基因操作主要技術原理

1、關于基因操作的主要技術原理第1頁，共112頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四第一節(jié) 核酸的分離與純化核酸包括DNA、RNA兩種分子，在細胞中都是以與蛋白質結合的方式存在的 真核生物95%DNA存在于細胞核內，5%在細胞器 75%的RNA存在于細胞質，10%在核內，15%在細胞器 rRNA（8085%），tRNA及核內小分子RNA（1015%），mRNA（15%）第2頁，共112頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四一、核酸分離提取的原則1. 保證核酸一級結構的完整性 2. 排除其它分子的污染 核酸樣品中不應存在對酶有抑制作用的有機溶劑和過高濃度的金屬離子將其它生物大分子如蛋

2、白質、多糖和脂類分子的污染降到最低 排除其它核酸分子的污染 第3頁，共112頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四核酸提取的基本要求 盡量簡化操作步驟，縮短提取過程，以減少各種有害因素對核酸的破壞 減少化學因素對核酸的降解（過酸、過堿） 減少物理因素對核酸的降解（機械剪切力、高溫） 防止核酸的生物降解 第4頁，共112頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四提取核酸的一般程序: 破碎細胞 去除與核酸結合的蛋白質及多糖等 去除其它核酸分子 沉淀核酸，去除鹽類、有機溶劑等雜質 純化核酸 核酸的質量評估（電泳、D260/OD280，酶切） 第5頁，共112頁，2022年，5月20日，8

3、點17分，星期四二、質粒載體的分離與純化 關鍵：如何使質粒DNA與宿主染色體DNA分開 依據(jù)：質粒DNA比染色體DNA小得多，在DNA提取過程中，染色體DNA斷裂成片段(線狀)，而質粒DNA仍保持超螺旋構型 第6頁，共112頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四變性法提取質粒DNA的原理 在變性條件（堿性或高溫)下，線狀染色體DNA變性成為單鏈而完全分開，而cccDNA雖然互補鏈之間的氫鍵斷裂，但雙螺旋主鏈骨架仍彼此纏繞在一起。 當變性條件恢復時，質粒DNA迅速復性恢復天然構型，染色體DNA難以復性，交聯(lián)形成不溶性網(wǎng)狀結構，與變性的蛋白質和RNA纏繞在一起，通過離心沉淀下來，而質粒DN

4、A存在于上清液中。第7頁，共112頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四堿變性法提取質粒DNA的步驟收集細胞沉淀加入溶液I (50mM 葡萄糖, 25mMTris-HCl, 10mM EDTA, 45mg/mL 溶菌酶）加入溶液II (0.2M NaOH, 1%SDS)加入溶液III (3M NaAc pH4.8)離心除去沉淀，得含質粒DNA的上清液苯酚抽提去除蛋白質乙醇沉淀收集質粒DNA在強堿性環(huán)境中暴露時間過長，cccDNA可發(fā)生不可逆變性第8頁，共112頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四關鍵：盡可能地保持其高分子量細菌 33004200kb 酵母 15,000 kb果

5、蠅 1.65x105 kb 人 3x106 kb植物 2x1051x108 kb 天花病毒 288 kb痘病毒 196 kb三、染色體DNA的分離純化第9頁，共112頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四CsCl密度梯度離心原理：CsCl介質密度為1.7g/cm3，超速離心后形成11.9052 g/cm3的密度梯度EB（溴化乙錠）可嵌入DNA兩條鏈的堿基對之間，并因此導致雙螺旋結構發(fā)生解旋反應第10頁，共112頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四線性或開環(huán)DNA分子，因其具有游離的末端而易于解旋，故可結合相當大量的EB直到達到飽和具有ccc結構的質粒DNA由于負超螺旋的存在阻

6、止DNA解鏈，因而只能結合很少的EBDNA分子中結合EB越多，其浮力密度越小，因而形成不同的浮力密度得以區(qū)分 第11頁，共112頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四質粒質粒DNA的分離純化氯化銫密度梯度離心法： 用含有EDTA的緩沖液懸浮菌體 加溶菌酶裂解細菌細胞壁 加CsCl和溴乙錠超速離心過夜在紫外燈下吸取cccDNA稀釋沉淀cccDNAproteinsocDNAL-DNAcccDNARNAs第12頁，共112頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四 關鍵： 防止內外源RNase的作用 四、RNA的分離與純化第13頁，共112頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四R

7、Nase的特點：抗酸抗堿,具很廣pH作用范圍抗高溫嚴寒(065均具活性，100也不能使之完全失活）抗變性劑（變性劑只能使之暫時失活，去除變性劑后又可恢復活性）酶活性不需要輔助因子存在范圍廣 第14頁，共112頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四解決辦法：外源RNase：高溫（干熱180，4hrs），焦碳酸二乙酯(DEPC)處理所有溶液（TrisHCl除外）和器皿，操作者帶手套 內源RNase：高溫抽提，強蛋白質變性劑，RNase抑制劑，蛋白酶K等 第15頁，共112頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四五、核酸的濃縮與貯存 沉淀是核酸濃縮最常用的方法，其最大的優(yōu)點是通過核酸沉

8、淀來改變核酸的溶解緩沖液及重新調節(jié)核酸在溶液中的濃度，可去除溶液中某些可溶性的鹽離子與雜質，在一定程度上純化核酸沉淀DNA的最常用方法是在DNA溶液中加入1/10體積的3M NaAc（或KAc）和2倍體積的乙醇，放置1530min，離心收集DNA沉淀，倒去上清液，加入70%的乙醇洗滌沉淀，去除殘余的鹽，再離心收集沉淀。第16頁，共112頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四 貯存DNA：溶于TE中，放置于4、-20、-70RNA： 溶于0.3M NaAc(pH5.2)或ddH2O中，-70 長期保存可以沉淀形式貯存于乙醇中，-20 第17頁，共112頁，2022年，5月20日，8點17

9、分，星期四六、核酸的質量評估方法 核酸濃度的測定 ds-DNA：1 OD26050g/ml ss-DNA&RNA：1 OD26040g/ml 單鏈寡核苷酸：1 OD26020g/ml 第18頁，共112頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四核酸純度的測定 DNA：A260/A280=1.8 若1.8，說明RNA未除盡 1.6，蛋白質或酚未除盡RNA：A260/A280=2.0 2.0，蛋白質或酚未除盡 第19頁，共112頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四第二節(jié) 凝膠電泳一、核酸電泳的基本原理 核酸分子中的磷酸基團帶負電荷，在電場中將向正極移動，通過凝膠的分子篩作用可以將不同

10、大小和構型的核酸分子分離，分子量小的DNA，具有較緊密的構型，在凝膠中移動快；反之，分子量大的DNA移動慢 第20頁，共112頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四瓊脂糖及聚丙烯酰胺凝膠分辨DNA片段的能力 凝膠類型及濃度 分辨DNA片段的大小范圍（bp） 0.3%瓊脂糖 500001000 0.7%瓊脂糖 200001000 1.4%瓊脂糖 6000 300 4.0%聚丙烯酰胺 1000 100 10.0%聚丙烯酰胺 500 25 20.0%聚丙烯酰胺 50 1 DNARNADNA蛋白質第21頁，共112頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四核酸電泳的染色劑和指示劑 指示劑

11、在電泳過程中，常使用一種有顏色的標記物以指示樣品的遷移過程 瓊脂糖凝膠濃度 0.6% 1% 1.4% 2%溴酚藍 1kb 0.6kb 0.2kb 0.15kb二甲苯青藍 2kb 1.6kb 第22頁，共112頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四染色劑 溴化乙錠（EB）：嵌入核酸雙鏈的配對堿基之間，在紫外光下呈現(xiàn)橙色熒光 由于單鏈DNA、RNA中常存在自身配對的雙鏈區(qū)，也可嵌入EB分子 EB是一種誘變劑，見光易分解第23頁，共112頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四在常規(guī)電泳中，DNA移動距離與分子量有關：分子量小的移動快，反之則慢大于20kb的DNA大分子，其移動距離與分

12、子量無關。因為這些DNA分子要通過膠孔時必須發(fā)生變形，并沿分子長軸運動經(jīng)過膠孔，它們都以相同速度前進，分辨率也就消失了。 三、脈沖場凝膠電泳第24頁，共112頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四 在脈沖場凝膠電泳中，加在凝膠上至少有兩個電場方向，使得DNA分子要不斷地調整泳動方向，不同分子量大小的DNA分子用于改變泳動方向的時間不同，則可以得到分離脈沖場凝膠電泳Pulsed-Field Gel Electrophoresis，PFGE 第25頁，共112頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四 PFGE工作原理DNA松弛時間：大分子DNA改變形狀和重新定向所需的時間。這個時間與

13、DNA分子量呈正相關（Tr） DNA移動時間：DNA分子向前移動的時間（Tm） 電場脈沖時間：其電場方向所持續(xù)的時間（Tp） 第26頁，共112頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四分子量大的DNA分子所需的松弛時間長，分子量小的則短。由于脈沖時間是一個人為的固定值，那么用于向前移動的時間則隨分子量大小而變化。分子量大的用于向前運動的時間少，移動距離就短，分子量小的用于向前運動的時間多，移動距離就長。第27頁，共112頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四Tp小 = Tm小+ Tr小 Tp大 = Tm大+ Tr大 Tp小 = Tp大 Tr小 Tm大 ，所以， S小 S大 顯然，

14、要使一個DNA樣品中不同大小的DNA分子分離，脈沖時間應選在最大DNA分子所需的上限。 第28頁，共112頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四第三節(jié) DNA序列分析 1. 雙脫氧核苷酸鏈終止法 Dideoxy-termination sequencing Sanger法第29頁，共112頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四第30頁，共112頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四基本原理： 雙脫氧（2，3）-核苷酸可以象2-脫氧核苷酸那樣直接摻入新合成的DNA鏈中，但因3 端不具OH基，DNA鏈合成至此中斷。由于雙脫氧核苷酸在每個DNA分子中摻入的位置不同，故可根據(jù)不

15、同長度的DNA片段測定出核苷酸序列第31頁，共112頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四過程：制備ss-DNA與引物退火分為4個反應系統(tǒng)每個系統(tǒng)中加入dNTP（其中dATP常帶同位素標記）和一種雙脫氧核苷酸DNA聚合酶定序反應反應產(chǎn)物變性后電泳凝膠干燥放射自顯影 第32頁，共112頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四DNA Sequencing ReactionsThe DNA sequencing run is similar to the PCR run.The run mix includes the template DNA, Taq polymerase, dNT

16、Ps, ddNTPs, and a primer: a small piece of single-stranded DNA 20-30 nt long that hybridizes to one strand of the template DNA.The run is intitiated by heating until the two strands of DNA separate, then the primers anneals to the complementary template strand, and DNA polymerase elongates the prime

17、r.第33頁，共112頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四 4 different DNA synthesis reactions are run begin synthesis from specific priming point add components for DNA synthesis + specific ddNTP for each of the four reactionse.g. ddATPNo 3OH.第34頁，共112頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四ddCTPACCCTTGG第35頁，共112頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四Met

18、hod from Saenger Manual sequencing uses radiolabeled dATP (35-S or 33-P) to label the DNA. The sample is then split into four tubes each with an individual ddNTP present. The samples are then subjected to acrylamide gel electrophoresis followed by autoradiography.第36頁，共112頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四DNA全

19、自動測序第37頁，共112頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四Putting It All TogetherUsing gel electrophoresis to separate each DNA fragment that differs by a single nucleotide will band each fluorescently tagged terminating ddNTP producing a sequencing read.The gel is read from the bottom up, from 5 to 3, from smallest to l

20、argest DNA fragment.第38頁，共112頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四 屏幕顯示的膠圖第39頁，共112頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四Raw Automated Sequencing DataA 5 lane example of raw automated sequencing data.Green:ddATPRed:ddTTPYellow: ddGTPBlue:ddCTP第40頁，共112頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四Sanger：熒光檢測第41頁，共112頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四 377測序儀人類基因

21、組計劃測序的主力機型測序的主要設備第42頁，共112頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四上樣走電泳編寫樣品清單第43頁，共112頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四全自動的測序儀器：MegaBace第44頁，共112頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四 華大基因研究中心(北京) 承擔了人類3號染色體短臂上的約3000萬對堿基的測序任務，使中國成為繼美、英、日、德、法之后第六個加入國際測序俱樂部的國家。中心已建成了基因組學、蛋白質組學、生物信息學研究及產(chǎn)業(yè)化平臺，擁有ABI 377-96 平板測序儀11臺，MegaBACE1000 毛細管測序儀70臺 。 第45頁，

22、共112頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四TADA!2001 The HGP consortium publishes its working draft in Nature (15 February), and Celera publishes its draft in Science (16 February). 第46頁，共112頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四2. Maxam-Gilbert化學法 原理：DNA鏈上的不同堿基可以和堿基修飾劑發(fā)生反應，然后發(fā)生12個堿基的脫落或取代，最后發(fā)生鏈斷裂，不同位置斷裂的DNA分子經(jīng)凝膠電泳就可確定其核苷酸序列 第47頁

23、，共112頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四4種反應體系中，化學試劑特異斷裂DNA機制G反應：硫酸二甲脂使鳥嘌呤N7甲基化AG反應：甲酸使嘌呤環(huán)上的氮質子化導致糖苷鍵被削弱，使嘌呤環(huán)被吡啶取代C+T反應：肼能裂解嘧啶環(huán)，進而導致其脫落C反應：在一定濃度的NaCl條件下，肼只對胞嘧啶起作用第48頁，共112頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四第49頁，共112頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四第50頁，共112頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四第51頁，共112頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四化學法測序的一大優(yōu)點是不需要模板，引物和DN

24、A聚合酶。待測DNA鏈的檢測用32P末端標記 第52頁，共112頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四作 業(yè) A solution contains double-stranded DNA fragments of size 3 kb,6 kb, 9 kb, and 12 kb. They are separated in an electrophoresis gel. In the diagram of the gel at the right, match the fragment sizes with the correct bands.第53頁，共112頁，2022年，5月20

25、日，8點17分，星期四 A cloned fragment of DNA was sequenced by using the dideoxy method. A part of the autoradiogram of the sequencing gel is represented hereDeduce the nucleotide sequence of the DNA nucleotide chain synthesized from the primer. Label the 5 and 3 endsDeduce the nucleotide sequence of the DNA

26、 nucleotide chain used as the template strand. Label the 5 and 3 endsWrite the nucleotide sequence of the DNA double helix (label the 5 and 3 ends)第54頁，共112頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四第四節(jié) 分子雜交技術第55頁，共112頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四核酸雜交Southern 印跡雜交 （Southern blotting ）Northern 印跡雜交（Northern blotting ）Western

27、印跡雜交（Western blotting ）第56頁，共112頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四 Southern雜交 Southern雜交是指以Southern名字命名的DNA轉移雜交技術，用于特定DNA序列的檢測，包括基因組特定DNA序列的定位，相關片段的同源性測定、從cDNA庫、基因組文庫中篩選目的基因等。用一種或多種限制性內切酶對基因組DNA加以切割，通過瓊脂糖凝膠電泳分離酶切片段，隨后，使DNA在原位變性，并從凝膠轉移至固相膜，用已知核苷酸片段加以標記作為探針，通過分子雜交來檢測待測樣品中是否存在互補的核酸序列。該技術已成為分子生物學中一類重要的檢測手段。第57頁，共1

28、12頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四Southern 印跡雜交的用途確定在克隆片段中基因編碼區(qū)的大小和位置確定克隆片段在基因組中的拷貝數(shù)第58頁，共112頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四Southern blotting第59頁，共112頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四Southern blotting第60頁，共112頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四第61頁，共112頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四第62頁，共112頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四Northern Blotting相對Southern blo

29、tting命名的，與Southern blotting不同的是，它檢測的對象是RNA分子。 第63頁，共112頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四第64頁，共112頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四第65頁，共112頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四Western Blotting雜交的對象是蛋白質，先將蛋白質從SDS中轉移到一固相支持物上，通過與附著于固相支持物上的靶蛋白所呈現(xiàn)的抗原抗體特異反應進行檢測 主要用于基因的表達產(chǎn)物蛋白質的檢測第66頁，共112頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四第67頁，共112頁，2022年，5月20日，8點17分，

30、星期四第68頁，共112頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四 第五節(jié) PCR技術第69頁，共112頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四一、PCR技術的基本原理 Polymerase chain reaction, PCR 聚合酶鏈式反應 A method for amplifying specific DNA segments that exploits certain features of DNA replication.第70頁，共112頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四一個DNA經(jīng)n次擴增后, 一個DNA分子可變?yōu)?n 理論上經(jīng)過30次循環(huán)，靶DNA得到

31、109倍的擴增，實際是1067倍的擴增DNA擴增需要對待擴增的DNA序列有所了解，至少要對其兩側的核苷酸序列為已知，以便合成寡核苷酸引物 第71頁，共112頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四二、PCR反應的各種組份及作用 第72頁，共112頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四一個標準的PCR反應體系（50100 l） 50 mmol/L KCl 10 mmol/L Tris-HCl（pH=8.4） 1.5 mmol/L MgCl2 100 g/ml 明膠或牛血清白蛋白（BSA） 2個引物，各0.25 mol/L dNTP=dATP+dCTP+dGTP+dTTP） 各200

32、mol/L 模板DNA（人基因組DNA） 0.11g Taq DNA聚合酶 2 U第73頁，共112頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四Denaturation 94 , 0.5minPrimer annealing 55 , 1.5mionExtension 72 , 1min 30 cycles 變性（模板）退火（引物與模板）延伸（新合成DNA鏈）第74頁，共112頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四1. 模板DNA用于PCR擴增的模板DNA通常是從細胞中提取的染色體DNA，它們并不需要高度純化。待擴增的靶DNA的長度在3kb以下是PCR的有效擴增范圍，采用經(jīng)改造的Ta

33、q DNA聚合酶可擴增出40 kb的DNA 片段。 第75頁，共112頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四2. 引物PCR引物是與待擴增的目的DNA兩端序列互補的人工合成的寡核苷酸片段引物的長度通常為1730個核苷酸 引物太短，可能同非靶DNA雜交，得出非預期的擴增產(chǎn)物； 引物太長，引物與模板的結合效率降低，影響擴增效率。 第76頁，共112頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四如8nt的引物，平均每48=65536 bp就會有一個結合位點，在全長為3109 bp的人類基因組中，大約有43000個可能的結合位點，不能得到單一的特異性擴增產(chǎn)物。如為17nt的引物，出現(xiàn)幾率為41

34、7=17,179,869,184 bp，長度超過人類基因組長度的5倍，故在人類基因組中只可能有一個結合位點。 但引物不是越長越好，過長的引物同模板DNA的雜交效率反而下降，從而降低PCR反應的效率。 第77頁，共112頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四簡并引物 是一類由多種寡核苷酸組成的混合物，彼此之間只有一個或數(shù)個核苷酸的差異。如根據(jù)氨基酸序列推測出的核苷酸序列。 第78頁，共112頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四引物與復性溫度 引物與模板結合的特異性與復性溫度有密切關系 當復性溫度偏低時，引物與模板配對出現(xiàn)錯配堿基，導致一些不需要的DNA片段被擴增 復性溫度過高，

35、引物與模板不能配對復性溫度常與引物的長度和堿基組成有直接關系，引物越長或GC含量較高，退火的溫度可以高些，反之則低些 Tm=4(GC)2(AT) 12 below第79頁，共112頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四引物設計的一般原則: Correspond with the sequences flanking the target region on the template molecule. 第80頁，共112頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四引物的長度常為1730GC含量為40%60%Tm值高于55 兩條引物間配對堿基數(shù)小于5個引物自身配對(特別是在引物的3端)

36、形成的莖環(huán)結構, 莖的堿基配對數(shù)不大于3 通常采用計算機輔助設計第81頁，共112頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四3. dNTP 濃度為20200mol/L，4種dNTP以等摩爾濃度配制 濃度過高，加快反應速度，但可增加堿基的錯誤摻入率和成本 濃度過低，反應速度下降，提高實驗的精確性 第82頁，共112頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四4. Taq DNA聚合酶 基本特點: Taq DNA聚合酶是從一種極度嗜熱水生棲熱菌YT-1中分離純化而得具有DNA聚合酶活性、53外切酶活性、逆轉錄酶活性最適反應溫度為80最適pH8.0和最佳反緩沖液TrisHCl 最佳二價陽離子M

37、g2+ （10 mM）具良好的熱穩(wěn)定性：在90下連續(xù)反應30分鐘仍有70%的酶活 第83頁，共112頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四 擴增產(chǎn)物的可靠性:評估DNA聚合酶的一個重要指標是它復制DNA的可靠性，即摻入錯誤堿基的頻率天然復制的DNA分子中錯誤摻入率為10-9在體外實驗中，Klenow片段的錯誤摻入率為10-4，Taq DNA聚合酶的錯誤摻入率為510-3 ，而T4聚合酶的錯誤摻入率為10-7在克隆基因時，應采用高保真的Taq DNA聚合酶（Pfu）（3-5 exonuclease) 第84頁，共112頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四5. PCR反應的平臺期

38、 反應底物和產(chǎn)物在DNA擴增中不斷發(fā)生變化，最終將會導致聚合反應進入平臺期，出現(xiàn)平臺期的原因可能有：后期循環(huán)酶濃度或聚合時間不足；引物耗盡；dNTP耗盡；產(chǎn)物濃度過高，以致ds-DNA解鏈后又迅速退火，不能與引物結合。第85頁，共112頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四三、PCR產(chǎn)物的鑒定Gel electrophoresis of PCR productsCloning of PCR productsSequencing of PCR products第86頁，共112頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四Cloning PCR productsTaq DNA polym

39、erase tends to add an additional nucleotide, usually A, to the end of each strand it synthesizes. 第87頁，共112頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四Design primers that contain restriction sites第88頁，共112頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四第六節(jié) DNA芯片技術第89頁，共112頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四DNA芯片或微陣列技術(DNA chip or microarray)DNA芯片（或基因芯片）是將許

40、多特定的DNA寡核苷酸或DNA片段（稱為探針）固定在芯片的每個預先設置的區(qū)域內，將待測樣本標記后同芯片進行雜交分析，利用堿基互補配對原理進行雜交， 通過檢測雜交信號并進行計算機分析，從而檢測對應片段是否存在、存在量的多少，以及用于基因的功能研究和基因組研究、疾病的臨床診斷和檢測等眾多方面第90頁，共112頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四基因芯片第91頁，共112頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四基因芯片是基因功能研究領域的一次革命 與其他的基因檢測技術相比，基因芯片技術最大的特征在于能同時定量或定性地檢測成千上萬的基因信息基因芯片技術具有微型化、自動化和網(wǎng)絡化等特點，

41、是典型的多學科高技術交叉的結晶第92頁，共112頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四1991年世界第一塊原位合成寡核苷酸芯片在美國Affymetrix誕生1995年世界第一塊cDNA芯片在斯坦福大學實驗室誕生 - Science. 1995,270: 467-470基因芯片的歷史80年代末期科學家提出雜交法測序的思想，也就是寡核苷酸芯片的基本原理第93頁，共112頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四基因芯片技術流程 制備方法及點樣儀器探針的制備：標記方法雜交：雜交液、雜交溫度、 洗滌條件的選擇 掃描儀:激光 CCD分析軟件的開發(fā)基因芯片的制備雜交檢測數(shù)據(jù)分析第94頁，共112頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四 基因芯片實驗原理一、基因芯片原理及制備方法原位合成：寡核苷酸芯片直接點樣：寡核苷酸芯片和cDNA芯片第95頁，共112頁，2022年，5月20日，8點17分，星期四1. 原位合成法 在固相介質表面特定區(qū)域合成已知序列的寡核苷酸的一類技術的總稱采用光導化學合成和照相平板印刷技術合成寡核苷酸芯片第96頁，共112頁，2022年，5月2