基因工程基本操作步驟

1、關(guān)于基因工程的基本操作步驟第1頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)56分，星期四1、基因工程包括哪些步驟？3、基因工程中的核心環(huán)節(jié)是哪一步？4、基因表達(dá)載體導(dǎo)入到受體細(xì)胞有哪些方法？5、目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞就會(huì)成功表達(dá)嗎？ 如何檢測(cè)和鑒定？2、什么是目的基因？獲取的方法有哪些方法？ 思考討論問(wèn)題：第2頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)56分，星期四第3頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)56分，星期四基因工程的基本操作程序一、目的基因的獲取二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞四、目的基因的檢測(cè)與鑒定第4頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)56分，星期四 主

2、要是指編碼蛋白質(zhì)的基因(一）目的基因 目前被廣泛提取使用的目的基因有：蘇云金桿菌抗蟲(chóng)基因、植物抗病基因（抗病毒、抗細(xì)菌)、人胰島素基因等。一、目的基因的獲取第5頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)56分，星期四（二）獲取目的基因的方法1、從基因文庫(kù)中直接獲取2、PCR技術(shù)擴(kuò)增3、化學(xué)方法直接人工合成第6頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)56分，星期四1、從基因文庫(kù)中直接獲?。?）基因文庫(kù)的概念部分基因文庫(kù)： 基因組DNA文庫(kù)： 將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導(dǎo)入到受體菌的群體中，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫(kù)含有一種生物的全部基因只包含了一種生物的部

3、分基因，如:cDNA文庫(kù)第7頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)56分，星期四（2）基因文庫(kù)的建立方法提取某種生物的全部DNA用適當(dāng)?shù)南拗泼该盖幸欢ù笮〉腄NA片段將DNA片段與運(yùn)載體連接導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存基因組文庫(kù)方法一：直接分離法第8頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)56分，星期四某種生物的單鏈mRNA單鏈互補(bǔ)DNA雙鏈cDNA片段導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存與運(yùn)載體連接cDNA文庫(kù)反（逆）轉(zhuǎn)錄酶DNA聚合酶方法二：反轉(zhuǎn)錄法-cDNA的合成流程圖解第9頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)56分，星期四PCR技術(shù)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR擴(kuò)增儀DNA半保留復(fù)制的基本原理一段已知目的基因的核苷

4、酸序列四種脫氧核苷酸一對(duì)引物熱穩(wěn)定DNA聚合酶(Taq酶）模板DNA2、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因原理：前提：條件：第10頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)56分，星期四利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因第11頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)56分，星期四53GG TC35 AGCC53引物GG高溫變性低溫退火中溫延伸1.目的基因DNA受熱變性，解鏈；53 AG 引物2.引物與單鏈互補(bǔ)結(jié)合；3.合成鏈在DNA聚合酶作用下進(jìn)行延伸。第12頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)56分，星期四蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列目的基因推測(cè)推測(cè)化學(xué)合成3、人工合成

5、第13頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)56分，星期四 核心二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建功能：使目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞并有效表達(dá)，而且要能穩(wěn)定存在且遺傳給后代。第14頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)56分，星期四基因表達(dá)載體的構(gòu)建 1）用一定的限制酶切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個(gè)切口，露出黏性末端。 2）用同一種限制酶切斷目的基因，使其產(chǎn)生相同的黏性末端。 3）將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的切口處，再加入適量DNA連接酶，形成了一個(gè)重組DNA分子（重組質(zhì)粒） 目的基因與運(yùn)載體的結(jié)合過(guò)程，實(shí)際上是不同來(lái)源的基因重組的過(guò)程。第15頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)56分，星期四編碼區(qū)非編

6、碼區(qū)非編碼區(qū)啟動(dòng)子 啟動(dòng)子：位于基因首端一段能與RNA聚合酶結(jié)合并能起始mRNA合成的序列。沒(méi)有啟動(dòng)子，基因就不能轉(zhuǎn)錄。 RNA聚合酶:能夠識(shí)別啟動(dòng)子上的結(jié)合位點(diǎn)并與其結(jié)合的一種蛋白質(zhì). 終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，它能阻礙RNA聚合酶的移動(dòng)，并使其從DNA模板鏈上脫離下來(lái)，使轉(zhuǎn)錄終止。終止子第16頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)56分，星期四編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)啟動(dòng)子終止子A G G T C A C G T C GT C C A G T G C A G CRNA聚合酶A G G U C A C G U C G第17頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)56分

7、，星期四基因表達(dá)載體的組成：b、目的基因a、啟動(dòng)子c、終止子d、標(biāo)記基因e、復(fù)制原點(diǎn)第18頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)56分，星期四1、下列屬于獲取目的基因的方法的是 利用mRNA反轉(zhuǎn)錄形成 從基因組文庫(kù)中提取 從受體細(xì)胞中提取 利用PCR技術(shù) 利用DNA轉(zhuǎn)錄 人工合成 A. B. C. D.小試牛刀第19頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)56分，星期四2、1997年，科學(xué)家將動(dòng)物體內(nèi)的能夠合成胰島素的基因與大腸桿菌的DNA分子重組，并且在大腸桿菌中表達(dá)成功。請(qǐng)據(jù)右下圖回答問(wèn)題。(1)此圖表示的是采取_合成基因的方法獲取_基因的過(guò)程。(2) 圖中DNA是以為_(kāi) _ 模板，

8、形成單鏈DNA，在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得了所需要的目的基因。人工 目的 控制胰島素合成的信使RNA 小試牛刀第20頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)56分，星期四(3) 圖中代表 ，它往往含 基因，以便對(duì)目的基因的檢測(cè)。重組DNA分子 標(biāo)記 第21頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)56分，星期四常用的受體細(xì)胞： 有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌、酵母菌和動(dòng)植物細(xì)胞等。將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的原理借鑒細(xì)菌或病毒侵染細(xì)胞的途徑。三、目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞第22頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)56分，星期四將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法1、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法2、基因槍法3

9、、花粉管通道法第23頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)56分，星期四土壤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法示意圖第24頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)56分，星期四將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞的方法顯微注射法第25頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)56分，星期四將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞方法宿主細(xì)胞（大腸桿菌）感受態(tài)細(xì)胞（大腸桿菌）Ca2+第26頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)56分，星期四四、目的基因的檢測(cè)與鑒定首先：其次：最后：還要：要檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物的DNA上是否插入目的基因DNA分子雜交技術(shù) 分子探針檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA檢測(cè)目的基因是否翻譯出蛋白質(zhì)個(gè)體生物學(xué)水平的鑒定第2

10、7頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)56分，星期四 不能，受體細(xì)胞必須表現(xiàn)出特定的性狀，才能說(shuō)明目的基因完成了表達(dá)。 受體細(xì)胞攝入DNA分子后就說(shuō)明目的基因完成了表達(dá)嗎？若不能表達(dá)，要對(duì)抗蟲(chóng)基因再進(jìn)行修飾。第28頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)56分，星期四多細(xì)胞生物的檢測(cè)，將每個(gè)受體細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)并誘導(dǎo)發(fā)育成完整個(gè)體，檢測(cè)這些個(gè)體是否攝入目的基因，攝入的基因是否表達(dá)（是否表現(xiàn)出相應(yīng)的性狀）。淘汰無(wú)變化的個(gè)體，保留有相應(yīng)變化的個(gè)體進(jìn)一步培養(yǎng)、研究。例：用棉鈴飼喂棉鈴蟲(chóng)，如蟲(chóng)吃后不出現(xiàn)中毒癥狀，說(shuō)明未攝入目的基因或攝入目的基因未表達(dá)。如蟲(chóng)吃后中毒死亡，則說(shuō)明攝入了抗蟲(chóng)基因并得到表達(dá)。第29頁(yè)，共31頁(yè)，2022年，5月20日，5點(diǎn)56分，星期四3（2010江蘇高考，27題，8分）下