腦寧康顆粒對腦缺血預適應大鼠HSP70表達影響的實驗研究

1、腦寧康顆粒對腦缺血預適應大鼠HSP70表達影響的實驗研究【摘要】目的觀察中藥腦寧康(NNK)顆粒對經腦缺血預適應(IP)處理后大鼠HSP70表達的影響。方法根據Pulsinelli四管法及Liu法分別制作大鼠IP及腦缺血再灌注(IR)模型，應用免疫組化SP法作HSP70染色，比擬NNK顆粒對IP和IR兩種模型大鼠HSP70表達的影響，并以阿斯匹林作對照。結果NNK在兩模型中均可使HSP70表達明顯增強(P0.050.01),且效應顯著高于阿斯匹林(P0.05)，但兩模型之間比擬無顯著性差異。且NNK可以延緩HSP70表達強度的減弱。結論NNK顆粒通過增強IP和缺血狀態(tài)中HSP70表達，扮演了強

2、化IP及藥物預適應角色，旨在增加腦神經細胞對缺血、缺氧的耐受力，并通過對HSP70的干擾，獲得穩(wěn)定神經細胞構造，維護其正常功能的藥理效應。【關鍵詞】腦寧康顆粒；缺血預適應；腦；HSP70Abstrat：bjetiveTinvestigatetheeffetfNaningkangpartilentheexpressinfthe70KDaheatshkprtEin(HSP70)fllingtheratsisheiprenditin.ethdsTheratsIPandisheireperfusin(IR)delsereadebyethdsfPulsinellifurtubesandLiurespet

3、ively.TheexpressinfHSP70intratdelsinludingIPandIRereparedbyNNKpartileapplyingSPiunhistheistryethd.ResultsNNKpartileuldinreasetheHSP70expressinfIPandinthestatefisheiaandplaytherlenstrngingisheiprenditinfIPandediine.TheeffetfNNKpartilesuggestsinreasingthetleranefentralnerveellsfaingtisheiaandhypxia.nl

4、usinNNKpartilealsanstabilizethestruturefneurnthrughinterfereithHSP70expressin,andthenitdenstratethepharalgieffetfkeepingtheneurnnralfuntins.Keyrds：NNKpartile;Isheiprenditining;Brain;HSP70近年來，腦缺血預適應(isheiprenditining,IP)過程中產生的機體重要保護因子熱休克蛋白Heatshkprtein,HSP已引起廣泛關注。對整體和離體經應激作用后的細胞或組織的研究說明1，當細胞受到損傷時，均伴隨

5、HSP含量增加。因此，普遍認為HSP的功能主要是在于穩(wěn)定細胞的構造，從而維護細胞的正常生理功能。在腦缺血損傷領域的研究顯示，HSP具有保護腦細胞，增加腦細胞對缺氧的耐受性，明顯降低神經元對谷氨酸毒性作用的敏感性2，從而抵抗神經元進一步致死性損傷的作用。本研究擬觀察HSP70在IP和腦缺血再灌注(isheireperfusin,IR)中的表達及腦寧康(NNK)對其的影響?，F報道如下。1材料與儀器1.1儀器多功能顯微鏡(LYPUS-269865,JAPAN)，電鏡JE-1200EX,JAPAN，醫(yī)用低溫冷凍冰箱SANY,JAPAN，電子蠕動泵LDB-。1.2試劑與藥品鼠抗HSP70單克隆抗體Nea

6、rkerrpratin,USA，鏈卵白素生物素結合辣根過氧化酶，1300zyed,USA)，染色試劑盒Labvisinrpratin,USA。NNK顆粒由山東中醫(yī)藥大學附屬制劑廠消費，生藥含量為5g/g；腸溶阿斯匹林(ASP)為沈陽克達藥廠消費，批號970208。1.3動物雄性istar大鼠48只，平均體質量(30030)g，由山東醫(yī)科大學實驗動物中心提供。2方法2.1模型制備與取材2.2分組istar鼠48只，用隨機數字表法將動物隨機分為模型組(DEL)、假手術組(F)、ASP組和NNK組,每組均按IP方法和IR方法制模,共8組,每組6只。2.3模型制備2.3.1IP模型制備IP模型根據Pu

7、lsinelli四管法及Liu法3制備。戊巴比妥鈉50g/kg經腹腔注射麻醉，頸部正中線縱行切口，別離暴露第1頸椎，尋找雙側翼小孔，電灼封閉雙側椎動脈。翻轉體位，頸部縱行切口，別離暴露雙側頸總動脈約2，4號手術線牽引。頭部正中切口，頂部鉆孔，埋藏微電極，齒科水泥固定。動脈夾夾閉兩側頸總動脈，造成全腦缺血，微電極連接八道生理儀觀察腦電圖,驗證缺血效應。缺血3in后,松開動脈夾，恢復供血，縫合皮膚，按成人劑量7倍分別給予NNK組及ASP組相應藥物。24h后，再次夾閉兩側頸總動脈3in。假手術組依上法操作,但不封閉及夾閉椎動脈、頸總動脈。各組飼以標準合成飼料,自然飲水。2.3.2IR模型制備IR模型

8、制備方法同上，但不進展兩次3in缺血預適應處理，服藥時間與IP模型同步。在IP模型第2次短暫缺血后72h，除假手術組外的其余6組均再次夾閉頸總動脈10in，并于缺血再灌注24h后取血備測。2.3.3取材分別于IR后24，72h，戊巴比妥鈉50g/kg麻醉大鼠，開胸暴露心臟，經升主動脈插管后，通過LDG-型電子蠕動泵，快速灌入肝素化生理鹽水2萬u/100l100l，隨后用4多聚甲醛磷酸緩沖液4，pH7.4，200l，灌注1h，立即冰臺取腦，別離皮層組織塊，動存于-70冰箱，用于檢測HSP70表達。另一局部組織塊用0.1的磷酸緩沖液配制的1餓酸溶液pH7.4固定2h，PBS充分洗滌，1餓酸溶液后固

9、定，4，遞增濃度的酒精脫水，EPN812包埋液浸透，包埋。切片用醋酸鈉和枸櫞酸鉛染色，半薄切片定位，超薄切片，TE-1200EX透射電鏡觀察。2.4HSP70檢測方法根據匡式法，組織標本冰凍切片上行30連續(xù)冠狀切片。室溫下，2TritinX-100液中孵育40in，切片浸入鼠抗HSP70單克隆抗體孵育48h，4?？贵w用1血清白蛋白磷酸緩沖液配制，經PBS洗滌10in,浸入生物素結合兔抗鼠IgG，室溫下孵育2h，再經PBS洗滌，切片浸入鏈卵白素-生物素結合辣根過氧化酶孵育2h(室溫)。PBS充分洗滌，加12滴DAB色素于2H126梯度脫水，透明，D-P-X封片備測。2.5統(tǒng)計方法采用SPSS12

10、.0統(tǒng)計分析軟件，實驗數據用s表示，顯著性檢驗用配對t檢驗或方差分析，P0.05為有統(tǒng)計學顯著性。3結果NNK對HSP70表達的影響見表1。由表1可見：皮層構造中，再灌注24h、假手術組未見明顯HSP70陽性信號；IP模型組及再灌注模型組均可見HSP70陽性信號，但前者陽性細胞數量及染色深度明顯強于后者P0.05，提示經IP處理后，HSP70表達明顯增加。以NNK及阿斯匹林干擾后發(fā)現，NNK在兩模型組中均可使HSP70表達明顯增強P0.050.01，且效應顯著高于阿斯匹林P0.05，提示NNK能積極干擾HSP70誘導程序。模型間比擬，NNK對HSP70的影響雖以IP模型稍強，但無明顯差異P0.

11、05。提示NNK既可能在IP過程中有誘導HSP70表達效應，亦可能在缺血再灌注損傷中扮演藥物預適應角色。從不同時期HSP70表達強度分析中發(fā)現與24h時相比擬，72h時相其表達強度明顯減弱P0.05，但NNK可以延緩這一過程P0.05。提示NNK顆粒在誘導和調控HSP70表達方面均有藥理效應。表1NNK顆粒對模型HSP70表達的影響4討論熱休克現象是Ritssa在觀察果蠅幼蟲唾液腺細胞染色體在過熱過程中形態(tài)變化時首先發(fā)現的。后來，Tissieres等發(fā)現，染色體的膨突與細胞中的蛋白質合成有關，故稱其為熱休克蛋白HeatShkprtEin,HSP。生物體受外界環(huán)境的應激作用誘導產生的HSP組分較

12、為復雜，不僅能產生分子量相差很大的HSP，也能產生幾個在分子量上非常接近的HSP。哺乳動物以HSP70家族為主。熱應激、缺血/缺氧、氧自由基等均是重要的誘導因素。近年來，HSP在缺血預適應IP過程中的腦保護作用已經被廣泛認可，之前大多認為其保護大腦的機制是由于HSP70的伴侶作用。而最新報道認為，HSP70也可以調節(jié)炎癥反響，從而顯示出其腦保護的作用。本研究結果說明，分別經IP處理及缺血6in再灌注24h后，兩模型組istar鼠大腦皮層構造中均有HSP70表達，而以前者為強。NNK顆粒干擾后，兩組HSP70表達明顯增強，提示NNK既有可能誘導HSP70表達效應，同時也可能在缺血再灌注損傷中發(fā)揮

13、藥物預適應作用。不同時相HSP70表達強度分析顯示，缺血72hHSP70表達強度明顯弱于24h時相，而NNK可使72h時相HSP70減弱幅度變小，提示該藥在調控HSP70表達方面有藥理效應。由于NNK干擾了IP過程中HSP70的表達，使得在缺血狀態(tài)中HSP70對皮層神經細胞的保護作用增強，因此獲得了較優(yōu)的治療效應。綜上所述，NNK不管在IP狀態(tài)中抑制或缺血再灌注狀態(tài)中均能使HSP70表達增強，扮演了強化IP及藥物預適應角色，旨在增加腦神經細胞對缺血、缺氧的耐受力，并通過對HSP70的干擾，獲得穩(wěn)定神經細胞構造，維護其正常功能的藥理效應?！緟⒖嘉墨I】1任惠民,周兆年.穩(wěn)定細胞構造的分子根底:熱休克蛋白J.生理科學進展，199