酶聯(lián)免疫快速檢測試劑盒在動物源性食品中的檢測原理與應(yīng)用情況及注意事項

1、酶聯(lián)免疫快速檢測試劑盒在動物源性食品中的檢測原理與應(yīng)用情況及注意事項 主要內(nèi)容1、概要2、藥物殘留的危害及控制殘留的意義2、酶聯(lián)免疫檢測原理3、實際檢測中的常見問題4、公司簡介動物性食品安全已成為全世界關(guān)注的焦點，其中獸藥殘留問題是影響動物性食品安全的最主要因素之一。國際外貿(mào)畜產(chǎn)品進出口條例明確規(guī)定了氯霉素、硝基呋喃類等藥物殘留是肉品國際貿(mào)易中的必檢項目。我國是農(nóng)業(yè)大國，畜禽產(chǎn)品的對外貿(mào)易在我國的國民經(jīng)濟中已顯示了非常重要的地位，但由于藥物殘留量超標問題，致使畜禽肉產(chǎn)品的出口在國際市場上屢屢受挫，已成為阻礙我國畜牧養(yǎng)殖業(yè)的一大棘手問題。 一、概 要（一）藥物殘留的危害1.對食品安全的影響（1）

2、急性中毒“瘦肉精”、“抗球王”中毒事件等（2）慢性中毒氯霉素、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、氨基苷類等（3）“三致”作用苯丙咪唑類、雌激素、砷制劑、喹噁啉類、硝基呋喃類和硝基咪唑類（4）變態(tài)反應(yīng)青霉素、磺胺類、氨基糖苷類和四環(huán)素類等（5）誘導(dǎo)耐藥菌株四環(huán)素類、喹諾酮類等，如喹諾酮類由于是家禽體內(nèi)空腸彎曲桿菌產(chǎn)生耐藥性并傳遞到人的空腸彎曲桿菌而被許多國家禁用于食品動物（6）激素樣作用二、藥物殘留的危害及控制殘留的意義2.對社會的影響（1）大眾消費心理恐慌（2）社會負擔(dān)（3）環(huán)境生態(tài)變化，如常山酮、有機砷制劑等3.對產(chǎn)業(yè)的影響（1）對獸藥產(chǎn)業(yè)、飼料工業(yè)的影響（2）對養(yǎng)殖業(yè)的影響（3）對食品加工業(yè)的影響4.

3、對進出口貿(mào)易的影響藥物對人體的危害:硝基呋喃-致癌 孔雀石綠-致癌、致畸、致突變氯霉素-再生障礙性貧血、速發(fā)型過敏 、皮炎 喹諾酮類-兒童頭痛、肝、腎功能 損害磺胺類 -免疫下降、破壞造血系統(tǒng)、溶血性貧血、 潛在致癌排 泄 物土 壤魚、蝦等轉(zhuǎn)移降解消除毒性富集消除獸藥及飼料添加劑對生態(tài)環(huán)境的影響二、酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)的基本原理 ELISA是一種免疫測定（immunoassay，IA） 抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。加 入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，由此進行定性或定量分析。1.抗原抗體反應(yīng)的特點1.1可逆性 抗原與抗體結(jié)合形成抗原抗體復(fù)

4、合物的過程是一種動態(tài)平衡，其反應(yīng)式為：Ag+AbAgAb 抗體的親和力（affinity），可以用平衡常數(shù)K表示：K=AgAbAgAb ,AgAb的解離程度與K值有關(guān)。高親和力抗體的抗原結(jié)合點與抗原的決定簇在空間構(gòu)型上非常適合，兩者結(jié)合牢固，不易解離。解離后的抗原或抗體均能保持原有的結(jié)構(gòu)和活性。1.2 敏感性 化學(xué)比色法的敏感度為mg/ml水平。 酶反應(yīng)測定法的敏感度約為5-10g/ml。 免疫測定中凝膠擴散法和濁度法的敏感度與酶反應(yīng)法相仿。 標記的免疫敏感度可提高數(shù)千倍，達ng/ml水平。 例如，氯霉素、呋喃唑酮類藥物，其敏感度可達0.05ng/ml以下。1. 3特異性 抗原抗體的結(jié)合發(fā)生在

5、抗原的決定簇與抗體的結(jié)合位點之間?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型互補關(guān)系，具有高度的特異性。即“鑰匙與鎖”的關(guān)系。 與類似物的交叉反應(yīng)率是評價特異性的技術(shù)指標。 2、ELISA的類型 一、ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。在這種測定方法中有三個必要的試劑：（1）固相的抗原或抗體，即免疫吸附劑（immunosorbent）；（2）酶標記的抗原或抗體，稱為結(jié)合物（conjugate）；（3）酶反應(yīng)的底物。 可設(shè)計出各種不同類型的檢測方法；藥殘檢測時常采用下例方法來進行檢測。 ELISA的原理和類型二、必備試劑：ELISA中有三個必要的試劑：免疫吸附劑、結(jié)合物和酶的底物 1.已包被抗原或抗體的固相載體

6、（免疫吸附劑） 2.酶標記的抗原或抗體（結(jié)合物） 3.酶的底物 4.陰性對照品和陽性對照品，參考標準品 5.結(jié)合物及標本的稀釋液 6.洗滌液 7.酶反應(yīng)終止液三、方法類型： 1.雙抗體夾心法測抗原 2.雙抗原夾心法測抗體 3.間接法測抗體 4.競爭法測抗體或抗原ELISA中常用名詞1.半抗原: 只有免疫反應(yīng)性,而無免疫原性的小分子物質(zhì).如藥物,多糖,類脂等2.抗原: 凡是能刺激機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答并能與應(yīng)答產(chǎn)物特異結(jié)合的物質(zhì) 3.載體: 賦予半抗原具有免疫原性的蛋白質(zhì)分子,即為載體.4.抗體:可與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)的免疫球蛋白 5.穩(wěn)定性:通常用戶指的穩(wěn)定性既指試劑盒的保存期，又指試劑盒不

7、同批次的均一性 6.特異性:試劑盒特異性一般指試劑盒出現(xiàn)假陽性或假陰性的概率 7.準確度:一般用回收率來表示,是評價試劑盒好外的重要指標 ELISA中常用名詞8.靈敏度:指測定值(平均值)與真實值的接近程度,表示分析結(jié)果的正確性.由于無法知道櫚的真實濃度,故通常采用添加回收率來表示: 回收率=(測定值-空白值)/添加量9.精密度:指用某種方法重復(fù)測定同一均質(zhì)樣品所得測定值的彼此接近程度,表示分析結(jié)果的重復(fù)性.10.檢測限:檢測限指分析方法能夠從櫚的背景信號中檢測出待測物存在時所需的最低濃度.11.定量限:指分析方法能夠?qū)悠分械拇郎y物進行定量測定的最低濃度. ELISA中常用名詞8.靈敏度:指

8、測定值(平均值)與真實值的接近程度,表示分析結(jié)果的正確性.由于無法知道櫚的真實濃度,故通常采用添加回收率來表示: 回收率=(測定值-空白值)/添加量9.精密度:指用某種方法重復(fù)測定同一均質(zhì)樣品所得測定值的彼此接近程度,表示分析結(jié)果的重復(fù)性.10.檢測限:檢測限指分析方法能夠從櫚的背景信號中檢測出待測物存在時所需的最低濃度.11.定量限:指分析方法能夠?qū)悠分械拇郎y物進行定量測定的最低濃度. ELISA中常用名詞12.交叉反應(yīng)因為共同抗原的存在，由甲乙兩種細胞刺激機體產(chǎn)生的抗體不僅可分別與其自身表面的相應(yīng)抗原表位結(jié)合，而且由甲菌刺激機體產(chǎn)生的抗體還能與乙菌表面的相同表位結(jié)合；同樣，乙菌刺激機體產(chǎn)

9、生的抗體亦可與甲菌表面的相同表位結(jié)合，但反應(yīng)程度較弱，這種抗原、抗體反應(yīng)即稱為交叉反應(yīng)（cross reaction）。交叉反應(yīng)現(xiàn)象的形成可能與下列因素有關(guān)：（1）共同抗原，不同生物體的某些生物大分子具有相同的抗原結(jié)構(gòu)；（2）共同表位，不同的生物大分子的某些片段（肽段）具有相同的表位；（3）相似表位，不同的生物大分子，其表位的部分空間構(gòu)象十分類似，可以和同一種抗體的互補決定區(qū)相契合。固相載 體抗體酶抗原酶標記抗原直接競爭法(包抗體)：1.將抗體包被在固相載體上。2.加入樣品和酶標記抗原, 兩者競爭板上的抗體.3.酶催化底物并顯色。 荷蘭ED、英國RANDOX 、比利時部份試劑盒采用樣本/標品(

10、抗原)方法:反應(yīng)步驟少,操作簡單;特異性不如間接競爭法.方法一酶抗抗體酶標記抗抗體抗體偶聯(lián)抗原樣本/標品固相載體 間接競爭法(包被抗原)：1.將抗原包被在固相載體上。 2.加入樣本和抗體后，若樣本中 含有抗原，則將和板上抗原競爭結(jié)合加入的抗體。3.再加入酶標記抗抗體，則結(jié)合為抗原-抗體-酶標記抗抗體復(fù)合物。4.酶催化底物并顯色德國拜發(fā)（部份試劑盒） 、勤邦生物采用方法二:二步反應(yīng),操作比較簡單,有放大靈敏度和增強準確度的作用方法二德國拜發(fā)、荷蘭ED采用固相載體酶抗原酶標記 抗體樣本/標品(抗原)抗抗體抗體間接競爭法(包二抗)：1.將抗抗體（二抗）包在固相載體上。2.加入抗體，則結(jié)合為抗抗體-抗

11、體復(fù)合物。3. 加入樣本和標準品及酶標記抗原，兩者競爭結(jié)合抗體。4.酶催化底物并顯色。方法三:二步反應(yīng),操作比較簡單,在加樣本時容易出現(xiàn)時間差而影響檢測結(jié)果的準確度.方法三一步法反應(yīng)：1.將抗原（或二抗）包被在固相載體上。 2.加入樣本和酶標記二抗或酶標抗原后，最后加入抗體，三種一起混合反應(yīng)。形成抗原（或二抗）-抗體-酶標記抗抗體（或抗原）復(fù)合物。4.酶催化底物并顯色 “一步法反應(yīng)”德國拜發(fā)、勤邦生物、意大利Euroclone（部份試劑盒）采用固相載體 方法四:操作簡單,方便,快速.反應(yīng)靈敏.酶抗抗體酶標記抗抗體抗體樣本/標品（抗原）抗抗體方法四標準品濃度關(guān)系標準1標準2標準3標準4標準5標準

12、6微孔板抗體示意圖酶酶標二抗TMBTMB 加入標準品/樣本和抗體后加先加孵育洗板過程示意圖未結(jié)合的抗體、標準品、游離態(tài)的抗體抗原結(jié)合物加入酶標二抗酶酶酶酶酶酶酶酶酶酶酶酶酶酶酶孵育酶酶酶酶酶酶酶酶酶酶酶酶酶酶加入底物和顯色劑酶酶酶酶酶酶酶酶酶酶酶酶后加A液先加B液顯色有經(jīng)驗者可根據(jù)顏色深淺調(diào)整顯色時間酶酶酶酶酶酶酶酶酶酶酶酶終止酶酶酶酶酶酶酶酶酶酶酶酶0.5M H2SO4反應(yīng)終止后顏色示意圖標準曲線樣本顯色情況標準1標準2標準3標準4標準5標準6得出讀數(shù)以后再用專用軟件進行分析即可無酶標儀不加終止液直接比對標準品顯色情況樣本顯色標準1標準2標準3標準4標準5標準6樣本1樣本2樣本1的顯色情況可

13、以看出大概在標準2與標準1的顏色之間，即可得出其樣本中的待測物含量在標準1與標準2之間，再乘上樣本的稀釋倍數(shù)以后即可得出該樣本的最終含量范圍。同理可以看出樣本的檢測含量在標準5與標準6的濃度之間，再乘上樣本的稀釋倍數(shù)以后即得到該樣本的大概含量。ELISA整個流程示意圖后加先加酶酶酶酶酶酶酶酶酶酶酶酶酶酶酶酶酶酶酶酶酶酶酶酶酶酶酶后加A液先加B液酶酶酶酶酶酶酶酶酶酶酶酶2M H2SO4洗板洗板顯色混勻拍干拍干注意事項1、實驗前檢查酶標儀和打印機工作是否正常。2、試劑盒反應(yīng)溫度為25度或37度，要提前開空調(diào)或恒溫箱，并調(diào)整好溫度。3、使用之前將所有試劑溫度回升至室溫25。使用之后立即將所有試劑放回

14、2-8冰箱。4、洗板所用水為去離子水，若沒有制備去離子水的儀器，也可使用純凈水。5、在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，仔細按照推薦的洗板順序操作是ELISA測定程序中的要點。在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會出現(xiàn)標準曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板排干后應(yīng)立即進行下一步操作。注意事項6、反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。7、不要使用過了有效日期的試劑盒，稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值的變化。不要交換使用不同批號的盒中試劑。8、儲存條件保存試劑盒于2-8，不要冷凍；將不用的微孔板放進自封袋重新密封；標準物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光

15、線下。9、試劑變質(zhì)的跡象顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當棄之。0標準的吸光度值小于0.5個單位（OD450nm0.5 ）時，表示試劑可能變質(zhì)。三、開展檢測項目時常遇到的問題與解決方案 在以前，我們常使用兩種或三種試劑盒來進行日常檢樣工作，但隨著檢測項目的增加和試劑盒產(chǎn)家的不同，在檢測過程中往往出現(xiàn)一些由于操作誤差而帶來不必要的損失。 如：前處理方法混淆、試劑盒點板時的溫度或反應(yīng)時間出錯等。 1 方案（前處理）（1)針對每種試劑盒的前處理，制定出前處理SOP操作控制指南，防止操作過程中出現(xiàn)前處理方法上的混淆，加強對檢測一線的人員進行培訓(xùn)、考核。（2）在進行添加回收實驗時，先設(shè)計好添加濃度與對應(yīng)的

16、添加量，需注意詳細記錄添加過程，防止因計算失誤而影響添加效果。1.2 方案（點板）（1）設(shè)置專人專項目制度，建立每種試劑盒點板操作SOP控制指南，在檢測過程中填寫檢測記錄，包括開始點樣品和抗體的時間，反應(yīng)時間，洗板后加酶時間等等，做到每一步有據(jù)可查，每一環(huán)節(jié)有標可依。（2）在更換試劑或耗材的時候，需要進行防更換影響測定，避免由于此類原因給檢測中造成損失。（3）在一人同時點多種試劑盒板的時候，要注意提前區(qū)分好每種試劑盒的試劑，防止在實驗過程中出現(xiàn)反應(yīng)時間和所用試劑混淆。報告方式定量分析 用已知量的標準品做ELISA測定，繪制標準曲線，ELISA的標準曲線每次都要和待測標本做在同一塊板上?，F(xiàn)有的E

17、LISA定量試劑盒標準曲線只有在較窄的濃度范圍內(nèi)成直線，要得到精確的結(jié)果實屬不易。因此不能用定性試劑盒做定量分析。灰區(qū)概念 把定量分析的正常值范圍引入定性分析建立灰區(qū)概念，即將檢測限值上下的一段區(qū)域定為陽性可疑，需重復(fù)實驗或換試劑重測以確定其陰陽性，如仍落在灰區(qū)范圍內(nèi)需要用確證方法進行確證實驗。 2 儀器設(shè)備 酶聯(lián)免疫實驗室需要的設(shè)備應(yīng)根據(jù)實驗室實際條件來進行配備。主要的實驗儀器有：能進行50ml管離心的離心機（非冷凍也可）；組織勻漿器；移液器（20-200l；100-1000l；50-300l八道排槍）；電子天平（0.01g）；渦流儀；具有吹氮氣或空氣的多道吹干裝置；酶標儀(部份需要另配打印

18、機)；電腦（用于數(shù)據(jù)分析與儲存）2.1儀器質(zhì)控 為使儀器保持最佳工作狀態(tài)應(yīng)建立維護和校正儀器的標準操作程序（SOP），所要控制的儀器包括移液器（加樣槍），溫箱，洗板機和酶標儀。移液器：ELISA加樣量小（20-200l），其準確性直接影響實驗結(jié)果，利用稱重法檢查：低、中、高三個刻度分別吸取指示量的水，萬分之一天平稱重后計算吸量是否準確，一般應(yīng)在5%以內(nèi)；恒溫箱 經(jīng)常檢查恒溫箱溫度計所示的溫度和水中（或溫箱內(nèi)）實測溫度是否一致，允許有1的誤差；洗板機 每個廠家設(shè)置洗板后的殘留液有各自的規(guī)定一般不超過2ul ，人工扣板時，墊紙不濕，定期檢查管孔是否堵塞；酶標儀 經(jīng)常維護其光學(xué)部分，防止濾光片霉變，

19、定期檢測校正，使其保持良好的工作性能。 3、試劑盒選擇應(yīng)盡量選擇正規(guī)廠家，產(chǎn)品經(jīng)相應(yīng)政府部門審核認可，試劑應(yīng)從靈敏度，特異性，精密度，穩(wěn)定性，簡便性，安全性及經(jīng)濟性作出全面的評價。靈敏度：有二層含義，1）為試劑檢出被檢物質(zhì)的最低量的能力；2）為試劑對大量樣品中陽性檢出的能力。特異性：常用交叉反應(yīng)率表示。含有與待測物相近結(jié)構(gòu)部份的物質(zhì)可能存在交叉反應(yīng)，使測定結(jié)果升高，可能導(dǎo)致假陽性，所以交叉反應(yīng)是評價其質(zhì)量的關(guān)鍵指標。 精密度：ELISA試劑一般指其批內(nèi)CV，其值應(yīng)小于15%；定量試劑應(yīng)同時考察線性范圍準確度：通過添加回收實驗進行評價。簡便性：指在不影響試劑的前三項指標的前題下，實驗和測定步驟越

20、少越好，在定性試驗中結(jié)果判斷簡單明了，定量試驗結(jié)果計算也應(yīng)簡單。安全性：指試劑對操作者和環(huán)境安全無害無傳染性。經(jīng)濟性：試劑在同等質(zhì)量條件下通過大規(guī)模生產(chǎn)或技術(shù)進步降低成本而市場價格比較合理。試劑評價：需要有權(quán)威的確證方法確證的樣品進行檢測。樣本前處理注意事項一、均質(zhì)組織樣本肉、肝食品類：切細，用絞肉機反復(fù)絞碎，混合均勻。水產(chǎn)樣品：去除樣品的非食用部分，食用部分切細，用絞肉機反復(fù)絞三次，混合均勻;原料表面較臟時,需適當用清洗。蛋：鮮蛋去殼，蛋黃和蛋白充分混勻。水果、蔬菜類：先用水洗去泥沙，然后除去表面的水分，取食用部分。二、振蕩提取將提取溶劑加入到裝有樣品的具塞容器中，振蕩，使容器內(nèi)的樣品與提取

21、溶劑充分接觸，以深入到樣本組織內(nèi)部提取待測組分。振蕩方式：振蕩器上進行上下、往返式振蕩。手搖式上下振蕩注： 1、在組織樣本中加入有機溶劑之間提取時，應(yīng)邊加邊振蕩，防止組織凝結(jié)成團，不利于提取。 2、在用有機溶劑提取過程中，如果出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，解決的方法有：用細頭輕輕的攪拌，破壞乳化后，再重復(fù)離心。再加入適量的提取劑，重新振蕩。注意離心后的操作要保證樣本的稀釋倍數(shù)不變。 三、濃縮 由于凈化過程中引入的溶劑，可能會降低待測組分的濃度或者不適宜直接分析，需要去處全部有機溶劑進行溶劑轉(zhuǎn)換。相當于試劑盒前處理步驟中把樣本在60度氮氣下吹干，再用復(fù)溶液溶解干燥殘留物。濃縮方式：氮氣吹干除雜壓縮空氣吹干除雜注

22、意： 1、在吹干樣本之前，用甲醇清洗針頭，防止雜質(zhì)干擾。 2、在吹樣本是，針頭應(yīng)在液面上空，避免與樣本接觸，防止產(chǎn)生交叉污染。 3、樣本吹干后應(yīng)立即取下，避免吹的時間過長，影響最終檢測結(jié)果。 4、不同的藥物，吹干后樣本的保質(zhì)期不同，提倡待樣本回到室溫后立即復(fù)溶。 四、凈化 經(jīng)過提取的待測組分，提取物中通常含有一些會干擾試劑盒中抗原抗體反應(yīng)的雜質(zhì)或者是含有與待測物結(jié)構(gòu)相似的雜質(zhì)，將待測組分與雜質(zhì)分離的過程，我們把它稱為試劑盒中樣本的凈化。在我們現(xiàn)有的試劑盒前處理方法中涉及到的最常見的凈化是：液液分配法 比如：用復(fù)溶液溶解干燥殘留物之前先加入適量的正己烷，在加入正己烷和復(fù)溶液渦動后如果出現(xiàn)乳化現(xiàn)象

23、，可以60度水浴加熱，至乳化現(xiàn)象消失或減弱后，加大離心轉(zhuǎn)速進行離心。硝基呋喃代謝物檢測過程中常見問題 硝基呋喃代謝物有四種：3-氨基-2-唑烷基酮(AOZ)、5-甲基嗎啉-3-氨基-2-唑烷基酮(AMOZ)、氨基脲(SEM)和1-氨基-2-內(nèi)酰脲(AHD)在檢測過程中也需要同其它項目一樣進行添加回收測評，這其中需要注意以下幾個問題。 代謝物在組織中是與蛋白呈結(jié)合狀態(tài)，采用普通的有機溶劑或緩沖液，是無法提取該代謝物的。需要用鹽酸水解后才能使呋喃類代謝物游離，所以在加入去離子、鹽酸和2-硝基苯甲醛(2-NBA)混合均勻后，其pH應(yīng)在1-3之間，否則不利用水解代謝物。 在衍生化過程中，溫度和時間決定

24、其衍生化產(chǎn)率，衍生化后在加入氫氧化鈉和磷酸氫二鉀時，其pH應(yīng)在中性左右。由于部份樣本的緩沖能力不同，所以需對其pH進行測定，因為在酸性或堿性環(huán)境中，不利于呋喃類代謝物的提取回收，同時也容易出現(xiàn)假陽性。硝基呋喃代謝物添加回收的幾種誤區(qū)：呋喃類代謝物提取過程通常分三個關(guān)鍵步驟：水解-衍生化-提取(1)采用標準曲線的最大標準濃度進行添加回收。如德國拜發(fā)和我公司AOZ試劑盒中的第6個標準點4.05ppb，AMOZ試劑盒中的第6個標準點8.1ppb。因為這些標準品是已經(jīng)經(jīng)過衍生化后的標準品，不能代表樣本前處理實驗中的加酸水解和加衍生化試劑衍生這兩個步驟，所以就算回收率很高，但失去了實際參考價值。（2）完

25、全依賴未衍生的代謝物標準品進行添加回收。因部份未衍生的代謝物在配制成標準品后有一定的有效期，會存在潛在的不穩(wěn)定因素，而且添加回收僅能考證衍生化和提取兩個關(guān)鍵點，不能驗證從組織蛋白中水解呋喃類代謝物的過程，因此也有一定的局限性。 最好的評價方案：采用經(jīng) LC-MS-MS 確證的陰陽性樣品，留作質(zhì)控樣品，對檢測的樣本和試劑盒進行質(zhì)量評價。這也是實驗室所出數(shù)據(jù)可信度最具說服力的關(guān)鍵點。（一）肌肉、肝臟、水產(chǎn)（魚蝦等）組織前處理方法用均質(zhì)器均質(zhì)樣本；稱取1.00.05g均質(zhì)后的組織樣本，分別加入4ml的去離子水、0.5ml 1M 鹽酸溶液（見配液3）和100l衍生化試劑,用振蕩器充分振蕩2min；在3

26、7 過夜孵育（大約16h）；分別加入5ml 0.1M 磷酸氫二鉀溶液（見配液2）、0.4ml 1M 氫氧化鈉溶液和8ml乙酸乙酯，用振蕩器劇烈振蕩30s；3000g以上，室溫（20-25 /68-77）離心10min；取5.6ml乙酸乙酯相至10ml干燥的玻璃試管中，于5060氮氣流下吹干；加入1ml正己烷（或正庚烷），用渦旋儀渦動30s，再加入0.7ml復(fù)溶工作液，用渦旋儀渦動1min充分混勻；3000g以上，室溫（20-25 /68-77）離心10min；除去上層有機相，取下層水相50l用于分析。稀釋倍數(shù)：1呋喃類藥物代謝物統(tǒng)一前處理方法 氟喹諾酮類藥物試劑盒現(xiàn)有的樣本前處理方法中，用二氯

27、甲烷作為提取劑注意：二氯甲烷的密度比水大，離心完后，二氯甲烷在下層，須先用加樣器吸盡上層廢液后，再按要去取適量的下層吹干。在用加樣器吸取下層的有機相時，正常操作往往取量不準確，此時最好用帶有刻度，且刻度相對較準確的玻璃管來定量。 上訴情況對有經(jīng)驗的試驗員還可以通過靈活控制加樣器來控制取樣的準確性。在振蕩過程中要注意安全。二氯甲烷在振蕩的過程中，如果離心管蓋密封性不時很好，往往容易爆開，在進行振蕩時，不要讓離心管口對準自己或者其他人，避免濺到自己或者他人身上。試劑盒在使用前充分回溫很必要，如回溫不充分該項目曲線影響較明顯。酶標分析過程中的注意事項 樣本的檢測是基于抗原抗體的反應(yīng)，根據(jù)標準曲線，判

28、定樣本最終的藥物含量。它要求加樣的準確性和洗板的一致性。在整個加樣的過程中注意實驗室溫度的恒定，保證反應(yīng)在試劑盒所示的溫度下進行。一、常見加樣方式A、吸一打二B、吸二打一：在實際操作過程中，提倡用“吸二打一”，用這種方式，有如下幾種好處：a、加樣過程中在板空內(nèi)不出現(xiàn)或者很少出現(xiàn)氣泡 b、提高加樣速度，縮短前后樣本反應(yīng)的時間差。在加樣的過程中還應(yīng)細心注意避免出現(xiàn)下列現(xiàn)象：A、加樣的過程中漏加或者重加；B、加樣的過程中忘記更換吸頭；C、樣本的重加或者漏加 D、忘記記錄樣本的加樣順序二、常見的洗板方式 A、洗板機洗板；B、多道孔加樣器洗板；C、多孔吸頭洗板 在洗板的過程中，確保每孔所加洗滌液量的均一

29、，按說明書操作，不可過多，避免溢出板孔，污染其它樣本，過少，則達不到洗滌的效果。三、甩板快速甩盡板孔內(nèi)的液體。防止板孔里的液體對流，產(chǎn)生交叉污染。四、拍板輕輕的在吸水紙上扣干板孔內(nèi)的液體。五、顯色 值得注意的是，并非試劑盒中所規(guī)定的顯色時間是絕對的，因為試劑盒的吸光度值會受環(huán)境中的溫度、濕度、酶標板反應(yīng)時所接觸到的物品的導(dǎo)熱度等有關(guān)，實驗操作人員在加完顯色液后，可根據(jù)顏色的深淺適當?shù)难娱L或者縮短顯色時間。防止出現(xiàn)吸光值接近或高于酶標儀的最高檢測靈敏度（OD值在2.5-3.0之間），這樣會間接影響到檢測結(jié)果，如出現(xiàn)曲線前半部份梯度不明顯或顛倒數(shù)值等現(xiàn)象，也就造成了一些假陽性或部份檢測結(jié)果偏低的現(xiàn)

30、象 關(guān)于勤邦-公司簡介勤邦生物是專業(yè)從事食品安全檢測的高新技術(shù)企業(yè)，始終致力于食品安全快速檢測設(shè)備和免疫試劑的自主研發(fā)、生產(chǎn)、銷售，產(chǎn)品涵蓋了食品安全檢測的完整產(chǎn)業(yè)鏈。 勤邦生物生產(chǎn)研發(fā)基地(約8000) 10萬級凈化車間，局部1萬級。達到GMP 要求的生產(chǎn)車間（約1000） 研發(fā)實驗室（約3000 ） SPF級實驗動物房（約800） 行政辦公區(qū)域（約2500）四、勤邦概況62應(yīng)用開發(fā)平臺 儀器開發(fā)平臺食品中殘留化學(xué)污染物抗原抗體200余種其他小分子藥物儲備抗原抗體100余種獸藥殘留檢測系列真菌毒素檢測系列農(nóng)藥殘留檢測系列微生物檢測系列轉(zhuǎn)基因檢測系列成分檢測系列理化檢測及食品安全檢測箱集機械設(shè)計、光路分析、軟件開發(fā)于一體,開發(fā):免疫試劑配套儀器本行業(yè)通用儀器等關(guān)于勤邦-四大科研平臺原材料抗原抗體合成平臺新技術(shù)研發(fā)平臺ELISA技術(shù)膠體金檢測技術(shù)化學(xué)發(fā)光檢測技術(shù)上轉(zhuǎn)換發(fā)光技術(shù)熒光微球免疫磁珠核酸檢測技術(shù)（lamp）PCR技術(shù)四、勤邦概況 產(chǎn)學(xué)研合作 與國內(nèi)高校、科研院所、企業(yè)等開展技術(shù)開發(fā)、標準制定、成果轉(zhuǎn)化、人才培養(yǎng)等多方面合作。 邀請國內(nèi)外權(quán)威專家成立企業(yè)顧問專家組，為重大關(guān)鍵問題提供指導(dǎo)及支持。 與高校