基本常用的技術

1、關于基本常用技術第1頁，共47頁，2022年，5月20日，6點8分，星期四第一節(jié) 無菌技術防止污染是決定培養(yǎng)成功或失敗的首要條件。由于體外培養(yǎng)細胞缺乏抗感染能力，故在一切操作中要努力做到最大限度的無菌。細胞培養(yǎng)工具做到細胞培養(yǎng)專用進出細胞培養(yǎng)室做到更衣?lián)Q鞋超凈工作臺紫外照射時不要放置過多物品遮擋紫外線第2頁，共47頁，2022年，5月20日，6點8分，星期四一、操作區(qū)消毒1.使用紫外線燈滅菌，照射細胞培養(yǎng)室和超凈工作臺20-30min。2.在用紫外線燈照射期間，超凈工作臺上放置物品不要過多，留有死角阻礙照射，勿置培養(yǎng)細胞和培養(yǎng)用液等物，以免受射線影響(必要時可用紙張覆蓋)。3.所有操作用具（包

2、括培養(yǎng)瓶）要經(jīng)75%的乙醇擦拭后才可放置進超凈工作臺內。4.實驗開始前使用75%的乙醇擦拭超凈工作臺臺面。第3頁，共47頁，2022年，5月20日，6點8分，星期四二、洗手和著裝1.進入細胞培養(yǎng)室更換專用室內鞋和無菌服、帽子和手套。2. 使用75%酒精或0.2%的新潔爾滅洗手。3.實驗過程中可能觸及污染物品或者出入培養(yǎng)室均要洗手。第4頁，共47頁，2022年，5月20日，6點8分，星期四三、火焰消毒1.在無菌環(huán)境進行培養(yǎng)或做其它無菌操作時，首先要點燃酒精燈。以后一切操作,需要在酒精燈附近進行。2.實驗中使用器械均要經(jīng)過火焰燒灼進行。3.金屬器械不宜灼燒長，防止退火和過熱。4.含營養(yǎng)液的吸管不要

3、灼燒防止營養(yǎng)液碳化。5.培養(yǎng)瓶口過火時間不要太長防止燒死細胞。第5頁，共47頁，2022年，5月20日，6點8分，星期四四、培養(yǎng)操作1.操作臺面布局合理2.不用手觸及已消毒物品3.操作保持一定順序，動作準確敏捷4.組織或細胞在未做處理前或培養(yǎng)液在未用前，勿過早暴露在空氣中；用過之后如不再重復使用，應立即封閉瓶口。5.防止各種用液的交叉污染。6.不向操作方向講話或咳嗽第6頁，共47頁，2022年，5月20日，6點8分，星期四原代培養(yǎng)：取自體內新鮮組織并置于體外條件下生長的細胞在傳代之前稱為原代培養(yǎng)。意義:1.原代培養(yǎng)的最大優(yōu)點是細胞剛剛離體，生物性狀尚未發(fā)生很大變化，具有二倍體的遺傳性，而且大多

4、數(shù)細胞表現(xiàn)出原來組織的特性。2.利用原代培養(yǎng)做各種實驗，如藥物測試、細胞分化及病毒學方面的試驗效果很好。3.原代培養(yǎng)也是建立各種細胞系（株）必須經(jīng)過的階段。第二節(jié) 原代培養(yǎng)第7頁，共47頁，2022年，5月20日，6點8分，星期四取材原則：1.幼體組織尤其是胚胎組織比年老個體的組織容易培養(yǎng)；2.分化程度低的組織比分化程度高的容易生長；3.腫瘤組織比正常組織容易培養(yǎng)。4.取材之后，最好立即培養(yǎng)，如因故不能培養(yǎng)時，應把組織切成1 立方厘米左右的小塊，置于培養(yǎng)液中，4貯存，存放時間不宜超過24 小時。5.從體內取材時，應嚴格保持無菌，避免受到紫外線照射或接觸任何化學試劑及有害藥物如碘、汞等。取腫瘤和

5、其它病理組織時容易帶菌，為減少污染，可用含500-1000 單位毫升的青、鏈霉素BSS 液，漂洗5-10 分鐘后再做培養(yǎng)處理。第8頁，共47頁，2022年，5月20日，6點8分，星期四取鼠胚組織引頸法處死小鼠整個小鼠浸入75酒精中2 3 秒鐘打開胸腔取出組織第9頁，共47頁，2022年，5月20日，6點8分，星期四組織的分離：從體內取出的各種組織均由眾多細胞和纖維成分組成，而且結合十分緊密。為獲取多量生長良好的細胞，必須把組織細胞分散開，使細胞解離出來。機械法化學法第10頁，共47頁，2022年，5月20日，6點8分，星期四機械法：把組織塊先剪成小塊后，把組織放入注射器針管中使用壓擠法，或是把

6、組織置于不銹鋼紗網(wǎng)中用鈍物壓取法。其中以壓取法較多用。簡便易行，節(jié)省時間，但對組織有一定損傷，僅適用于處理軟組織。第11頁，共47頁，2022年，5月20日，6點8分，星期四化學法：在把組織剪切成較小體積的基礎上，應用生化和化學手段進一步分散組織，最后制成細胞團或單個細胞懸液接種的方法。最常用的消化酶是胰蛋白酶和膠原酶兩種。第12頁，共47頁，2022年，5月20日，6點8分，星期四93第13頁，共47頁，2022年，5月20日，6點8分，星期四原代細胞培養(yǎng)結果細胞接種后一般幾小時內就能貼壁，并開始生長如接種的細胞密度適宜，5天到一周即可形成單層第14頁，共47頁，2022年，5月20日，6點

7、8分，星期四離體培養(yǎng)的細胞群體增殖達到一定密度時，細胞的生長和分裂速度就會減慢甚至停止，如不及時分離傳代培養(yǎng)，細胞將逐漸衰老死亡。傳代培養(yǎng)是指細胞從一個培養(yǎng)瓶以1：2或其他比率轉移，接種到另一培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)。貼壁培養(yǎng)細胞的傳代通常是采用胰蛋白酶消化。第三節(jié) 傳代培養(yǎng)第15頁，共47頁，2022年，5月20日，6點8分，星期四第16頁，共47頁，2022年，5月20日，6點8分，星期四貼壁細胞的傳代培養(yǎng)1.選取生長良好的細胞，倒去瓶中的舊培養(yǎng)液，加入23ml的PBS，輕輕振蕩漂洗細胞，以除去懸浮在細胞表面的碎片。2.加入適量0. 0.25胰蛋白酶消化液，室溫消化，倒置顯微鏡下觀察，待細胞單層收縮突

8、起出現(xiàn)空隙時，倒去酶液。3.用Hanks液洗滌1次，加入適量培養(yǎng)液，反復吹打細胞，使其成細胞懸液。4.使用臺盼藍進行細胞計數(shù)，按照計數(shù)結果進行分裝，并在培養(yǎng)瓶上做好標記，注明代號、日期，輕輕搖勻， 37 ，5%CO2培養(yǎng)。 5.24h后觀察的生長情況。第17頁，共47頁，2022年，5月20日，6點8分，星期四懸液細胞的傳代培養(yǎng)1.取生長良好的細胞，在超凈工作臺用無菌吸管把培養(yǎng)瓶中的細胞吹打均勻。2.轉移到無菌的離心管中，蓋緊膠蓋，平衡后離心（1 000r/min）5min。3.在超凈工作臺中吸去上清液，加入適量新培養(yǎng)液，用吸管吹打細胞，制成懸液。4.使用臺盼藍計數(shù)，按照結果進行分裝，并在培養(yǎng)

9、瓶上做好標記，注明代號、日期，輕輕搖勻， 37 ，5%CO2培養(yǎng)。 5.24h后觀察的生長情況。第18頁，共47頁，2022年，5月20日，6點8分，星期四細胞計數(shù)法是細胞學實驗的一項基本技術，是用于了解培養(yǎng)細胞生長狀態(tài)，測定培養(yǎng)基、血清、藥物等物質對細胞發(fā)揮作用的重要手段。 血球計數(shù)板計數(shù)法 電子細胞計數(shù)儀計數(shù)法 第四節(jié) 細胞計數(shù)第19頁，共47頁，2022年，5月20日，6點8分，星期四方法和步驟1.取酒精棉球清潔計數(shù)板和專用蓋玻片，并用絲綢布或擦鏡紙輕輕拭干。2.用胰酶消化分散貼壁細胞或直接收集懸浮細胞制成均勻分散的單細胞懸液，必要時應進行適當?shù)南♂尰驖饪s。3.混勻后直接取少許細胞懸液，

10、沿計數(shù)板上蓋玻片的一側加微量細胞懸液。加樣量以充滿不外溢為宜，也不要過少或出現(xiàn)氣泡。第20頁，共47頁，2022年，5月20日，6點8分，星期四4.統(tǒng)計四個大格的細胞數(shù)：將血球計數(shù)板放于顯微鏡的低倍鏡下觀察，并移動計數(shù)板，分別數(shù)出四角的四個大格（每個大格含有16個中格）中的細胞數(shù)。對壓邊線細胞：計上不計下，計左不計右 第21頁，共47頁，2022年，5月20日，6點8分，星期四計算：一般以每毫升含細胞數(shù)來表示 大方格的面積為1mm2，室深為0.1mm，則體積為0.1mm3。推算得0.1mm3104，才為1ml體積。所以計算公式為：細胞懸液的細胞數(shù)）/ml（四個大格子細胞數(shù)/4)104稀釋倍數(shù)計

11、數(shù)中，如果細胞懸液的細胞濃度過高，必須稀釋后再計；如果細胞數(shù)太少,可離心濃縮后再計。每個細胞懸液至少滴樣兩次求平均值。不要漏計，不要重復，細胞懸液應混合均勻，濃度不可過高也不可過低。第22頁，共47頁，2022年，5月20日，6點8分，星期四第23頁，共47頁，2022年，5月20日，6點8分，星期四細胞生長曲線的繪制細胞生長曲線(cell growth curve)是觀測細胞在一代生存期內的增生過程的重要指標，可根據(jù)細胞生長曲線分析細胞增殖速度，確定細胞傳代、細胞凍存或具體實驗的最佳時間。它以培養(yǎng)時間為橫坐標、細胞密度為縱坐標作坐標圖。 第24頁，共47頁，2022年，5月20日，6點8分，

12、星期四制作方法：1.培養(yǎng)細胞 首先在2孔培養(yǎng)板內分別接種相同數(shù)量的細胞。計數(shù)并記錄接種的細胞懸液之密度。接種時間記為0 h。2.計數(shù)細胞密度 從接種時間算起，每隔24h計數(shù)孔內的細胞密度，算出平均值。為提高準確率，對每孔細胞可計數(shù)23次。如此操作至第七天結束。3.繪制曲線 以培養(yǎng)時間為橫坐標、細胞密度為縱坐標，將全部結果在坐標紙上繪圖，即得所培養(yǎng)細胞的生長曲線。培養(yǎng)細胞的生長曲線第25頁，共47頁，2022年，5月20日，6點8分，星期四第五節(jié) 活細胞的染料排除檢測法原理：由于死細胞的細胞膜通透性發(fā)生改變，某些染料可大量進入?yún)s不被排出，因而細胞呈色。而活細胞反之，能排出進入細胞內的染料，因而不

13、易著色。此法的原理即是利用死、活細胞對染料的不同反應而區(qū)分開兩種細胞。最常用的為“臺盼藍排除檢測法”第26頁，共47頁，2022年，5月20日，6點8分，星期四 實驗方法： 1、將細胞懸液以0.5ml加入試管中。2、加入0.5ml 0.4%臺盼蘭染液，染色2一3分鐘。3、吸取少許懸液涂于載玻片上，加上蓋片。4、鏡下取幾個任意視野分別計死細胞和活細胞數(shù)，計細胞活力。死細胞能被臺盼蘭染上色，鏡下可見深蘭色的細胞，活細胞不被染色，鏡下呈無色透明狀。臺盼藍染細胞時，時間不宜過長。否則，部分活細胞也會著色，會干擾實驗結果。第27頁，共47頁，2022年，5月20日，6點8分，星期四1776年， “冷”處

14、理對“細胞”生命活動影響的報道。1900年前后，基本上肯定了生物成分(如精子)能夠在零下溫度貯存。1949年，發(fā)現(xiàn)了甘油對低溫下貯存細胞的保護作用。1959年，發(fā)現(xiàn)了一種新的化學保護劑，這就是現(xiàn)在常用的二甲基亞砜(DMSO)。當前低溫液氮凍存貯存細胞已是細胞培養(yǎng)室常規(guī)性通用技術 ，貯存時間幾乎是無限的。 第七節(jié)、細胞的凍存與復蘇第28頁，共47頁，2022年，5月20日，6點8分，星期四一、培養(yǎng)物的冷凍保存與復蘇原理冷凍保存(cryopreservation)：將體外培養(yǎng)物懸浮在加有冷凍保護劑的溶液中，以一定的冷凍速率降至零下某一溫度(一般是低于-70的超低溫條件)，并在此溫度下對其長期保存的

15、過程。復蘇(thawing)：是以一定的復溫速率將凍存的培養(yǎng)物恢復到常溫的過程。 第29頁，共47頁，2022年，5月20日，6點8分，星期四細胞凍存時，存在兩種損傷：冰晶損傷 溶質損傷冰晶損傷：由于溫度下降，細胞內外的水分都會結冰，所形成的冰晶會造成細胞膜和細胞器的破壞并引起細胞死亡。這種因細胞內、外結冰而致的細胞損傷被稱為細胞的冰晶損傷。 冰晶損傷是由冷卻速度過快造成，冷卻速度越快，冰晶損傷越大。第30頁，共47頁，2022年，5月20日，6點8分，星期四溶質損傷：因保存溶液溶質濃度增高而致的細胞損傷被稱為溶質損傷。細胞懸浮在溶液中，隨著溫度的下降，細胞外部的水分會先結冰，從而使得未結冰的

16、溶液中電解質的濃度升高。如果將細胞暴露在這樣高溶質的溶液中且時間過長，細胞膜上脂質會受到損壞，細胞便發(fā)生滲漏。 溶質損傷是由冷卻速度過慢，使細胞在高濃度的溶液中暴露的時間過長而造成，冷卻速度越慢，此損傷越嚴重。 第31頁，共47頁，2022年，5月20日，6點8分，星期四如果在溶液中加入冷凍保護劑時，則可保護細胞免受溶質損傷和冰晶損傷。保護機理：冷凍保護劑易同溶液中水分子結合，從而降低冰點，減少冰晶的形成 ；通過其摩爾濃度降低未結冰溶液中電解質的濃度，使細胞免受溶質的損傷，細胞得以在超低溫條件下保存。 第32頁，共47頁，2022年，5月20日，6點8分，星期四影響冷凍效果的因素有以下幾點：1

17、.冷凍速率當冷凍速度過慢時，細胞脫水嚴重，細胞體積嚴重收縮，超過一定程度時即失去活性。冷凍速度過慢，還會引起細胞外溶液部分結冰，從而使細胞外未結冰的溶液中溶質濃度增高，產(chǎn)生溶質損傷。當冷凍速度過快時，細胞內水分來不及外滲，會形成較大冰晶,造成細胞膜及細胞器的破壞，產(chǎn)生細胞內冰晶損傷。2.冷凍保存溫度：液氮溫度(-196)是目前最佳冷凍保存溫度。應用-70-80條件冷凍保存細胞，短期內對細胞活性無明顯影響，但隨著凍存時間延長，細胞存活率明顯下降。 第33頁，共47頁，2022年，5月20日，6點8分，星期四4.冷凍保護劑（滲透性 非滲透性）： 滲透性常用甘油、DMSO 滲透到細胞內，降低細胞內外

18、未結冰溶液中電解質的濃度，從而保護細胞免受高濃度電解質的損傷；同時，細胞內水分也不會過分外滲，避免了細胞過分脫水皺縮。甘油和DMSO并不能防止細胞內結冰。在使用該類冷凍保護劑時，需要一定的時間進行預冷。目前，DMSO的應用比甘油更為廣泛。 第34頁，共47頁，2022年，5月20日，6點8分，星期四非滲透性冷凍保護劑不能滲透到細胞內，一般是些大分子物質。該類保護劑主要包括聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白及羥乙基淀粉等。大分子物質可以優(yōu)先同溶液中水分子相結合，降低溶液中自由水的含量，使冰點降低，減少冰晶的形成；使溶液中電解質濃度降低，從而減輕溶質損傷。第35頁，共47頁，

19、2022年，5月20日，6點8分，星期四二、使用逐級降溫法進行凍存1.主要材料(1)儀器設備：普通冰箱、-30低溫冰箱和-70-80超低溫冰箱、液氮凍存罐、離心機等。(2)凍存管：容量為2ml。(3)冷凍保護液：一般是以含20%小牛血清的細胞培養(yǎng)液與二甲基亞砜1份以9：1混合而成?，F(xiàn)配現(xiàn)用，或配制后放入普通冰箱冰盒內冷凍保存。使用前，于室溫下水浴融解。(4)待凍存細胞。第36頁，共47頁，2022年，5月20日，6點8分，星期四2.細胞處理過程(1)按常規(guī)方法消化處于對數(shù)生長期的細胞培養(yǎng)物,制備成單細胞懸液,計算細胞總數(shù)。(2)將細胞懸液以8001000rmin離心5min，棄上清液。(3)向

20、沉淀物中加入冷凍液。輕輕吹吸均勻，使細胞密度達11061107個/ml。(4)按每管11.5ml的量，分裝于凍存小管內。擰緊管蓋。(5)在凍存小管上做標記，包括細胞代號及凍存日期。第37頁，共47頁，2022年，5月20日，6點8分，星期四3.分級冷凍：（1）標準程序為-25以上時，下降-2-1 /min；-25以下時，下降-10-5/min；溫度達到-100 時，可迅速放入液氮（2）實際可采用普通冰箱冷藏層(48)，約40min；普通冰箱冷凍層(-10-20)，3060min；在-70-80下過夜；最后將凍存小管投入液氮保存。凍存的細胞存活率可達90%以上?？墒褂眉毎麅龃婧羞M行一次性冷凍。第

21、38頁，共47頁，2022年，5月20日，6點8分，星期四注意事項：在使用DMSO前，不需要對其進行高壓滅菌，因其本身就有滅菌作用。 在常溫下，DMSO對人體有毒，故在配制冷凍保護劑時最好帶手套。凍存管投入液氮時，動作要小心、輕巧，以避免液氮從液氮罐內濺出。 勿將凍存的細胞放置在0-60這一溫度范圍內過長時間，低溫損傷主要發(fā)生在這一溫度范圍內。第39頁，共47頁，2022年，5月20日，6點8分，星期四三、細胞復蘇1.主要材料(1)儀器設備：恒溫水浴箱、普通離心機。(2)培養(yǎng)用液：完全培養(yǎng)液（20%血清+基礎培養(yǎng)液）第40頁，共47頁，2022年，5月20日，6點8分，星期四2.復蘇過程(1)

22、將恒溫水浴箱的溫度調至3740。(2)從液氮中取出凍存小管，立即投入3740溫水中快速晃動，直至凍存液完全融解。要在12min內完成復溫。(3)將細胞凍存懸液移入離心管。 (4)將細胞懸液經(jīng)8001000 r/min離心5min。棄上清液。(5)給細胞沉淀物加入完全培養(yǎng)液，輕輕吹吸均勻。將細胞懸液移入培養(yǎng)瓶內，加足培養(yǎng)液進行培養(yǎng)。第41頁，共47頁，2022年，5月20日，6點8分，星期四注意事項：細胞凍存懸液一旦融解后，要盡快離心除去冷凍保護液，防止冷凍保護劑對細胞產(chǎn)生毒性。許多冷凍保護劑（如DMSO）在低溫下能保護細胞，但在常溫下卻對細胞有害，故在細胞復溫后應及時洗滌冷凍保護劑。實驗人員在復蘇細胞過程中，同樣應具有自我保護意識，避免被液氮凍傷。 在冷凍復蘇中遵循：慢凍速溶原