CFX熒光定量PCR儀操作指南(Bio-rad)

1、 儀操作流程及注意事項開始運行儀器打開電腦打開定量 PCR 儀底座開關(guān)啟動CFX軟件放置樣本將PCR 性塑料手套，不要讓手指接觸到反映管表面。將反映管按順序放入儀器的加熱孔中。設(shè)置程序，運行實驗定量PCR 軟件操作基本步驟為設(shè)置熱循環(huán)程序文件(ProtocolTab) b.設(shè)置反映板文件(Tab)。C.點擊“鍵，運行程序熱循環(huán)程序文件( ProtocolTab)設(shè)置指南：點擊 (編輯)或創(chuàng)建新程序。反映板設(shè)置文件(Tab)設(shè)置指南：選擇本次實驗所要使用的熒光染料種類；單擊樣本類型；如要某些反映孔第一熒光染料關(guān)于應的樣本類型為標準品( )，點擊“鍵可設(shè)置其標準品濃度及釋倍數(shù)。點擊“ 鍵。單擊OP

2、en(打開熱蓋)或Close(關(guān)閉熱蓋)放置樣本；單擊 保存文件，始運行程序。結(jié)果分析PCR 反映結(jié)束后，軟件會自動計算標準曲線和Ct 值等。如需進行表達量分析、等位基因分析等，在軟件窗口選擇相應分析功能。點擊右上方的“RePOrt”鍵，還可輸出結(jié)果報告單關(guān)閉運行儀器實驗結(jié)束后取出反映管，順序關(guān)閉軟件、定量PCF 儀電源，關(guān)閉電腦。注意！CFX儀上蓋部分為全自動控制，在通電狀態(tài)，嚴禁任何人為干預上蓋開啟或關(guān)閉的行為，此類行為會導致上蓋故障，危及儀器使用。軟件操作快速指南實驗操作程序設(shè)置圖 1 顯示實驗設(shè)置窗口中一個預覽的程序。點擊,打開程序編輯器創(chuàng)建一個新的程序。點擊,經(jīng)過瀏覽器加載一個程序或

3、關(guān)于其進行編輯。使用下拉菜單直接加載一個程序或關(guān)于其進行編輯。點擊,打開程序編輯器編輯所選程序的各個步驟。點擊開始運行當前加載的程序。程序編輯器程序編輯器可用來創(chuàng)建一個新程序或編輯一個已存在的程序，圖1 在圖形或文本模式下選擇任何需要編輯的一步（該步驟會用藍色高亮顯示），點擊溫度或保持時間進行直接編輯。點擊SteP在程序中增加一個溫度步驟。點擊 SteP 在程序中刪除選中的步驟。點擊ASteP,在程序中指定獲取熒光數(shù)據(jù)的時間。如果當前的高亮顯示步驟已經(jīng)進行了讀板設(shè)置，則這一選項變?yōu)?。如果在這一步不想獲取數(shù)據(jù)，則點擊。點擊GoTo 24步。點擊GoTC GoTo的步驟。增加一個梯度步驟：1 在程

4、序編輯控制窗口中，點擊,圖2。擊數(shù)值進行編輯，圖度來滿足指定的溫度范圍。增加熔解曲線：1 在程序編輯控制窗口中，點擊,圖2。在圖形或文本顯示模式下，點擊溫度值來編輯融解曲線范圍的最低和最高溫度，圖4 第 5步950 C1aso_期2 S5, C3 550 C for03-Aate RwcJ 4Gf 2TS marttimes_.5 S6.00.5 C t 環(huán)點擊增量值來編輯數(shù)據(jù)獲取的溫度區(qū)間點擊保持時間編輯每一個增量溫度的保持時間嗽件數(shù)據(jù)分析快速指南定量分析數(shù)據(jù)瀏覽擴增圖表可以顯示實驗中每個循環(huán)每個孔收集的相關(guān)于熒光信號曲線。點擊位于擴增圖表下方的熒光檢查窗，選擇需要顯示的熒光數(shù)據(jù)，圖1。在孔

5、選擇器中點擊孔，行或列來顯示所選孔的熒光數(shù)據(jù)，圖1選中的孔是藍色的，未選中的孔是亮灰色的。若把光標置于熒光信號曲線上，孔選擇器中的孔上，數(shù)據(jù)電 子表格的孔上，或者標準曲線上均可以顯示岀相應的信息。棟荃.B M 4 3 ,tna 口數(shù)據(jù)分析選項CFX軟件可以自動的扣除從各個孔所得數(shù)據(jù)的基線。從菜單欄中選擇,選擇ThreShoI可以改變基線范圍。軟件會自動計算基線的位置?？梢渣c擊并且拖 動閥值線來手動位。點擊工具欄中按鈕來編輯孔的內(nèi)容，可以臨時創(chuàng)建新的分群，從 分析中增加或刪掉一些孔。IU?圖表選項可用鼠標右鍵點擊任何圖表來復制或保存圖像，或選擇除柵格，圖2。點擊工具欄中TraCe按鈕，或鼠標右鍵

6、點擊任何圖表來設(shè)來改變軸范圍或刪制定孔的熒光信號曲 線顏色。鼠標左鍵點擊任何圖表，向下和拖動光標可以放大圖表。孔的分數(shù)據(jù)瀏覽使用工具欄中SeIeCtGroup下拉菜單來瀏覽指定孔的分群數(shù)據(jù)，圖3。軟件可以針關(guān)于每個分群作為獨力的實驗來處理，每一個分群可針關(guān)于自己的設(shè)置進行分析，如進行自身標準曲線的分析。VGrOUP 1.軸 2GroUP 3Gr o 4定量數(shù)據(jù)分析顯示選項點擊數(shù)據(jù)分析窗口中,瀏覽數(shù)據(jù)計算和統(tǒng)計，囊括每孔的閥值（CT）和平均值以及復制的標準偏差，圖4。點擊任一列的標題進行鑒于列的行分類。鼠標右鍵 點擊電子表格并且選擇Sort 可進行鑒于多個列的行分類。鼠標左鍵點擊任一列的標題并且

7、向左或向右拖動可以重新排列電子表格中列的順序。4。從 鼠標右鍵點擊電子表格，下拉菜單中選擇輸岀在反映板柵格模式下顯示所選熒光的孔數(shù)據(jù)。創(chuàng)建報告顯示選項點擊數(shù)據(jù)分析窗口工具欄中RePOrt 按鈕，圖1 ,打開RePOrt 窗口，圖5。點擊報告選項列表中的檢查窗，使制定信息包含在報告中，這些信息在預覽部分中會有所顯示，圖5。點擊工具欄中 并且擇 ,以PF 格式保存報告，或選擇 打印報告。也可以保存報告為其它的文件格式。FAM-HEX MUltIPtoX PaIiM1122* PV .wWoWoW VWl am wOMBTW -1IHHgggHIimlllllIl mIL 軟件基因表達分析快速指南O

8、f CFX 軟件來評估樣本之間靶標| 濃度的相關(guān)于差衡量目標基因的水平。參照基因用來校正上樣的差異或各樣本取樣的差異。經(jīng)過生物學條件的研究，參照基因的表達水平通常不發(fā)生變化?；虮磉_分析設(shè)置圖 1 顯示各樣本孔含單一的熒光，四個復制類群，包含兩個不同靶標名稱和兩個不同的樣本名稱。指定參照基因11Unk-I1SirrOt 1 Unkl4 1 1nk 1T*須 112I 2nk-2T 123Aget 2 Samok1Unk-34Unk-4T ifQtl 2 22nk 4T4f222BC2 SimPl3Unk-32Samk 1點擊反映板編輯器中或打開實驗設(shè)置窗口,圖 2。 。點擊合適的檢查窗選擇將被

9、使用為參照基因的靶標。點擊Show檢查窗，為靶標設(shè)置反映擴增效率。檢查窗被默認設(shè)定。如果實驗中運行一個標準曲線，從標準曲線中計算得到的擴增效率將在計算中被使用?；蛘哧P(guān)于合適的靶標輸入指定反映擴增效率值，則計算中將使用這一擴增效率 值。指定關(guān)于照樣本1 在窗口，選擇標簽。2.點擊合適的檢查窗，選擇在計算中將被作為關(guān)于照的樣本，圖3。關(guān)于每個基因來說，關(guān)于照樣本的被指定為1 ,同時一切其他樣本相關(guān)于于關(guān)于照樣本的值會被顯示岀來基因表達分析選擇分析模式1 從 Moe 下拉菜單中選擇分析模式，圖ii1LZWrS*49VM.Xn*I*w*rtUM沁9c*ta CWAJEOwt OttBmUIO*ML.LJMaWna*13 BW*vtfarf*MHh*Ow EQf BvMkAobr-1- 11:UMiJHrC -靶標基因的相關(guān)于量可經(jīng)過樣本的參照基因來進行相關(guān)于量的衡量。相關(guān)于量ZC-圖形選項GraPh下拉菜單中選擇關(guān)于照相關(guān)或零相關(guān)的圖形數(shù)據(jù)。在表中，GraPh選項默認是照相關(guān)。X軸下拉菜單中選擇X軸以SamPIe顯示或 顯示。Y軸下拉菜單中選擇 , 或 作為Y軸刻度。OPtiOn下拉菜單中選擇,LOWeSt 或。TyPe下