基因組序列詮釋強(qiáng)伯勤

1、關(guān)于基因組序列詮釋強(qiáng)伯勤第1頁(yè)，共71頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)19分，星期四問(wèn) 題基因組序列所包含的全部遺傳信息是什么？基因組作為一個(gè)整體如何行使其功能？用什么方法尋找基因，研究基因地功能呢？第2頁(yè)，共71頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)19分，星期四1. 尋找基因1.1 根據(jù)開(kāi)放讀框預(yù)測(cè)基因 起始密碼子 ATG第一個(gè)ATG的確定(依據(jù)Kozak規(guī)則); Kozak規(guī)則是基于已知數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果. 所謂Kozak規(guī)則，即第一個(gè)ATG側(cè)翼序列的堿基分布所滿(mǎn)足的統(tǒng)計(jì)規(guī)律.第3頁(yè)，共71頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)19分，星期四Kozak規(guī)則: 若將第一個(gè)ATG中的堿基A，T，G分別標(biāo)為1

2、，2，3位，則Kozak規(guī)則可描述如下：(1)第4位的偏好堿基為G；(2)ATG的5端約15bp范圍的側(cè)翼序列內(nèi)不含堿基T；(3)在-3，-6和-9位置，G是偏好堿基；(4)除-3，-6和-9位，在整個(gè)側(cè)翼序列區(qū)，C是偏好堿基。第4頁(yè)，共71頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)19分，星期四 信號(hào)肽分析軟件(SignalP http:/www.cbs.dtu.dk/services/signalP ) 把預(yù)測(cè)過(guò)程中證實(shí)含完整mRNA 5端的序列翻譯為蛋白序列; 然后用SignalP軟件對(duì)前50個(gè)氨基酸序列(從第一個(gè)ATG對(duì)應(yīng)的甲硫氨酸Met開(kāi)始)進(jìn)行評(píng)估，如果SignalP分析給出正面結(jié)果，則測(cè)試

3、序列有可能為信號(hào)肽; 信號(hào)肽分析第5頁(yè)，共71頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)19分，星期四 終止密碼子 終止密碼子: TAA，TAG，TGA GC% = 50% 終止密碼子每 64 bp出現(xiàn)一次； GC% 50% 終止密碼子每100200 bp 出現(xiàn)一次； 由于多數(shù)基因 ORF 均多于50個(gè)密碼子，因此最可能的選擇應(yīng)該是 ORF 不少于100 個(gè)密碼子。第6頁(yè)，共71頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)19分，星期四 3端的確認(rèn) 3端的確認(rèn)主要根據(jù)Poly(A)尾序列,若測(cè)試DNA片段不含Poly(A)序列，則根據(jù)加尾信號(hào)序列“AATAAA”和BLAST同源性比較結(jié)果共同判斷。第7頁(yè)，共71頁(yè)，

4、2022年，5月20日，8點(diǎn)19分，星期四 非編碼序列、內(nèi)含子高等真核生物ORF閱讀的復(fù)雜性：基因間存在大量的非編碼序列（人類(lèi)基因組中是70%）絕大多數(shù)基因含有非編碼的內(nèi)含子。 高等真核生物多數(shù)外顯子長(zhǎng)度少于100 個(gè)密碼子，有的不到50個(gè)密碼子甚至更少；不能根據(jù)ORF長(zhǎng)度判斷讀框的準(zhǔn)確性。第8頁(yè)，共71頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)19分，星期四編碼同一氨基酸的不同密碼子稱(chēng)為同義密碼，其差別僅在密碼子的第3位堿基不同。不同種屬間使用同義密碼的頻率有很大差異： 如人類(lèi)基因中， 丙氨酸（Ale）密碼子多為GCA,GCC或GCT,而GCG很少 蘇氨酸（Thr）密碼子多為ACA,ACC或ACT,而

5、ACG很少 密碼子偏愛(ài)性第9頁(yè)，共71頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)19分，星期四 密碼子偏愛(ài)性 高等植物207個(gè)基因單子葉植物53個(gè)，6個(gè)單子葉種群，18種氨基酸有16種氨基酸的密碼子搖擺堿基為G+C雙子葉植物154個(gè)，35個(gè)雙子葉種群，只有7種氨基酸的搖擺堿基是G+C，其余均為A+T密碼子偏倚 codon bias，原因不明。第10頁(yè)，共71頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)19分，星期四 外顯子內(nèi)含子邊界外顯子和內(nèi)含子的邊界有一些明顯的特征：如:內(nèi)含子的5端或稱(chēng)供體位（donor site）常見(jiàn)的順序?yàn)?5AGGTAAGT-3；3端又稱(chēng)受體位（acceptor site), 多為5PyP

6、yPyPyPyPyCAG-3(“Py”嘧啶核苷酸，T或C)；但是由于邊界序列常有例外，僅適用于一定范圍。第11頁(yè)，共71頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)19分，星期四上游控制序列 幾乎所有基因（或操縱子）上游都有調(diào)控序列，它們可與DNA結(jié)合蛋白作用，控制基因表達(dá)。 通過(guò)同源性比較來(lái)預(yù)測(cè)mRNA的5端，最常用的與轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)相關(guān)的數(shù)據(jù)庫(kù)是真核啟動(dòng)子數(shù)據(jù)庫(kù)(The TRADAT Project , Eukaryotic Promoter Database, EPD. http:/www.epd.unil.ch/ )。 另外個(gè)別生物基因組的特有組成也可作為判別依據(jù)，如脊椎動(dòng)物基因組許多基因的上游都有

7、CpG島。第12頁(yè)，共71頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)19分，星期四 內(nèi)含子和外顯子序列差異內(nèi)含子受選擇壓力小，突變多。由于堿基C 到A，內(nèi)含子A/T比例高內(nèi)含子A/T比例高，所以終止密碼子出現(xiàn)的頻率高。第13頁(yè)，共71頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)19分，星期四 軟件預(yù)測(cè) 采用NCBI的ORF預(yù)測(cè)軟件 ( ORF finder: /gorf/orfig.cgi )判斷ORF的可能范圍。第14頁(yè)，共71頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)19分，星期四基因注釋軟件Genscan 重于信號(hào)指令：起始密碼、終止密碼、剪接受體位和供體位序列等FgeneSH 重于內(nèi)容指令：密碼子使用偏好、內(nèi)含子外顯

8、子的差異等TWINSCAN和SGP2根據(jù)相似性和一致性第15頁(yè)，共71頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)19分，星期四基因注釋軟件缺點(diǎn)外顯子注釋的準(zhǔn)確率 25%第18頁(yè)，共71頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)19分，星期四同源性：homology起源于同一祖先但序列已經(jīng)發(fā)生變異的序列，分布在不同物種間的同源基因，只有是與非的區(qū)別。一致性：identity同源DNA序列的同一堿基位置上相同的堿基成員，或者蛋白質(zhì)中同一氨基酸位置相同的氨基酸成員的比例，用%表示。相似性：similarity 同源蛋白質(zhì)的氨基酸序列中一致性氨基酸和可取代氨基酸所占的比例。比較氨基酸和基因的同源性？第19頁(yè)，共71頁(yè)，2

9、022年，5月20日，8點(diǎn)19分，星期四分子雜交可確定DNA片段是否含有表達(dá)順序Northern blot：指將待測(cè)DNA樣品標(biāo)記后與RNA雜交，以判斷RNA中是否含有DNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。但在操作中存在一些問(wèn)題1.3 試驗(yàn)確認(rèn)基因第20頁(yè)，共71頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)19分，星期四1977年J.C.Alwin首創(chuàng)Northern blotting 第21頁(yè)，共71頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)19分，星期四問(wèn)題解決方案A 某一基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行可變剪接或該基因?yàn)槟骋欢嗷蚣易宓某蓡T時(shí)，會(huì)出現(xiàn)多個(gè)雜交帶設(shè)計(jì)其他實(shí)驗(yàn)區(qū)分第22頁(yè)，共71頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)19分，星期四第23

10、頁(yè)，共71頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)19分，星期四心肌特異性蛋白第24頁(yè)，共71頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)19分，星期四問(wèn)題解決方案B 基因的表達(dá)具有組織特異性及發(fā)育階段的差別，而選擇的RNA樣品中不一定含有該基因產(chǎn)物盡可能多地收集各種不同發(fā)育時(shí)期及不同組織器官的RNA第25頁(yè)，共71頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)19分，星期四問(wèn)題解決方案C 某些基因產(chǎn)物豐度極低或不易提取適當(dāng)提高RNA上樣量，或先以已知的DNA序列設(shè)計(jì)引物從mRNA中擴(kuò)增基因產(chǎn)物第26頁(yè)，共71頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)19分，星期四C 基因表達(dá)產(chǎn)物豐度的問(wèn)題擬Northern 雜交 根據(jù)已知的DNA順序

11、設(shè)計(jì)引物，從mRNA群體中擴(kuò)增基因產(chǎn)物，再以DNA為探針與之雜交。動(dòng)物園雜交 根據(jù)親緣關(guān)系相似的物種，其基因的編碼區(qū)相似性較高，而非編碼區(qū)的同源性很低的原理。第27頁(yè)，共71頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)19分，星期四第28頁(yè)，共71頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)19分，星期四DNA順序中基因位置的確定 cDNA測(cè)序受兩個(gè)方面的影響：一是相關(guān)cDNA在cDNA文庫(kù)中出現(xiàn)的頻率；二是cDNA的完整性第29頁(yè)，共71頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)19分，星期四如何獲取基因全長(zhǎng)cDNA序列？A cDNA 文庫(kù)構(gòu)建B RACE 技術(shù)第30頁(yè)，共71頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)19分，星期四干

12、擾cDNA篩選基因的因素：目標(biāo)cDNA所占比例很低分成亞群進(jìn)行篩選cDNA均一化 影響cDNA測(cè)序的因素與mRNA的反轉(zhuǎn)錄有關(guān)第31頁(yè)，共71頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)19分，星期四cDNA文庫(kù)構(gòu)建(CLONTECH)第32頁(yè)，共71頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)19分，星期四cDNA文庫(kù)構(gòu)建(CLONTECH)第33頁(yè)，共71頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)19分，星期四5RACE(CLONTECH)第34頁(yè)，共71頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)19分，星期四3RACE(CLONTECH)第35頁(yè)，共71頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)19分，星期四確定DNA順序中基因的位置A 通

13、過(guò)對(duì)全長(zhǎng)cDNA序列的測(cè)序、對(duì)比，以及與基因組DNA的比較，確定基因所在的區(qū)域；B 通過(guò)物種已建立遺傳圖和物理圖來(lái)確定基因的位置；第36頁(yè)，共71頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)19分，星期四利用計(jì)算機(jī)分析基因功能2、基因功能的預(yù)測(cè)2.1 同源性確定基因功能2.2 同源性分析在酵母基因組計(jì)劃中的應(yīng)用第37頁(yè)，共71頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)19分，星期四2.1 同源性確定基因功能種間同源基因或直系基因（orthologous gene）：指不同物種之間的同源基因，它們來(lái)自物種分化以前的共同祖先種內(nèi)同源基因或平行基因（paralogous gene） 同一物種內(nèi)的同源基因，它們常常是多基因

14、家族的不同成員第38頁(yè)，共71頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)19分，星期四同源基因一般不會(huì)有完全一致的核苷酸序列，因?yàn)椴煌幕蚧虿煌纳锒紩?huì)獨(dú)立地發(fā)生隨機(jī)突變，但它們有相似的序列，大部分未突變的核苷酸位置是相同的 同源性分析可以給出整個(gè)基因或其中某一區(qū)段功能的有關(guān)信息第39頁(yè)，共71頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)19分，星期四2.2 同源性分析在酵母基因組計(jì)劃中的應(yīng)用酵母基因組大約含有6000個(gè)基因30是通過(guò)傳統(tǒng)遺傳學(xué)分析得到的另外70是用同源性分析獲得第40頁(yè)，共71頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)19分，星期四3.1 基因失活在基因功能分析的作用3.2 基因的超表達(dá)用于功能檢測(cè)3、

15、實(shí)驗(yàn)確認(rèn)基因功能第41頁(yè)，共71頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)19分，星期四3.1.1 基因剔除(knock-out) 最簡(jiǎn)便的基因失活的方法. 主要原理: 在一段無(wú)關(guān)DNA 片段的兩側(cè)連接與代換基因兩側(cè)相同的順序，將這一構(gòu)建導(dǎo)入目的細(xì)胞，由于同源片段之間的重組，可使無(wú)關(guān)片段取代靶基因,整合到染色體中。為了便于篩選，用于取代的外源DNA中含有報(bào)告基因。3.1 基因失活在基因功能分析的作用第42頁(yè)，共71頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)19分，星期四tk 胸苷激酶標(biāo)記基因 gangcyclovirneor 新霉素抗性基因G418第43頁(yè)，共71頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)19分，星期四第4

16、4頁(yè)，共71頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)19分，星期四3.1.2反義RNA 反義RNA是由基因的負(fù)鏈編碼，可與正義RNA (sense RNA)或DNA 編碼順序結(jié)合，干擾mRNA 的轉(zhuǎn)錄，加工和轉(zhuǎn)運(yùn)，調(diào)控基因的表達(dá)。第45頁(yè)，共71頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)19分，星期四構(gòu)建反義RNA 表達(dá)載體: 將全目的基因或部分目的基因反向插入表達(dá)載體 轉(zhuǎn)化目標(biāo)生物 獲得轉(zhuǎn)基因個(gè)體或品系 分析轉(zhuǎn)基因植株在生理、生化、形態(tài)等方面的變異 判別目的基因的功能第46頁(yè)，共71頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)19分，星期四正義表達(dá)載體反義表達(dá)載體第47頁(yè)，共71頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)19分，星

17、期四反義RNA 作用機(jī)理： A 干擾翻譯的起始與延伸，可與翻譯起始順序及編碼序列結(jié)合形成雙鏈RNA，隨之被細(xì)胞降解。 B 與mRNA 的引導(dǎo)順序結(jié)合，阻止核糖體的附著，使翻譯無(wú)法啟動(dòng)。 C 反義RNA與mRNA形成雙鏈分子后，使RNA多聚酶脫離模板，轉(zhuǎn)錄終止。第48頁(yè)，共71頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)19分，星期四3.1.3 RNA干涉 RNAi是通過(guò)雙鏈RNA的介導(dǎo),特異性地降解相應(yīng)序列的mRNA,從而阻斷相應(yīng)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默機(jī)制.第49頁(yè)，共71頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)19分，星期四RNAi 作用機(jī)理A dsRNA核酸內(nèi)切酶Dicer被激活，它把dsRNA加工成

18、2125 個(gè)核苷酸長(zhǎng)的RNA鏈；B 這些小片段RNA(siRNA)作為另一個(gè)核糖核酸復(fù)合體RISC(RNA-induce silencing complex,RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體)的指引物，結(jié)合到RISC上，使之識(shí)別并降解mRNA，從而導(dǎo)致與雙鏈RNA同源的基因沉默；第50頁(yè)，共71頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)19分，星期四第51頁(yè)，共71頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)19分，星期四RNAi設(shè)計(jì)方法及應(yīng)用A Fraser 合成與開(kāi)放讀碼框相對(duì)應(yīng)的雙鏈RNA或利用細(xì)菌克隆表達(dá)這些雙鏈RNA微量注射和喂食干擾同源基因的表達(dá)B Chuang 等設(shè)計(jì)出嵌合體結(jié)構(gòu) 連接強(qiáng)啟動(dòng)子大量表達(dá)雙鏈mRNA

19、干擾同源基因的表達(dá)第52頁(yè)，共71頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)19分，星期四HbF基因的RNAi載體構(gòu)建第53頁(yè)，共71頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)19分，星期四RNAi技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)RNAi最根本的特點(diǎn)是特異性RNAi具有特殊的穿越能力，而且干擾作用會(huì)傳給后代；RNAi對(duì)一些低水平表達(dá)的基因的RNAi現(xiàn)象并不明顯，而且?guī)讉€(gè)有相同或相似序列的基因，RNAi也會(huì)同時(shí)作用與它們。第54頁(yè)，共71頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)19分，星期四3.2 基因超表達(dá)增加基因的拷貝數(shù)采用強(qiáng)啟動(dòng)子促使基因超表達(dá)第55頁(yè)，共71頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)19分，星期四構(gòu)建轉(zhuǎn)座子突變庫(kù)酵母雙雜交（ye

20、ast two-hybridization）3.3其他方法第56頁(yè)，共71頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)19分，星期四3.3.1 轉(zhuǎn)座子插入突變第57頁(yè)，共71頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)19分，星期四 上世紀(jì)三十年代，玉米遺傳學(xué)家 Barbara McClintock在研究中發(fā)現(xiàn)了玉米籽粒色斑不穩(wěn)定遺傳的現(xiàn)象，可能是一種可轉(zhuǎn)移的遺傳因子。第58頁(yè)，共71頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)19分，星期四1944：美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院士1945：美國(guó)遺傳學(xué)會(huì)主席1983：Nobel Prize ，35年后將轉(zhuǎn)位因子的重大發(fā)現(xiàn)歸功于她McClintock（1902-1992）第59頁(yè)，共71頁(yè)，2

21、022年，5月20日，8點(diǎn)19分，星期四 Ac和Ds這兩個(gè)因子都位于玉米的第九號(hào)染色體短臂，在色素基因C的附近。Ac因子全長(zhǎng)4.5kb，有5個(gè)外顯子，其產(chǎn)物是轉(zhuǎn)座酶。Ac因子兩端是長(zhǎng)11bp的反向重復(fù)序列(IR)； Ds因子長(zhǎng)0.4-4kb，它的中間(在轉(zhuǎn)座酶基因中)有許多種長(zhǎng)度不等的缺失, Ds的兩端也都有11bp的反向重復(fù)序列。第60頁(yè)，共71頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)19分，星期四 Ac-Ds轉(zhuǎn)座元件結(jié)構(gòu)示意圖。右邊示Ac及Ds元件的單鏈DNA末端反向重復(fù)配對(duì)所形成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)可能對(duì)轉(zhuǎn)座有意義第61頁(yè)，共71頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)19分，星期四玉米轉(zhuǎn)座因子對(duì)胚乳顏

22、色的影響 第62頁(yè)，共71頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)19分，星期四35S Ac轉(zhuǎn)座酶 NPTII IAAHAc TATA GUS NPTII IAAHDsE IAAHDsG I A GUS NPTII IAAH 吲哚乙酸水解酶，NAM（ 萘乙酰胺）敏感第63頁(yè)，共71頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)19分，星期四35S Ac轉(zhuǎn)座酶 NPTII IAAHAc TATA GUS NPTII IAAHDsE IAAHDsG I A GUS NPTII 增強(qiáng)子捕獲TATA GUS NPTII E E E 外顯子I A GUS NPTII 內(nèi)含子 基因捕獲外顯子I A GUS NPTII 外顯子外顯子突變體庫(kù)構(gòu)建載體策略第64頁(yè)，共71頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)19分，星期四A、插入突變隱性突變體庫(kù)構(gòu)建存在問(wèn)題第65頁(yè)，共71頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)19分，星期四B、冗余基因的存在第66頁(yè)，共71頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)