原核表達(dá)調(diào)控與色氨酸操縱子

1、轉(zhuǎn)錄：在DNA指導(dǎo)的RNA聚合酶催化下，以DNA鏈的一條鏈為模板，按照堿基配對(duì)原則合成RNA鏈的過程。不對(duì)稱轉(zhuǎn)錄：在DNA雙鏈分子中，轉(zhuǎn)錄通常只在DNA的一條鏈上進(jìn)行，另一條鏈則不能轉(zhuǎn)錄，但可能對(duì)轉(zhuǎn)錄起調(diào)節(jié)作用，這種轉(zhuǎn)錄方式稱不對(duì)稱轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄單位：就是從啟動(dòng)子到終止子的一段DNA序列。第一節(jié) 轉(zhuǎn)錄概述第一頁，共五十一頁。一、基因的編碼鏈和有意義鏈 模板鏈：用于轉(zhuǎn)錄RNA的鏈稱為模板鏈，或負(fù)（）鏈，又稱無義鏈。編碼鏈：與模板鏈互補(bǔ)的DNA鏈稱為編碼鏈，或正（）鏈，又稱有義鏈。第二頁，共五十一頁。二、轉(zhuǎn)錄的基本要點(diǎn) 底物：NTP； 模板：反義鏈；方向：53 ；酶：RNA pol ；產(chǎn)物：RNA單鏈

2、第三頁，共五十一頁。轉(zhuǎn)錄和復(fù)制：都是遺傳信息的傳遞第四頁，共五十一頁。三、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)位點(diǎn)核苷酸為1。上游序列upstream ：轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)的前面的序列，用負(fù)數(shù)碼（）表示，起點(diǎn)前一個(gè)核苷酸為1。下游序列downstream： 轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)的后面的序列，用正數(shù)碼（）表示。沒有編號(hào)為的堿基。第五頁，共五十一頁。第六頁，共五十一頁。第二節(jié) 原核生物轉(zhuǎn)錄的過程 RNA的轉(zhuǎn)錄包括promotion，elongation，termination 三過程；從promoter到terminator稱為transcriptional unit；原核生物中的轉(zhuǎn)錄單位多為 polycistron ；轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)記為

3、+1，其上游記為負(fù)值，下游記為正值。+1 -10 +10upstreamstart pointdownstream第七頁，共五十一頁。一、轉(zhuǎn)錄的起始 關(guān)鍵：全酶能以很高的親和性結(jié)合在啟動(dòng)子promoter ；啟動(dòng)子：RNA聚合酶識(shí)別、結(jié)合并起始轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列。第八頁，共五十一頁。轉(zhuǎn)錄的起始核心酶在因子幫助下特異性結(jié)合到DNA上；RNA pol與啟動(dòng)子-35 box 結(jié)合，形成封閉型起始復(fù)合物；酶滑動(dòng)到-10 box，轉(zhuǎn)變成為開放型起始復(fù)合物，啟動(dòng)子活化，雙鏈解開，模板鏈暴露，插入最初的2個(gè)核苷酸；酶繼續(xù)加上開頭的幾個(gè)NTP，形成三元起始復(fù)合物，在RNA鏈合成了89個(gè)堿基后，因子解離，轉(zhuǎn)錄

4、開始。 第九頁，共五十一頁。Model of the interaction between E. coil RNA polymerase holoenzyme and a promoterDNAIncorporating the first few Nt第十頁，共五十一頁。二、原核生物轉(zhuǎn)錄的延伸 RNA pol沿著模板鏈移動(dòng)，RNA鏈不斷延伸，并保持三元復(fù)合物的結(jié)構(gòu)；轉(zhuǎn)錄泡中的DNA螺旋前開、后合，RNA延長，不斷脫離DNA；RNA鏈的延伸速度不是恒定的，在模板富含GC的區(qū)域，轉(zhuǎn)錄就會(huì)減慢/停頓。 第十一頁，共五十一頁。17bp螺旋解開長度12bpDNA-RNA復(fù)合體長度第十二頁，共五十一頁

5、。影響RNA延伸速度的因素： RNA pol； 暫停信號(hào)：導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄速度突然出現(xiàn)變化的特殊序列。GC富集區(qū)：產(chǎn)物RNA不易釋放；IR：產(chǎn)物形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，妨礙上游的模板恢復(fù)雙鏈。 其他配基：ppNpp、NusA蛋白。第十三頁，共五十一頁。NusA protein ： 69 Kd, acid protein RNApol-attaching factor Impel RNApol. pausing in terminator for 1-15 and waiting for Rho factor to stop transcription of RNA After initiation substi

6、tuting NusA + core E antitermination N protein utilization substance第十四頁，共五十一頁。第十五頁，共五十一頁。三、原核生物轉(zhuǎn)錄的終止 轉(zhuǎn)錄的終止依賴于RNA產(chǎn)物的特定序列；原核和某些真核生物的終止子要求轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA 3端具有發(fā)夾的二級(jí)結(jié)構(gòu)，莖部富有GC序列；終止子的分類： 根據(jù)終止反應(yīng)是否需要蛋白第十六頁，共五十一頁。1、不依賴于因子的終止子（強(qiáng)終止子）結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：RNA具有一個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)（富含GC）和隨后polyU片段。 作用機(jī)制：RNA pol + 發(fā)夾結(jié)構(gòu) 轉(zhuǎn)錄暫停 后隨雜合分子不穩(wěn)定的poly(U-dA) RNA容易從

7、模板上脫落RNA-DNA-RNA pol 解聚 轉(zhuǎn)錄終止第十七頁，共五十一頁。第十八頁，共五十一頁。2、依賴于因子的終止子（弱終止子） 因子：55kD，六聚體。能夠利用水解ATP釋放的能量使RNA從三元復(fù)合物中釋放出來；結(jié)構(gòu)：仍然具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)，但GC堿基對(duì)含量較少，下游也缺乏polyU結(jié)構(gòu)。 第十九頁，共五十一頁。第二十頁，共五十一頁。第三節(jié) 原核生物轉(zhuǎn)錄的調(diào)控基因表達(dá)的調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平；轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控是最為經(jīng)濟(jì)、靈活，又是最為重要、復(fù)雜的調(diào)控； 確定需要轉(zhuǎn)錄基因的起始位點(diǎn)； 精細(xì)調(diào)節(jié)基因表達(dá)的水平； cis factor 與 trans factor 嚴(yán)格又靈活的互作； 保證RNA

8、pol的連續(xù)轉(zhuǎn)錄，準(zhǔn)確終止。第二十一頁，共五十一頁。一、原核轉(zhuǎn)錄調(diào)控的相關(guān)概念 （一）誘導(dǎo)和阻遏：誘導(dǎo)：酶的合成取決于特定物質(zhì)（常為substrate）的存在。如培養(yǎng)基中乳糖的存在促進(jìn)了E.coli的半乳糖苷酶的合成；阻遏：當(dāng)培養(yǎng)基中某種物質(zhì)（常為product）含量較高，細(xì)胞就關(guān)閉合成這種物質(zhì)的能力。如培養(yǎng)基中Trp的存在抑制了E.coli Trp的合成；第二十二頁，共五十一頁。（二）調(diào)控的效應(yīng)物調(diào)節(jié)蛋白 + 小分子物質(zhì) 原核操縱子的誘導(dǎo)/阻遏。這些小分子是基因表達(dá)的調(diào)節(jié)物質(zhì)-效應(yīng)物。誘導(dǎo)物（inducer）：與調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合，使其從DNA分子上脫落下來，RNA pol開始轉(zhuǎn)錄。 輔阻遏物（c

9、o-repressor）：與調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合，可以提高調(diào)節(jié)蛋白與操縱基因的親和性，進(jìn)而關(guān)閉結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄。第二十三頁，共五十一頁。（三）正調(diào)控和負(fù)調(diào)控 正調(diào)控：調(diào)節(jié)蛋白與操縱子結(jié)合后促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的進(jìn)行。 負(fù)調(diào)控：調(diào)節(jié)蛋白與操縱子結(jié)合后抑制轉(zhuǎn)錄的進(jìn)行。正、負(fù)調(diào)控都存在著誘導(dǎo)和阻遏。第二十四頁，共五十一頁。二、操縱子理論（operon concept）定義：原核生物基因表達(dá)和調(diào)控的單元。包括： 結(jié)構(gòu)基因：編碼控制某一代謝途徑的相關(guān)的酶； 調(diào)控元件：是調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列，包括啟動(dòng)子和操縱基因； 調(diào)節(jié)基因：其產(chǎn)物（調(diào)節(jié)蛋白）能夠識(shí)別并結(jié)合操縱基因，決定結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄與否。 主要見于原核生物的轉(zhuǎn)錄

10、調(diào)控，如乳糖操縱子、阿拉伯糖操縱子、組氨酸操縱子、色氨酸操縱子等第二十五頁，共五十一頁。色氨酸操縱子色氨酸操縱子(Trp operon)是一種重要的操縱子，是聯(lián)合使用或轉(zhuǎn)錄的一組基因，也是用來編碼生成色氨酸的元件之一。色氨酸操縱子是在許多細(xì)菌存在，但首次在大腸桿菌中得到表征。當(dāng)在環(huán)境中存在足量的色氨酸，它將不被使用。第二十六頁，共五十一頁。1.大腸桿菌色氨酸操縱子結(jié)構(gòu)較簡單，也是研究得最清楚的操縱子，結(jié)構(gòu)基因依次排列為trpEDC2BA，其中trpGD 和trpCF基因融合。2.枯草桿菌色氨酸操縱子的結(jié)構(gòu)有所不同，7 個(gè)結(jié)構(gòu)基因中的6 個(gè)依次排列為trpEDCFBA，存在于含有12個(gè)結(jié)構(gòu)基因的

11、芳香族氨基酸超操縱子（a ro operon），第7 個(gè)結(jié)構(gòu)基因，trpG存在于葉酸合成操縱子中，該酶參與Trp 和葉酸的合成。有2個(gè)啟動(dòng)子參與調(diào)控，一個(gè)位于aro operon的起始位置，另一個(gè)則位于trpE 上游約200 bp處。第二十七頁，共五十一頁。RPOLaEDCB A調(diào)節(jié)基因前導(dǎo)區(qū)弱化子間隔區(qū)結(jié)構(gòu)基因間隔區(qū)調(diào)節(jié)作用601621560159311961350804第二十八頁，共五十一頁。Trp的調(diào)控作用途徑 Trp合成途徑較漫長，消耗大量能量和前體物，受到嚴(yán)格調(diào)控，其中色氨酸操縱子發(fā)揮著關(guān)鍵作用。調(diào)控作用主要有三種方式：阻遏作用、弱化作用以及終產(chǎn)物Trp 對(duì)合成酶的反饋抑制作用。阻遏

12、作用1.trp操縱子轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)控是通過阻遏蛋白實(shí)現(xiàn)的。產(chǎn)生阻遏蛋白的基因是trpR，該基因距trp operon基因簇很遠(yuǎn)。它結(jié)合于trp 操縱基因特異序列，阻止轉(zhuǎn)錄起始。在有高濃度Trp存在時(shí)，阻遏蛋白- 色氨酸復(fù)合物形成一個(gè)同源二聚體，并且與色氨酸操縱子緊密結(jié)合，因此可以阻止轉(zhuǎn)錄。當(dāng)Trp 水平低時(shí)，阻遏蛋白以一種非活性形式存在，不能結(jié)合DNA。在這樣的條件下，trp操縱子被RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄，同時(shí)Trp 生物合成途徑被激活。第二十九頁，共五十一頁。RPOLaEDCB A高色氨酸時(shí) 低色氨酸時(shí) AUG前導(dǎo)肽鄰氨基苯甲酸合酶鄰氨基苯甲酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶吲哚甘油磷酸合酶色氨酸合酶和亞基mRNAm

13、RNA第三十頁，共五十一頁。弱化作用 trp操縱子轉(zhuǎn)錄終止的調(diào)控是通過弱化作用（attenuation）實(shí)現(xiàn)的?？莶輻U菌色氨酸操縱子表達(dá)主要受到色氨酸激活RNA結(jié)合蛋白(Trp -activated RNA - binding p rotein,TRAP）的調(diào)節(jié)。該蛋白與色氨酸結(jié)合被激活后，可與trpE上游轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物結(jié)合，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄終止。當(dāng)色氨酸濃度較低時(shí)，TRAP失活，轉(zhuǎn)錄可以繼續(xù)，結(jié)構(gòu)基因得以表達(dá)。第三十一頁，共五十一頁。反饋抑制作用由于基因表達(dá)必然消耗一定的能源和前體物，相對(duì)于阻遏和弱化作用，反饋抑制作用更為經(jīng)濟(jì)和高效。終產(chǎn)物Trp對(duì)催化分支途徑幾步反應(yīng)的酶具有反饋抑制作用，其50%抑制濃度

14、分別為：鄰氨基苯甲酸合酶，0. 0015 mmolL - 1 ；鄰氨基苯甲酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，0. 15 mmolL - 1 ;色氨酸合成酶,7. 7mmolL - 1。對(duì)于普通野生菌株，鄰氨基苯甲酸合酶對(duì)Trp合成起到關(guān)鍵調(diào)控作用，常被稱為瓶頸酶；但對(duì)高產(chǎn)Trp工程菌而言，上述任何一種酶的反饋抑制都會(huì)直接影響Trp產(chǎn)量。第三十二頁，共五十一頁。The Bacillus subtilis TRAP Protein Can Induce Transcription Termination in the Leader Region of the Tryptophan Biosynthetic (tr

15、p) Operon Independent of the trp Attenuator RNA2014第三十三頁，共五十一頁。1. In Bacillus subtilis, transcription of the tryptophan biosynthetic operon is regulated by an attenuation mechanism. 2. When intracellular tryptophan levels are high, the TRAP( trp RNA-binding attenuation protein ) protein binds to the

16、 5 leader region of the nascent trp mRNA and induces transcription termination. 3. In limiting tryptophan, TRAP does not bind and the operon is transcribed. Two competing RNA secondary structures termed the antiterminator and terminator (attenuator) can form in the leader region RNA. Research Backgr

17、ound第三十四頁，共五十一頁。4. In prior attenuation models, the only role of TRAP binding was to alter the RNA secondary structure to allow formation of the attenuator, which has been thought function as an intrinsic transcription terminator. 5. However,recent studies have shown that the attenuator is not an ef

18、fective intrinsic terminator.6.From these studies it was not clear whether TRAP functions independently or requires the presence of the attenuator RNA structure.第三十五頁，共五十一頁。Figure 1. Model of transcription attenuation of the B. subtilis trp operon.第三十六頁，共五十一頁。 Research Purposes1. To examine the role

19、 of the attenuator RNA in TRAP-mediated transcription termination, to examine whether TRAP functions independently or requires the presence of the attenuator RNA structure.第三十七頁，共五十一頁。Material and Methods1.Bacterial strains and transformationsE. coli K802 was used as a host for plasmid construction

20、and propagation. B. subtilis BG2087 (argC4) and BG4233 (argC4 DmtrB) were used as hosts for transformation and integration of gene fusions. BG4233 contains a deletion in mtrB (from codons 762), which encodes TRAP . 第三十八頁，共五十一頁。 Main content1.TRAP induces efficient transcription termination within th

21、e trp leader region in vivo when the attenuator is mutated.2.TRAP induces efficient transcription termination in vivo within the trp leader region in which the attenuator segment is deleted.3.Mapping the location of TRAP-mediated transcription termination within the mutant trp leader regions.4.TRAP

22、does not cause efficient transcription termination within the mutant trp leader regions in vitro.5.NusA and the timing of TRAP binding to the nascent RNA are important in TRAP-mediated transcription termination.第三十九頁，共五十一頁。Results1.TRAP induces efficient transcription termination within the trp lead

23、er region in vivo when the attenuator is mutated.A. Diagram depicting the WT and mutant trp attenuators with altered bases in the stem-loop structure or U-stretch. 第四十頁，共五十一頁。B. Schematic representation of the transcriptional reporter fusions with lacZ that were used to examine TRAP-mediated regulat

24、ion of transcription termination in vivo. 第四十一頁，共五十一頁。第四十二頁，共五十一頁。 The results in Table 1 show that TRAP is able to induce transcription termination in the trp leader region despite significant alterations to the stem-loop or to the U-rich tract of the attenuator. But the location where termination

25、occurs in trp leader regions containing altered attenuators will be addressed below.第四十三頁，共五十一頁。2. TRAP induces efficient transcription termination in vivowithin the trp leader region in which the attenuatorsegment is deleted.Figure 3. Diagram depicting deletion mutations in the stem-loop and U-stre

26、tch of the trp attenuator. stem-loop of the trpattenuator108142第四十四頁，共五十一頁。第四十五頁，共五十一頁。3. Mapping the location of TRAP-mediated transcriptiontermination within the mutant trp leader regions.A (A) Schematic diagram of RNase protection assays (RPA) using 32P-labeled antisense probes and cellular RNA f

27、rom B. subtilis.第四十六頁，共五十一頁。(B) RNase protection assays to determine location of transcription termination in trp leader regions containing mutant attenuators in excess tryptophan.第四十七頁，共五十一頁。 Together these results demonstrate that transcripts from the trpE-lacZ fusion containing the U-stretch (US)

28、 or the Disrupted stem (DS) mutant attenuator terminate at approximately the same location as transcripts that terminate at the WT attenuator.第四十八頁，共五十一頁。4. TRAP does not cause efficient transcription termination within the mutant trp leader regions in vitro. (A) Diagram of DNA templates used for in vitro transc