液相色譜實(shí)驗(yàn)步驟和方法開(kāi)發(fā)解析

1、液相色譜的應(yīng)用以及方法開(kāi)發(fā)提綱：一.HPLC的廣泛應(yīng)用二.方法開(kāi)發(fā)過(guò)程 一）選擇HPLC檢測(cè)器 二）分配色譜及選擇流動(dòng)相 三）方法開(kāi)發(fā)的具體步驟 四）梯度洗脫方法一.HPLC的廣泛應(yīng)用 據(jù)2004年統(tǒng)計(jì)，世界上化合物總數(shù)多達(dá)4700多萬(wàn)種在全部有機(jī)化合物中僅有20左右的樣品適用于GC分析而HPLC可對(duì)80左右的有機(jī)化合物進(jìn)行分離和分析HPLC的廣泛應(yīng)用 HPLC特別適用于高沸點(diǎn)、大分子、強(qiáng)極性和熱穩(wěn)定性差的化合物以及生物活性物質(zhì)的分離和分析并且可以做制備 在醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)、生命科學(xué)、化工、環(huán)保等領(lǐng)域都有著廣泛的應(yīng)用潛力。HPLC的應(yīng)用領(lǐng)域在食品研究中的分析應(yīng)用食品中的天然成分碳水化合物類(lèi)脂化

2、合物、甘油三酸酯、膽固醇脂肪酸和有機(jī)酸蛋白、肽、氨基酸食品添加劑酸味劑、甜味劑、香精、乳化劑抗氧化劑、防腐劑顏料和染料（色素維生素污染物霉菌（黃曲霉毒素農(nóng)藥殘留和獸藥殘留多環(huán)芳烴（PAHS和亞硝酸HPLC的應(yīng)用領(lǐng)域 在醫(yī)藥研究中分析應(yīng)用 藥物分析有USP、BP、CP等標(biāo)準(zhǔn) 常用藥物研究中的應(yīng)用：解熱鎮(zhèn)痛藥、鎮(zhèn)靜藥、安定藥、心血管藥、磺胺類(lèi)消炎藥等。甾體藥物研究中的應(yīng)用：腎上腺皮質(zhì)激素、雄性激素、雌性激素和孕激素等?？咕仡?lèi)藥物研究中的應(yīng)用：青霉素、頭孢菌素、慶大毒素、四環(huán)素、氯霉素、諾氟沙星等。中草藥研究中的應(yīng)用：生物堿、甙類(lèi)(皂甙、強(qiáng)心甙、黃酮甙等)、萜類(lèi)手性藥物研究中的應(yīng)用：光學(xué)異構(gòu)體的拆

3、分(如解毒劑D-青霉胺毒性小，L-異構(gòu)體毒性很強(qiáng))醫(yī)療藥物的檢測(cè)、新藥研究、藥物代謝、藥代動(dòng)力學(xué)研究。 在獸藥研究中分析應(yīng)用HPLC 的應(yīng)用領(lǐng)域 在生物化學(xué)和生物工程中的應(yīng)用氨基酸、多肽合成和蛋白質(zhì)的分析研究核堿、核苷、核苷酸和核酸的分析研究生物胺的分析研究（兒茶酚胺類(lèi)) 在精細(xì)化工分析中的應(yīng)用醇、醛和酮、醚的分離分析酸和酯的分離分析表面活性劑的分析聚合物的分析研究藥物、農(nóng)藥、染料、炸藥等工業(yè)產(chǎn)品HPLC的應(yīng)用領(lǐng)域化妝品行業(yè)要控制和分析： 防腐劑、防曬劑、性激素以及維生素等；在公安、刑警破案工作需要 投毒藥物、毒品分析等在環(huán)境污染分析中的應(yīng)用廢氣、廢水、廢渣中多環(huán)芳烴、多氯聯(lián)苯、農(nóng)藥殘留、酚類(lèi)

4、和胺類(lèi)的檢測(cè) 在無(wú)機(jī)離子分析中應(yīng)用飲用水、酸雨、土壤中陰離子和陽(yáng)離子分析 二.方法開(kāi)發(fā)的過(guò)程Adapted from: Snyder, L.R.; Kirkland, J.J.; Glajch, J.L; Practical HPLC Method Development 2nd Ed., Wiley-Interscience, New York, 1997, p. 21. 得到樣品信息，確定分離目標(biāo)2. 確定特定HPLC過(guò)程、樣品預(yù)處理等的需求3. 選擇合適的檢測(cè)器4. 選擇HPLC方法；初步分離；建立最佳分離條件5. 優(yōu)化分離條件6. 檢查特定過(guò)程的問(wèn)題及需要7. 定量校正8. 日常使用的

5、確認(rèn)第一步干什么?想辦法得到各種信息向同行了解是否做過(guò)此類(lèi)樣品，或有否類(lèi)似樣品的分析方法查文獻(xiàn)和方法，如CA,AA,AOAC,EPA-儀器制造商的文獻(xiàn)，如Dionex,Waters對(duì)色譜柱有足夠的了解掌握分離機(jī)理，自己開(kāi)發(fā)方法充分了解您自己的樣品分析時(shí)要了解哪方面的情況？靈敏度的要求有多高? 樣品的本底是否很復(fù)雜? 有多少組份要分析? 對(duì)分析的精確度、準(zhǔn)確度等有多高要求? 是否因是日常檢驗(yàn)，而要求方法容易使用? 分離(制備)時(shí)要了解哪方面的情況？要分離（即制備）的樣品量有多大? 要分離的組份在樣品中的含量很高? 還是微量? 是否需要保持生物活性? 對(duì)分離產(chǎn)物純度的要求有多高? 純度或活性的鑒定

6、如何完成?使用文獻(xiàn)方法注意點(diǎn)色譜柱填料的種類(lèi)、品牌是否相同?注意文獻(xiàn)方法的流動(dòng)相是否損害色譜柱?如色譜填料品牌不同，需要調(diào)整流動(dòng)相注意色譜柱的規(guī)格：內(nèi)徑、柱長(zhǎng)需要調(diào)整流速、進(jìn)樣量注意梯度條件了解系統(tǒng)的滯后體積（梯度）一）選擇HPLC檢測(cè)器對(duì)樣品有響應(yīng)并有一個(gè)輸出信號(hào)應(yīng)該提供在檢測(cè)器響應(yīng)值與樣品濃度之間的線性關(guān)系；并且所設(shè)計(jì)的校正技術(shù)應(yīng)該促進(jìn)這種關(guān)系但是：由于受HPLC系統(tǒng)其他部件的影響會(huì)產(chǎn)生響應(yīng)與濃度之間關(guān)系的與線性偏離現(xiàn)象并不是所有的檢測(cè)器是線性的受HPLC系統(tǒng)其他部件的影響，檢測(cè)器的表現(xiàn)可能與其最佳水平有較大的差距用于HPLC的檢測(cè)器沒(méi)有任何一種單獨(dú)的檢測(cè)器可以適應(yīng)所有的液相色譜分離！HP

7、LC檢測(cè)器可以分為：溶質(zhì)性質(zhì)檢測(cè)器（選擇型）對(duì)溶質(zhì)的物理或化學(xué)性質(zhì)響應(yīng)，一般不反應(yīng)流動(dòng)相的變化（選擇型）整體性質(zhì)檢測(cè)器（通用型） 不管是否有溶質(zhì)，對(duì)流動(dòng)相任何物理性質(zhì)的變化作出響應(yīng)（通用型）理想的HPLC檢測(cè)器高靈敏度；可忽略的基線噪音寬的線性范圍獨(dú)立于流動(dòng)相及操作參數(shù)的響應(yīng)對(duì)壓力、溫度及流速等變化不敏感長(zhǎng)時(shí)間操作的穩(wěn)定性低死體積非破壞性選擇性靈敏度：信噪比靈敏度是信號(hào)與噪音的比值；即峰高與基線噪音的比值（S/N）檢測(cè)限（LOD）：S/N = 3定量限（LOQ）：S/N = 10好的信噪比有利于：更好的色譜峰確認(rèn)更好的定量更好地完成色譜峰純度/均一性6:1NS選擇液相色譜的檢測(cè)器要考慮的因素：

8、 你要分離的化合物/樣品的化學(xué)特性化學(xué)結(jié)構(gòu)、分子量及紫外光譜等等流動(dòng)相的影響（溶劑、緩沖鹽改性劑等）梯度還是等度靈敏度需求是否有雙檢測(cè)的需求選擇液相色譜的檢測(cè)器通用檢測(cè)器 RI ELSDMS靈敏度ugngpg線性范圍104否103流速敏感是否是溫度敏感是否否破壞性否是是選擇性檢測(cè)器 ABSFLEC Cond MS靈敏度ngpgfgpgpg線性范圍105103106105103流速敏感否否是是是溫度敏感否否是是是破壞性否否是否是吸光度（ UV/Vis）檢測(cè)原理原理：基于被分析組分對(duì)特定波長(zhǎng)紫外光的選擇性吸收定量基礎(chǔ)：比耳定律，AKCL優(yōu)點(diǎn)：1）對(duì)溫度和流速不敏感 2）可用于梯度洗脫 3） 靈敏度

9、較高，ng級(jí)檢測(cè)缺點(diǎn)：選擇性檢測(cè)器，僅適用于測(cè)定有紫外吸收的物質(zhì)吸光度（ UV/Vis）檢測(cè)的應(yīng)用大多數(shù)有機(jī)化合物有一定程度的吸光度，可以測(cè)定大多數(shù)的化合物，是目前實(shí)驗(yàn)室中使用最多的檢測(cè)器 -多數(shù)公司售出的檢測(cè)器中75%以上是吸光度檢測(cè)器（其中50%以上是紫外/可見(jiàn)檢測(cè)器，25%是PDA）背景吸收的影響背景吸收降低了線性范圍多數(shù)流動(dòng)相有紫外吸收實(shí)際濃度理想10吸光度210背景吸收光電二極管矩陣（Photo Diode Array） Photo Diode Array簡(jiǎn)稱(chēng)：PDA或DAD光電二極管矩陣檢測(cè)器（ PDA ）的特點(diǎn)和用途 一種三維水平的吸光度檢測(cè)器-采集三維譜圖 兼顧紫外檢測(cè)器及可見(jiàn)

10、分光光度計(jì)的信息在收集色譜圖的同時(shí)，得到光譜圖 提供許多有用的功能 -色譜峰的純度鑒定，色譜峰的確認(rèn) -可以發(fā)現(xiàn)單波長(zhǎng)檢測(cè)時(shí)未測(cè)到的峰 -任意波長(zhǎng)的色譜再處理 -光譜信息-光譜庫(kù)的建立檢索和擬合 熒光（Fluorescence）檢測(cè)原理 原理：發(fā)熒光的化合物吸收光（UV或VIS）使其分子達(dá)到激發(fā)態(tài)，當(dāng)其返回到基態(tài)時(shí)發(fā)射光的現(xiàn)象即熒光優(yōu)點(diǎn)：熒光檢測(cè)器靈敏度高, pg級(jí)檢測(cè)缺點(diǎn)：不是所有化合物都有熒光，必要時(shí)需要衍生 熒光檢測(cè)器原理熒光檢測(cè)器的應(yīng)用 環(huán)境中的污染物多環(huán)芳烴(PAH)，多酚，氨基甲酸酯等 食品、飲料食品中的毒素；例如：黃曲霉毒素染料維生素及衍生氨基酸 生物技術(shù)及制藥氨基甲酸酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑

11、黃曲霉毒素多環(huán)芳烴（PAH）維生素示差折光（Refractive Index）檢測(cè)示差折光檢測(cè)器（RI）是第一個(gè)商品化的液相色譜檢測(cè)器（上世紀(jì)六十年代末、七十年代初）通常被認(rèn)為是一種通用檢測(cè)器檢測(cè)溶液中所有被溶解的溶質(zhì) 非特異性任何光學(xué)介質(zhì)的折光率都被定義為光在該介質(zhì)中與真空中的速度之比值RS 示差折光（RI ）檢測(cè) 的原理原理：連續(xù)測(cè)定流通池中溶液折射率來(lái)測(cè)定試樣 各組分濃度。優(yōu)點(diǎn)：通用型檢測(cè)器缺點(diǎn)： 1）對(duì)溫度變化敏感 2）不能用于梯度檢測(cè) 3）靈敏度低，ug級(jí)檢測(cè)返回示差檢測(cè)器的應(yīng)用示差折光檢測(cè)器是通用型檢測(cè)器,如果選擇合適的溶劑，幾乎所有的物質(zhì)都可以檢測(cè)特別適用于檢測(cè)沒(méi)有紫外吸收的化合

12、物,例如糖類(lèi),醇類(lèi),酯類(lèi)以及脂肪酸等高分子化合物GPC,GFC分析以及復(fù)雜樣品純化蒸發(fā)光散射（ELSD）原理用氮?dú)獍蚜鲃?dòng)相吹成細(xì)霧狀流動(dòng)相的液滴通過(guò)一個(gè)預(yù)加熱的腔體后被蒸發(fā)掉蒸發(fā)的溶劑被從檢測(cè)器中除去溶質(zhì)的揮發(fā)性小于流動(dòng)相，因此產(chǎn)生顆粒束與光束相交被顆粒散射的光由光電倍增管（PMT）收集PMT的輸出與溶質(zhì)的存在量呈比例關(guān)系ELSD 優(yōu)點(diǎn)及應(yīng)用領(lǐng)域通用型 比流動(dòng)相揮發(fā)性小的物質(zhì)都能被檢測(cè)可以作梯度實(shí)驗(yàn)；檢測(cè)下限可到納克級(jí)水平對(duì)環(huán)境條件不敏感；可以使用有強(qiáng)紫外吸收的溶劑作流動(dòng)相應(yīng)用領(lǐng)域：碳水化合物油脂及脂肪酸未衍生的氨基酸制藥行業(yè)表面活性劑天然產(chǎn)物ELSD 缺點(diǎn)不能使用不揮發(fā)性的流動(dòng)相（例如：磷酸

13、鹽）要求使用霧化氣源（典型的是氮?dú)饣蚩諝猓┎煌纳V條件下霧化及除溶劑的參數(shù)需要重新優(yōu)化破壞性技術(shù)蒸發(fā)出的溶劑要引到戶(hù)外或通風(fēng)櫥里對(duì)揮發(fā)性化合物的檢測(cè)不理想一般得到的是非線性校正曲線某些化合物的檢測(cè)靈敏度不如其他檢測(cè)器二）色譜基本分類(lèi)色譜基本分類(lèi)： 按溶質(zhì)（樣品）在兩相分離過(guò)程的物理化學(xué)性質(zhì)可以分為： 1.分配色譜分配系數(shù) * 2.親和色譜親和力 3.吸附色譜-吸附力 4.離子交換色譜離子交換能力 5.凝膠色譜（體積排阻色譜）-分子大小引起的體積排阻分配色譜分配色譜分為： 正相色譜：固定相（填料）為極性，流動(dòng)相為非極性 反相色譜：固定相（填料）為非極性，流動(dòng)相為極性。 用得最多，約占60-70

14、%相對(duì)應(yīng)的色譜柱： 反相柱：烷基硅烷鍵合硅膠填料，如C18（ODS） C8,C4,C3，苯基等 正相柱：典型的為硅膠柱，其它官能團(tuán)為-CN氰基， -NH2氨基等分配色譜的分離機(jī)理分配色譜概述反相色譜的主要類(lèi)型，基于分子的極性分離洗脫次序：一般為反相，即極性高的先被洗脫流動(dòng)相極性流動(dòng)相洗脫強(qiáng)度反相色譜最常用的流動(dòng)相及其洗脫強(qiáng)度： 水 甲醇乙腈 乙醇丙醇異丙醇四氫呋喃 最常用的流動(dòng)相組成“甲醇-水；乙腈-水”正相色譜最常用的流動(dòng)相及其洗脫強(qiáng)度： 正己烷乙醚乙酸乙酯異丙醇 *應(yīng)用添加劑，成為離子對(duì)、離子抑制方法流動(dòng)相的選擇原則樣品易溶，且溶解度盡可能大化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，不損壞柱子不妨礙檢測(cè)器檢測(cè)，所選波

15、長(zhǎng)處無(wú)吸收 *黏度低，流動(dòng)性好 *無(wú)毒或低毒，易于操作易于從其中回收樣品易于制成高純度，即色譜純廢液易處理，不污染環(huán)境三）方法開(kāi)發(fā)的具體步驟先用一根短的色譜柱用相對(duì)較高的流速使用盡可能純度高的標(biāo)準(zhǔn)品先用高強(qiáng)度的洗脫液調(diào)節(jié)k 值改變保留值調(diào)節(jié)a值改變選擇性通過(guò)改變流動(dòng)相的pH值，使樣品成中性加入“對(duì)離子”，使樣品呈中性調(diào)節(jié)柱長(zhǎng)度改變柱效及分離速度反相色譜的方法開(kāi)發(fā)開(kāi)發(fā)過(guò)程實(shí)例色譜條件色譜柱：C18，4.6mm15mm流動(dòng)相：乙腈/水，乙腈從100%逐漸降低（或走梯度） 舉例中用不同的溶劑強(qiáng)度，60/40、50/50、40/60，由強(qiáng)漸弱流速：1ml/min樣品： 對(duì)羥基苯甲酸甲酯(Methyl

16、Paraben) 對(duì)羥基苯甲酸丙酯(Propyl Paraben) 對(duì)羥基苯甲酸丁酯(Butyl Paraben)1.改變?nèi)萘恳蜃?K譜圖同樣強(qiáng)度的不同溶劑，改變了流動(dòng)相值改變色譜柱2.調(diào)節(jié)值改變選擇性離子型化合物的色譜分離離子型化合物的分離方式多數(shù)化合物是離子型的！使用離子交換柱：離子交換法主要用于“強(qiáng)”陰、陽(yáng)離子使用反相柱離子抑制色譜法：通過(guò)改變流動(dòng)相的pH值，使樣品成中性離子對(duì)色譜法：加入“對(duì)離子”，使樣品呈中性3.離子抑制色譜離子型化合物在反相色譜柱上不保留改變流動(dòng)相的pH值，抑制樣品離子的電離使樣品成中性適用于弱酸性化合物的分離加入TFA,磷酸鹽等降低流動(dòng)相的pH值，使樣品降低離子化

17、使用硅膠基質(zhì)C18填料使用條件應(yīng)在填料基質(zhì)的范圍內(nèi)硅膠柱的pH在2-8（較保險(xiǎn)值3-7）內(nèi)離子抑制色譜實(shí)例而在乙腈/水并且pH=7時(shí)，多數(shù)組份保留時(shí)間很短，無(wú)法完全分離。離子抑制色譜的使用范圍下列情況下不能使用離子抑制方法，如果：一些酸在pH低于2時(shí)還保持離子化一些堿在pH高于7時(shí)還保持離子化可以有以下的選擇離子交換色譜使用聚合物或其他耐堿性流動(dòng)相的反相柱，在pH高于7時(shí)用離子抑制法使用“離子對(duì)色譜法”4.離子對(duì)色譜法在反相色譜流動(dòng)相內(nèi)加入“離子對(duì)”試劑與樣品中可電離的組份形成“對(duì)離子”在反相色譜柱上分離離子型化合物離子對(duì)試劑的類(lèi)型季銨鹽、叔胺鹽 （正離子），適用于弱酸烷基磺酸鹽、高氯酸鹽（負(fù)

18、離子），適用于弱堿烷基長(zhǎng)度不同，形成對(duì)離子的能力不同離子對(duì)色譜機(jī)理 抗組胺及減充血?jiǎng)┧幬锏姆治鲭x子對(duì)色譜的應(yīng)用離子對(duì)色譜分析水溶性維生素用離子對(duì)、還是用離子抑制方法？方法開(kāi)發(fā)的其他因素流速對(duì)柱效的影響不同內(nèi)徑的色譜柱有自己的最佳流速樣品的進(jìn)樣量(濃度)對(duì)柱效的影響樣品的進(jìn)樣體積對(duì)柱效的影響溶劑粘度對(duì)柱效的影響以上因素均影響分離度色譜方法轉(zhuǎn)換如果沒(méi)有與文獻(xiàn)或要求相近的色譜柱轉(zhuǎn)換進(jìn)樣量轉(zhuǎn)換流速 四）液相色譜方法開(kāi)發(fā) 梯度洗脫方法在這一部分您將學(xué)習(xí):關(guān)于梯度洗脫過(guò)程及其優(yōu)點(diǎn).如何優(yōu)化梯度分離.有關(guān)梯度分離的一些實(shí)用考慮.液相色譜泵穩(wěn)定平滑并且重現(xiàn)性好的流速可靠且充分的溶劑混合準(zhǔn)確及重現(xiàn)的自動(dòng)溶劑混合

19、準(zhǔn)確及重現(xiàn)的梯度形成有效的流速范圍制備色譜或微柱、窄柱色譜要考慮滯后體積梯度分析更為關(guān)注目的：在任何情況下保持最高精度梯度的洗脫方式高壓梯度及低壓梯度梯度滯后：系統(tǒng)體積的影響死體積/譜帶展寬體積(無(wú)色譜柱時(shí))滯后(系統(tǒng))體積滯后(系統(tǒng))體積溶劑輸送系統(tǒng)(泵)檢測(cè)器進(jìn)樣器色譜柱梯度混合器溶劑輸送系統(tǒng)(泵)高壓梯度注意滯后體積包括進(jìn)樣器、阻尼 器、混合器及其管路比例閥檢測(cè)器進(jìn)樣器ABCD色譜柱溶劑輸送系統(tǒng)(泵)低壓梯度阻尼器混合器梯度滯后大小的影響滯后體積太大會(huì)引起梯度變化的延遲例如：滯后體積為2.0ml，流速1.0ml/min實(shí)際梯度會(huì)比設(shè)置值晚 2 分鐘響應(yīng)，沒(méi)有問(wèn)題對(duì)微柱色譜影響更大，同上例

20、但流速0.1ml/min實(shí)際梯度會(huì)比設(shè)置值晚20 分鐘響應(yīng)，不能接受滯后體積的不同會(huì)使方法轉(zhuǎn)換麻煩滯后體積比文獻(xiàn)大或小都會(huì)使方法不能重現(xiàn)滯后體積的變化會(huì)導(dǎo)致梯度重現(xiàn)性不好普通分析型液相色譜的滯后體積為14ml（戴安的4元泵700l，高壓泵400l ）滯后體積變化的影響設(shè)計(jì)不好的HPLC系統(tǒng)，滯后體積隨反壓變化滯后體積隨反壓變化的后果：梯度的準(zhǔn)確性不好，造成：方法的適應(yīng)性不好用靜態(tài)梯度混合器；固定滯后體積可明顯改善梯度特性梯度百分比保留時(shí)間梯度曲線好的梯度滯后曲線保留時(shí)間梯度百分比不好的梯度滯后曲線固定滯后體積，改善了梯度性能普通的低壓梯度系統(tǒng)色譜柱反壓變化對(duì)梯度實(shí)驗(yàn)的影響P680A LPG w

21、ithout pulse damperBack-pressure:60 bar, 85 bar and 105 barVariation: 2%Acclaim 120, C18, 5 m, 4.6 x 100 mm; 0.5 mL/min; 25C; 5 L injection volume; UV detection at 256 nm; Eluent (A) Water and (B) Acetonitril; Gradient: 30 % b to 100 % B in 10 min; Methyl-, Ethyl-, Propyl- and Butylparabene, 10 mg/L

22、 each梯度洗脫的特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)縮短分析時(shí)間增加分離能力檢測(cè)靈敏度提高缺點(diǎn)儀器設(shè)備要求高不適合某些檢測(cè)方式(RI)柱需再生平衡定量分析的重復(fù)性較低？一般流出問(wèn)題早流出峰的分離度差.遲流出峰的峰寬增加而峰高降低.由于k范圍寬，所以分析時(shí)間長(zhǎng).強(qiáng)保留組分造成柱污染.等梯度洗脫 - 在洗脫樣品的整個(gè)過(guò)程中，流動(dòng)相的組成保持不變.Analytical Education CenterH5929A 11-09梯度洗脫 - 一個(gè)解決方案優(yōu)點(diǎn) 改善分離度 提高檢測(cè)性能 能夠分離復(fù)雜樣品 縮短分析時(shí)間 降低由于強(qiáng)保留組分而使色譜 柱性能變差的可能性其他應(yīng)用 柱清洗 方法開(kāi)發(fā)中的嘗試運(yùn)行 梯度洗脫 - 在分離過(guò)程中改變流動(dòng)相組成.梯度運(yùn)行中發(fā)生了什么?增加有機(jī)改性劑的含量分配轉(zhuǎn)移到流動(dòng)相增加化合物的流速梯度方法開(kāi)發(fā)- 優(yōu)化溶劑梯度5%有機(jī)相100%有機(jī)相從嘗試運(yùn)行開(kāi)始 - 一個(gè)平緩的梯度您必須確定: 有機(jī)溶劑 初始組成 梯度時(shí)間 梯度陡度 梯度形狀 流速 柱長(zhǎng) 柱重新平衡時(shí)間010203040min.100% B100% B0% B0% BtG = 40tG = 20選擇梯度陡度100% B100% B0% B0% BtG = 10tG = 5010陡平緩梯度形狀%Btime線性步進(jìn)凹形凸形Analytical Education Center線性梯度對(duì)下列每種情