清蛋白、溶菌酶等醫(yī)藥制劑中的內(nèi)毒素，去除率在90%以上。 聚酰胺親和膜的制備第62頁，共102頁，2022年，5月20日，18點23分，星期四膜親和介質(zhì)MAC-His-NL66的制備過程第63頁，共102頁，2022年，5月20日，18點23分，星期四聚丙烯親和膜的制備 聚丙烯膜多用輻射誘導接枝甲基丙烯酸縮水甘油酯（GMA）的方法進行活化，接枝的GMA環(huán)氧基可用以鍵合配基，剩余環(huán)氧基要轉變?yōu)槎蓟虿捎闷渌噭┓忾]，降低非特異性吸附。同時GMA還起到了間隔臂的作用。 Kim等人在聚丙烯中空膜上輻射誘導接枝上GMA，用苯丙氨酸、色氨酸做配基，吸附-球蛋白。 第64頁，共102頁，2

37、022年，5月20日，18點23分，星期四聚砜親和膜的制備聚砜（PS）雖是一種良好的成膜材料，但其具有的憎水性使它不能直接用作親和分離介質(zhì)，必須進行化學改性，變成具有一定親水性的膜才能使用。聚砜膜的改性方法通常有以下幾種：1）在膜表面鍵合一層親水物質(zhì)如纖維素、殼聚糖。可以利用聚砜 膜的末端酚羥基與1,2-亞乙基二醇縮水甘油醚（EGDGE）反應產(chǎn) 生末端環(huán)氧基，然后鍵和羥乙基纖維素形成一層親水層，然后鍵 和配基。鍵和親水性基團后，膜的非特異性吸附很小，但孔徑縮 小，膜的滲透率下降2）引入親水性基團，商振華等采用?；?胺化和氯甲基化等途徑對 聚砜膜進行改性，在芳環(huán)上引入末端氨基。改性后膜孔隙率大，

38、 孔徑分布均勻，有良好的通透性3）采用金屬化試劑，如(butycithim)將聚砜膜改性成聚砜鋰，用環(huán) 氧化合物進行改性，可衍生出許多親和膜，如金屬親和膜第65頁，共102頁，2022年，5月20日，18點23分，星期四親和膜合成中活化試劑的選擇： 基質(zhì)與所鍵合物質(zhì)上可反應基團的種類、耐受pH 范圍及形成鍵的穩(wěn)定性，這直接決定了親和介質(zhì) 的使用壽命 所用試劑的毒性及價格，各種活化試劑各有利 弊，有的活化時間短，有的毒性低，有的形成的 鍵穩(wěn)定，因此須根據(jù)實驗室實際情況及實驗目的 進行選擇 親和膜的活化常用的活化方法： （a）環(huán)氧氯丙烷 （b）1,1-羰基雙咪唑（CDI） （c）過碘酸鈉 （d）三

39、氯三嗪 （e）戊二醛 （f）雙環(huán)氧試劑第66頁，共102頁，2022年，5月20日，18點23分，星期四吸附模型 一般情況下，配基與底物的結合可近似用langmuir吸附方程表示，由于親和膜分離過程的復雜性，這種處理是很粗略的： 式中：qm最大吸附量 Kd 吸附平衡常數(shù) C進料濃度 q膜吸附量 6.3.3 親和膜分離的理論模型第67頁，共102頁，2022年，5月20日，18點23分，星期四 對多克隆抗體，langmuir吸附方程式明顯不能解釋配基與目標產(chǎn)物之間的規(guī)律，因此有人提出三參數(shù)模型： 式中： 0a1，其余字母意義同上 參數(shù)a值越接近1，說明物系的親和力均勻性越好，這一模型的適用性為親

40、和吸附動力學及分離過程的研究提供了依據(jù)。親和膜分離的理論模型第68頁，共102頁，2022年，5月20日，18點23分，星期四 關于配基底物結合的一般關系式目前還沒有發(fā)現(xiàn)，langmuir模型目前只適用于少數(shù)物系，如親和力均勻的單克隆抗體相同三參數(shù)模型只能一定程度上擬合多克隆抗體物系，原因在于多克隆抗體物系結合親和力不均勻，其主要原因是由于抗體對某一特定抗原決定簇的異質(zhì)性所致。親和膜分離的理論模型第69頁，共102頁，2022年，5月20日，18點23分，星期四親和膜過程傳質(zhì)模型 由于親和膜分離過程非常復雜，目前對親和分離的處理部分仍是經(jīng)驗式的，真正基于物理化學生物特異性相互作用的理論和關系式

41、還沒有。最初提出的親和模型是基于配基蛋白間相互作用的吸附解離平衡過程。 最近Suen提出用對流、擴散和langmuir吸附理論對親和膜分離過程作了數(shù)學分析，推導出了蛋白質(zhì)和配基之間形成的絡合物濃度與蛋白濃度及配基濃度之間的關系式，并指出通過親和膜的流速不僅受壓降的限制，而且受固載化配基和蛋白質(zhì)之間解離動力學的限制，對于較厚的膜包，可使用較高的流速，并有較大的樣品流量。 第70頁，共102頁，2022年，5月20日，18點23分，星期四 此時流出峰的形狀也較尖銳，Suen假設樣品溶液是以層流方式沿軸向通過已固載化是配基的多孔膜層，蛋白質(zhì)在膜是的吸附是等溫吸附過程，料液濃度為Co，膜上配基濃度為C

42、l，蛋白與配基之間形成的絡合物濃度為Cz (z,t)，假設： (1)溶質(zhì)在徑向的濃度梯度忽略不計 (2)邊界層上質(zhì)量傳遞時間 (BLMT) dp/kc 遠小于軸向 對流時間L/V，BLMT系數(shù)kc由Athalye等的關系式確定： 式中：Dp膜孔徑 膜孔隙度 kc邊界層質(zhì)量傳遞系數(shù)親和膜過程傳質(zhì)模型 ReSc為Reyndds-Smidt數(shù) ReSc=Dp/D由上述方程：dp/kc(dp)2/4D 對親和膜：(dp)2/4DL/V第71頁，共102頁，2022年，5月20日，18點23分，星期四式中：ps表示蛋白配基所形成的絡合物，假設為單價吸附(3)蛋白與配基之間的結合式如下式所示 親和膜過程傳

43、質(zhì)模型 第72頁，共102頁，2022年，5月20日，18點23分，星期四(2)式表示是langmuir等溫吸附中的可逆速率表達式，Suen和Etgd對膜截面是的質(zhì)量平衡采用如下的連續(xù)方程表示：根據(jù)方程(2)，其二次速率表達式可寫為 親和膜過程傳質(zhì)模型 第73頁，共102頁，2022年，5月20日，18點23分，星期四 Suen根據(jù)邊界條件和初始條件分別推導了包括軸向擴散在內(nèi)的蛋白質(zhì)吸附等溫線方程和忽略軸向擴散的可逆吸附等溫線方程，并對分離結果作了解釋，指出對于親和分離過程較合適的kc值范圍為1.0*1052.6*105/(MS)之間，典型的kd值范圍在1.6*10-73.9*10-7M，這些

44、數(shù)據(jù)反映出在可溶性蛋白和固載化配基之間固有的解離速率，它們不受質(zhì)量傳遞的限制，膜越薄，軸向擴散的影響越顯著，允許使用的流速越低，用薄膜堆積成厚膜可降低軸向擴散的影響，有利于提高操作流速，增加樣品負荷，縮短分析時間。 親和膜過程傳質(zhì)模型 第74頁，共102頁，2022年，5月20日，18點23分，星期四 6.3.4 親和膜分離技術的影響因素親和分離過程受制約的因素很多，操作條件的選擇對分離結果有直接的影響： 1)吸附容量：主要取決于親和介質(zhì)上所結合的配位體濃度實際有效容量低于理論值 2)樣品蛋白濃度：對有親和力的系統(tǒng)，樣品濃度的影響不明顯，一般為了防止樣品流失，都在很低的流速下上樣 3)溫度的影

45、響：一般來說親和作用隨溫度升高而降低，因此都在低溫（4）下上樣，再適當升高溫度，在溫和條件下洗脫，以便獲得高的活力回收第75頁，共102頁，2022年，5月20日，18點23分，星期四 4)洗脫液的選擇：洗脫液的組成、pH值、離子強度等對分離結果和活力回收有大的影響，一般都選擇對樣品的構型與活力沒有影響的緩沖液系統(tǒng)，必要時可加入適量有機改性劑，如乙二醇、甘氨酸、甲酰胺等，盡量避免使用強酸、強堿和蛋白變性劑如：鹽酸胍、脲等。 5)進料緩沖液離子強度：實驗以氯化鈉鹽濃度調(diào)節(jié)離子強度，加入氯化鈉有利于免疫球蛋白的吸附，免疫球蛋白是生物活性大分子，其同A蛋白的結合依賴于溶液環(huán)境，離子強度是進料緩沖液物

46、理性質(zhì)的重要因素，改變離子強度則影響免疫球蛋白分子周圍對水化層及其電荷分布，從而影響免疫球蛋白和A蛋白配基的結合。 親和膜分離技術的影響因素第76頁，共102頁，2022年，5月20日，18點23分，星期四 6)進料緩沖液溶液pH值：進料緩沖液溶液pH值直接影響免疫球蛋白分子的電荷狀態(tài)，因此影響免疫球蛋白分子與A蛋白配基的結合。 7)進料速率：進料速率增加，免疫球蛋白回收率降低。但變化不大，免疫球蛋白與A蛋白分子間特異性結合的速度較快。 8)操作壓降：指膜入口與出口處兩點間壓強差，進料速率增大，膜操作壓降升高，但與 膜的最大耐壓相比變化幅度不大親和膜分離技術的影響因素第77頁，共102頁，20

47、22年，5月20日，18點23分，星期四基質(zhì)膜材料功能化試劑（方法）活化試劑配基分離物質(zhì)聚 砜表面覆蓋親水性纖維素層FMPA蛋白人血清中的免疫球蛋白聚 砜正叔丁基鋰縮水甘油基氧代己醚亞氨基乙酸Cu2+組氨酸溶液聚乙烯輻射接枝縮水甘油基異丁烯酸鹽L苯丙氨酸牛球蛋白BGG聚 砜氯甲基化氨化重氮鹽胰蛋白酶胰蛋白酶抑制劑尼龍膜親水性表面環(huán)氧氯丙烷Cibacron Blue F3-GA牛血清蛋白大 孔纖維素膜環(huán)氧氯丙烷Active Red K2BP堿性磷酸酯酶聚醚氨基甲酸脂1，6己二異氰酸酯 FMP或CDIA蛋白-免疫球蛋白 6.3.5 親和膜分離技術的應用第78頁，共102頁，2022年，5月20日，

48、18點23分，星期四1.血流，2.分離膜，3.聚氯乙烯膜，4.血液流出， 5.血液入口，6.排氣孔，7.殼體，8.密封，9.進樣蓋， 10.孔，11血液通道，12出樣蓋，13血液出口切流膜結構示意圖第79頁，共102頁，2022年，5月20日，18點23分，星期四 賈凌云等人制備了protein A切流膜色譜柱，并把該裝置用于免疫吸附治療，親和膜做成徑向形式，結構如圖。當流速為130 ml/min，人血漿通過TFAMC蛋白A的親和膜，它對IgG 的吸附容量可達400mg。 Millipore 公司已研制成功含A蛋白的纖維素膜分離器，可用作單克隆抗體等的純化。結果表明，在一個膜體積為0.5ml的

49、分離器上，將細胞培養(yǎng)上清液在低流速下負荷，15分鐘可獲得80mg提純的單克隆抗體。以此推算，用一個14ml的親和膜包，一天大約就可生產(chǎn)出8g純的單抗，比同樣體積的瓊脂糖親和色譜柱生產(chǎn)能力要高100倍以上。 Amerace公司研制了一種以聚乙烯（PVA）和硅膠為基質(zhì)的共混親和膜，在直徑為47mm的碟式膜上可結合20mg牛血清白蛋白（BSA）。把它制成25mm厚的膜分離器則可結合上670mg BSA。親和膜分離技術的應用第80頁，共102頁，2022年，5月20日，18點23分，星期四6.4 分子印跡分離技術 分子印跡的原理和方法分子印跡技術是將要分離的目標分子與交聯(lián)劑在聚合物單體溶液中進行共聚制

50、備得到顆粒介質(zhì)，然后洗脫出去包埋在介質(zhì)中的目標分子，便得到分子印跡聚合物（MIP）介質(zhì)，此時的介質(zhì)可以將目標分子的空間結構保持“印跡imprinting”或留下“記憶memory”。 分子印跡聚合物的制備過程 第81頁，共102頁，2022年，5月20日，18點23分，星期四早在19世紀40年代，諾貝爾獎獲得者Pauling提出：抗體在形成時其三維結構會盡可能的同抗原形成多重作用點，抗原作為一種模板就會“鑄造”在抗體的結合部位。1972年Wulff等人利用酶和抗體具有分子形狀、空間結構選擇性的特點，發(fā)展了用于色譜手性拆分的分子印跡聚合物（molecularly imprinting polym

51、er , MIP）,又稱模板聚合物或特制聚合物。1983年Mosbach進一步發(fā)展了這一技術，分子印跡技術通過模板分子（目標分子或印跡分子）的應用，使目標分子在聚合物中的特異識別位點或催化位點得以形成，但主要用于小分子物質(zhì)如多肽或輔酶（如NAD）的分離純化。1995年Maria Kempe又將該技術用于蛋白質(zhì)的分離純化。分子識別第82頁，共102頁，2022年，5月20日，18點23分，星期四 分子印跡技術的制備方法 共價印跡（covalent molecular imprinting）非共價印跡（non-covalent molecular imprinting）優(yōu)點空間位置固定準確，因而能

52、夠移走大量的模板分子，這一點對于金屬配基結合也一樣分子印跡系統(tǒng)多種多樣；印跡分子可以用很簡單的方法除去，且作用溫和缺點攜帶適當結合基團的化合物選擇性低；經(jīng)歷共價鍵的形成和斷裂，所需能量較高，并且，在水解過程中需要加入催化劑操作條件苛刻，因此可逆共價結合法的應用受到限制專一性不如共價結合作用強第83頁，共102頁，2022年，5月20日，18點23分，星期四常用單體和交聯(lián)劑 種類(Type)化合物(compound)共價型單體Covalent monomer 含乙烯基官能團的硼酸合二醇(Vinyl-functional boronic acid and diols)、鍵合有含硼酸官能團的硅烷混合

53、物的硅膠顆粒(silane mixtures including boronate silane on silica particale)、鍵合有氨基的硅烷凝膠顆粒(amino-functional silianes on silica particles)非共價型單體Non-covalent monomer 丙烯酸(acrylic acid)、甲基丙烯酸(methacrylic acid)、甲基丙烯酸甲酯(Methylmethacrylate)、對乙烯苯甲酸(-vinylbenzoic acid)、對乙基苯乙烯(ethylstyrene)、亞甲基丁二酸(ltaconic acid)、二丙烯酰

54、胺-2-甲基-1-丙磺酸 (2-acrylamido-2-methyl-1-propane-sulphonic acid)、1-乙烯基咪唑(1-vinylimidazole)、4-乙烯基吡啶(4-vinylpydine)、2-乙烯基吡啶(2-vinylpydine). 交聯(lián)劑crosslinker N,N-亞甲基二丙烯酰胺(N,N-methylenediacrylamide)、N,N-1,4-亞苯基二丙烯酰胺(N,N-phenylenediacrylamide)，3，5-二（丙烯酰胺）苯甲酸(3,5bis(acryolamide)benzoic acid)、二甲基丙烯酸乙二醇酯(ethylen

55、e glycol dimethacrylate)，二乙烯基苯(divinylbenzene)、N,O-二丙烯酰-L-苯丙氨醇(N,O-Bisacryoyl-L_phenylalaninol)、三丙烯酸季戊四醇酯(pentacrythritol triacrylate)，三甲氧基丙烷三甲基丙烯酸酯(Trimethylolpropane trimethacrylate)，季戊四醇四甲基丙烯酸酯(pentacrythritol tetraacrylate)第84頁，共102頁，2022年，5月20日，18點23分，星期四分子印跡技術的應用 用作特制的色譜分離介質(zhì) 手性分離介質(zhì)，親和分離技術 固相萃取

56、 用作抗體或受體摸擬物 人工抗體，免疫分析 用作生物傳感器的傳感元件 在合成和催化中的應用 產(chǎn)物分離和反應耦合，人工酶 臨床藥物分析 組合化學高通量篩選活性化合物第85頁，共102頁，2022年，5月20日，18點23分，星期四 分離純化中的應用被分離物 Analytes1 Ac-DL-Phe8 Boc-DL-Phe-OH15 3-(3,4-dihydroxylphenyl) alanine22 H-DL-Phe- NHEt2 Ac-DL-The-L- Trp-Ome9 Boc-DL-Pro-Osu16 DL-Ala,DL-Ile,DL- Leu,DL-Phe23 H-DL-Phe- NHPh

57、e3 Ac-DL-Trp10 Boc-Phe,Boc- Trp,Boc-Tyr17 DL-PheNHPh24 H-DL-Pro- NHPhe4 Ac-DL-Trp-Oet11 Boc-Tyr-Ome18 DL-Trp,DL-Tyr,DL- Val25 H-DL-Trp- Pet5 Ac-DL-Tyr12 Cbz-DL-Ala-Ala- Ome19 H-DL-Me2Phe- NHPhe26 ()-methylhydrocinnamic acid6 Boc-DL-Tyr-Ome13 Dansyl-DL-Phe- OH20 H-DL-NH2Phe-Oet27 ()-methyphenylethyla

58、mine7 Boc-DL-Phe-Gly- Oet14 D-glycosides of galactose21 H-DL-Phe-Gly- NHPhe28 N-Ac_DL-The-L-Trp-Ome第86頁，共102頁，2022年，5月20日，18點23分，星期四分子印跡酶催化脂肪酶催化對映體拆分 脂肪酶底物或產(chǎn)物類似物分子印跡初速度對映選擇性E天然酶715.5天然酶分子印跡93022先分子印跡再包衣110077第87頁，共102頁，2022年，5月20日，18點23分，星期四MIPs應用于臨床藥物分析 分析對象 Analytes分析對象 Analytes撲熱息痛Acetaminophen腎上腺素類藥物Adrenergic drug雄